大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取 (堿法)課件

實(shí)驗(yàn)

一

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取(堿法)背景知識(shí)質(zhì)粒是染色體外的DNA分子，大小可為1kb到200kb。大多數(shù)來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合環(huán)狀的分子，以超螺旋形式存在。它是細(xì)菌內(nèi)的共生型遺傳因子。其復(fù)制和遺傳獨(dú)立于細(xì)菌染色體，但復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主編碼的蛋白和酶。質(zhì)粒特點(diǎn)：質(zhì)粒能在細(xì)菌中垂直遺傳并且賦予宿主細(xì)胞一些表型，是比病毒更簡(jiǎn)單的原始生命。質(zhì)粒通過細(xì)菌的結(jié)合作用，從雄性體轉(zhuǎn)移到雌性體，是細(xì)菌有性繁殖的性因子.１９５２年由Lederburg正式命名為質(zhì)粒。質(zhì)粒類型：按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒和嚴(yán)緊型質(zhì)粒質(zhì)粒的應(yīng)用大多數(shù)基因工程使用松弛型質(zhì)粒。嚴(yán)緊型質(zhì)粒用來表達(dá)一些可使宿主細(xì)胞受毒害致死的基因。質(zhì)粒的特點(diǎn)使質(zhì)粒成為攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的重要媒介物，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解堿法提取質(zhì)粒的原理；2.掌握堿法提取質(zhì)粒的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理

使蛋白質(zhì)或脂類等菌體成分變性基因組DNA產(chǎn)生缺刻，變成線狀，并解離成單鏈（變性）由于質(zhì)粒DNA較小，仍為環(huán)狀變性區(qū)雖大，但不分離

利用強(qiáng)堿（或加熱）及表面活性劑(SDS)裂解菌體中和或恢復(fù)至室溫變性的質(zhì)粒DNA按原互補(bǔ)配對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)性基因組DNA隨機(jī)復(fù)性，與蛋白質(zhì)等菌體成分結(jié)合在一起離心分離質(zhì)粒DNA存在于上清中，回收苯酚/氯仿/異戊醇抽提，乙醇沉淀純化二、實(shí)驗(yàn)原理

堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們的。在堿性pH，DNA變性，當(dāng)恢復(fù)中性并在高鹽離子濃度時(shí)，絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中；而線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，相互交聯(lián)纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上與蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。離心后獲得含有大量質(zhì)粒的上清液，利用親水性有機(jī)溶劑（乙醇、異丙醇、PEG8000）使質(zhì)粒DNA脫水，離心后收集。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。由于操作原因提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：超螺旋、開環(huán)和線狀平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）

作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機(jī)相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機(jī)相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）

注：用時(shí)取下層液，酚腐蝕性強(qiáng)，可引起灼傷。無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑

四、操作步驟6、上清液（700μl左右）移入干凈EP管中,加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1),振蕩混勻,4℃下12000g離心5min。7、將水相（上清）（500μl左右）移入干凈EP管中,加入2倍體積的無水乙醇,振蕩混勻后置于-20℃冰箱中15分鐘，然后4℃下12000g離心10分鐘。8、棄上清,將管口敞開倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次。9、吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。10、將沉淀溶于20μlTE緩沖液或者滅菌水(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，儲(chǔ)于-20℃冰箱中。

五、注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）五、注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解菌體量適當(dāng)。培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。變性的時(shí)間不要過長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷。復(fù)性時(shí)間也不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染。對(duì)于細(xì)胞壁較厚的菌（如酵母菌）質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁。五、注意事項(xiàng)——核酸分離、純化采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法五、注意事項(xiàng)——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解（TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2