分解纖維素的微生物分離

關(guān)于分解纖維素的微生物分離第一頁，共三十四頁，2022年，8月28日㈠纖維素與纖維素酶1.纖維素

纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識

植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。第二頁，共三十四頁，2022年，8月28日土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用。第三頁，共三十四頁，2022年，8月28日纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸，其中40%-60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會大量積累。在草食性動物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。人類可應(yīng)用分解纖維素的微生物將秸稈等廢棄物轉(zhuǎn)變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。第四頁，共三十四頁，2022年，8月28日2.纖維素酶

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素第五頁，共三十四頁，2022年，8月28日①取二支20mL的試管實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗②各加入一張濾紙條③各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸－醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲乙④在乙試管中加入1mL纖維素酶⑤兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管的濾紙條消失

討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？第六頁，共三十四頁，2022年，8月28日提示：本實驗的自變量是纖維素酶的有無，自變量的操縱方法是：在一支試管中添加適量（1mL）的纖維素酶溶液，在另一支試管不添加纖維素酶，但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的pH。實驗分析：P27的小實驗是如何構(gòu)成對照的？第七頁，共三十四頁，2022年，8月28日剛果紅染色法

剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。

（二）纖維素分解菌的篩選

當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。第八頁，共三十四頁，2022年，8月28日第九頁，共三十四頁，2022年，8月28日二、實驗設(shè)計

請你根據(jù)實驗流程圖和提供的三個資料以及“操作提示”，在思考有關(guān)問題的基礎(chǔ)上，設(shè)計出一個詳細的實驗方案。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布在鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上篩選產(chǎn)生透明圈的菌落第十頁，共三十四頁，2022年，8月28日①分布環(huán)境1、土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境中操作步驟生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。②原因第十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日③實例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。④討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。第十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日2、選擇培養(yǎng)

增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。

①目的：②制備選擇培養(yǎng)基：③操作：

將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。第十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基成分分析培養(yǎng)基組成提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)纖維素粉5g碳源（能源）NaNO31g氮源、無機鹽KCl0.5gNa2HPO4·7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5g無機鹽酵母膏0.5g生長因子、碳源、氮源水解酵素0.5g氮素、生長因子溶解后，蒸餾水定容至1000mL水第十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或者將纖維素改為葡萄糖。A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C、你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用第十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。第十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日

在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？第十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日比較項目分解尿素的細菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基原理培養(yǎng)基類型目的鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法將細菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上將細菌涂布在只有纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株選擇培養(yǎng)第十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日思考：本實驗的流程與課題2中的實驗流程有哪些異同？

本實驗流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。第十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋101～107倍。3.梯度稀釋101102103104105106第二十頁，共三十四頁，2022年，8月28日4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（1）制備鑒別培養(yǎng)基:（2）涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)。第二十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長因子KH2PO40.25g無機鹽土豆汁100mL碳源、生長因子瓊脂15g凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉)第二十二頁，共三十四頁，2022年，8月28日方法一：先

，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)。方法二：在

時就加入剛果紅。培養(yǎng)微生物倒平板5.剛果紅染色法

挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。第二十三頁，共三十四頁，2022年，8月28日這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足？染色法優(yōu)點缺點方法一方法二顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便不存在菌落混雜問題1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。第二十四頁，共三十四頁，2022年，8月28日比較項目分解尿素的細菌纖維素分解菌選擇培養(yǎng)原理培養(yǎng)基類型目的鑒定培養(yǎng)基原理現(xiàn)象方法在細菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，pH升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會變紅剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法剛果紅染色法第二十五頁，共三十四頁，2022年，8月28日方法一中NaCl溶液的作用？思考：

漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當然分解纖維素的能就強！第二十六頁，共三十四頁，2022年，8月28日

在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C－370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。6、純化培養(yǎng)第二十七頁，共三十四頁，2022年，8月28日四、結(jié)果分析與評價

1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落

對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

2.分離的結(jié)果是否一致

由于在土壤中細菌的數(shù)量遠遠高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。第二十八頁，共三十四頁，2022年，8月28日

為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行_____________實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有______發(fā)酵和______發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的________含量進行定量測定。發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

液體

固體

葡萄糖

五、課題延伸第二十九頁，共三十四頁，2022年，8月28日分解纖維素的微生物的分離纖維素酶種類、作用、催化活力剛果紅染色篩選原理實驗設(shè)計土壤取樣選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)純化培養(yǎng)前置染色法后置染色法富含纖維素土壤增大分解菌含量染色鑒別分離出分解菌課堂總結(jié)第三十頁，共三十四頁，2022年，8月28日

采用新鮮牛肉經(jīng)剔除脂肪、消化、過濾、濃縮得到的一種棕黃色至棕褐色膏狀物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黃色。

牛肉膏當中含有肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)。廣泛應(yīng)用于生物制藥發(fā)酵及各種培養(yǎng)基的制備。

在當中它起的主要作用是補充蛋白胨以及其它氮源的營養(yǎng)不足。一般的用量為0.3%～0.5%。1、牛肉膏第三十一頁，共三十四頁，2022年，8月28日

是微生物培養(yǎng)基的主要基礎(chǔ)成分，蛋白胨是由蛋白質(zhì)經(jīng)酶、酸、堿水解而獲得的一種胨、肽、氨基酸組成的水溶性混合物。主要作用提供氮源,除此處，還可以提供C源和生長因子。其來源由：動物組織蛋白、植物組織蛋白、微生物蛋白質(zhì)。2、蛋白胨第三十二頁，共三十四頁，20