淺析mOX40Ig的表達及其生物學(xué)活性的初步研究

淺析mOX40Ig的表達及其生物學(xué)活性的初步研究2結(jié)果2.1higg1fc段基因的擴增及重組載體pcdna3.1higg1fc的構(gòu)建rtpcr法從正常人外周血單個核細胞中擴增出約650bp的higg1fc段基因〔圖1〕,重組載體經(jīng)pcr、限制性酶譜分析后〔圖2〕進行dna測序。結(jié)果顯示,所獲得的higg1fc段基因序列與genbank中報道的序列完全一致。圖1rtpcr法擴增人igg1fc段基因電泳檢測〔略〕fig1theagaroseelectrophoresisofrtpcrproductofhumanigg1fcgene1:dnamarker;2:cdnafragmentencodingthehumanigg1fc;3:βactin.圖2重組載體pcdna3.1higg1fc的酶切鑒定〔略〕fig2resultsofrecombinantpcdna3.1higg1fcdigestedbyecoriplusxhoi1:dnamarker;2:pcdna3.1higg1fc/ecori+xhoi;3:pcdna3.1;4:pcdna3.1higg1fc.2.2小鼠ox40胞外段的擴增及真核表達載體pcdna3.1mox40ig的構(gòu)建pcr法擴增獲得的小鼠ox40胞外段基因約690bp左右〔圖3〕,重組真核表達載體pcdna3.1mox40ig經(jīng)質(zhì)粒pcr〔圖4〕、限制性酶譜分析〔圖5〕后進行dna測序。結(jié)果顯示,所獲得的小鼠ox40胞外段及higg1fc段基因序列均與genbank中報道的序列完全一致,而且拼接后的小鼠ox40胞外段及higg1fc段基因未發(fā)生移碼突變。圖3pcr擴增小鼠ox40胞外段基因電泳檢測〔略〕fig3amplificationofmouseox40extracellulargenebypcr1:dnamarker;2:mouseox40extracellulargene.圖4重組載體pcdna3.1mox40ig的pcr鑒定結(jié)果〔略〕fig4pcranalysisofrecombinantpcdna3.1mox40ig1:thehumanigg1fcgene;2:dnamarker;3:mouseox40extracellulargene;4:mox40＋higg1fc.圖5重組載體pcdna3.1mox40ig的酶切鑒定〔略〕fig5restrictiveenzymedigestionanalysisofrecombinantpcdna3.1mox40ig1:λdna/ecori+hindiiimarker;2:pcdna3.1mox40ig;3:pcdna3.1mox40ig/ecori+xhoi;4:pcdna3.1mox40ig/bamhi+xhoi;5:pcdna3.1mox40ig/hindiii+xhoi;6:dnamarker.2.3mox40ig的表達、純化及鑒定2.3.1rtpcr檢測將鑒定正確的pcdna3.1mox40ig以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染cho細胞,經(jīng)g418挑選獲得穩(wěn)定表達mox40ig的細胞株。rtpcr鑒定表示清楚,從cho/mox40ig細胞中能擴增出小鼠ox40胞外段〔約650bp〕、higg1fc〔約690bp〕及mox40ig〔約1330bp〕特異性條帶;而轉(zhuǎn)染pcdna3.1的細胞樣品未擴增出特異性條帶〔圖6〕。圖6穩(wěn)定表達mox40ig的cho的rtpcr鑒定〔略〕fig6identificationofmox40igstablyexpressedchobyrtpcr1:dnamarker;2-4:thechocellstransfectedwithpcdna3.1mox40ig;5:thechocellstransfectedwithpcdna.2轉(zhuǎn)染細胞上清的雙抗體夾心elisa法檢測結(jié)果為了檢測上清中能否有mox40ig融合蛋白的表達,我們建立了一種針對mox40ig融合蛋白中fc段的夾心elisa檢測法。陰性對照為轉(zhuǎn)染有pcdna3.1空載體的細胞培養(yǎng)上清,陽性對照為純化的人igg。結(jié)果顯示:陽性轉(zhuǎn)染細胞上清與陽性對照的a490值接近,其與陰性對照組及空白調(diào)零組〔pbst〕的差別均有統(tǒng)計學(xué)意義〔p0.01〕。我們以為據(jù)此可初步斷定上清中有目的蛋白—可溶性mox40ig融合蛋白的表達。取1次采集的上清原液作一系列倍比稀釋后夾心elisa檢測結(jié)果如此圖7所示。圖7夾心elisa檢測mox40higg1fc的表達〔略〕fig7confirmationofthefusionproteinmox40igexpressionbysandwichelisaassay2.3.3mox40ig融合蛋白表達的sdspage鑒定收獲pcdna3.1mox40ig轉(zhuǎn)染cho細胞培養(yǎng)上清,經(jīng)蛋白a純化后,取20μl在復(fù)原條件下進行sdspage分析,結(jié)果顯示:在復(fù)原條件下,轉(zhuǎn)染有pcdna3.1mox40ig的細胞上清純化后可見有一mr位于66.2×103～43×103之間的特異性蛋白帶〔圖8〕,mox40ig融合基因編碼434個氨基酸,切除可能的含19個氨基酸的信號肽后,還剩415個氨基酸,mr46.3×103〔單體且未糖基化時〕?？紤]到真核表達經(jīng)過中糖基化對分子量的影響,可以為與估計的mr46.3×103基本相符。2.4mox40ig融合蛋白對b細胞的體外促增殖作用mox40ig融合蛋白能有效促進b細胞增殖,說明我們獲得了有生物學(xué)活性的mox40ig融合蛋白,而且隨著其濃度的增高,促增殖效應(yīng)越明顯,但其作用強度不如抗cd40mab明顯〔p0.05〕,兩者聯(lián)合應(yīng)用的促增殖效應(yīng)較單獨應(yīng)用mox40ig融合蛋白或抗cd40mab均具有統(tǒng)計學(xué)意義〔p0.05,圖9〕。圖8mox40ig融合蛋白的sdspage鑒定〔略〕fig8identificationofrelativemolecularweightofthefusionproteinmox40ig圖9mox40ig對小鼠b細胞的體外促增殖作用〔略〕fig9theinfluenceonbcellproliferationstimulatedwithmox40iginvitro3討論ox40/ox40l是免疫應(yīng)答經(jīng)過中一對主要的協(xié)同刺激分子,它們的互相作用能促進cd4+t細胞的活化、增殖、遷移,延長其壽命,并促進生發(fā)中心的構(gòu)成和dc的分化成熟。ox40〔cd134〕,是tnfr超家族成員之一,為i型跨膜糖蛋白,屬活化后誘導(dǎo)表達,即只表達于活化的t細胞外表,且重要是cd4+t細胞,cd8+t細胞外表有少量表達[5]。表達ox40的t細胞只在炎癥處存在,其陽性t細胞是抗原特異性t細胞,在外周血中不存在,其表達時相較晚且短暫,這些特點成為其治療由t細胞介導(dǎo)的多種本身免疫性疾病及防治移植排擠的有利條件。除此之外,在對免疫耐受影響的研究中發(fā)現(xiàn),很多共刺激分子都能夠阻攔耐受的構(gòu)成,而耐受一旦構(gòu)成,只要ox40能夠打破已建立的外周耐受[6],進而能夠打破腫瘤的免疫耐受,恢復(fù)免疫監(jiān)視。以往研究顯示,ox40/ox40l在機體的免疫應(yīng)答和多種疾病中均起主要作用,而通過對ox40及其配體互相作用的干涉可能是治療多種人類疾病的有效途徑之一[7]。有研究顯示,ox40胞外段與各種igg的fc段融合構(gòu)建的融合蛋白中,與igg1的fc段融合所構(gòu)建的融合蛋白與ox40l結(jié)合的親和力最強[8]。本研究中,我們將ox40胞外段與igg1fc段融合構(gòu)建了pcdna3.1mox40ig真核表達載體,轉(zhuǎn)染cho細胞后,經(jīng)rtpcr、雙抗體夾心elisa及sdspage分析證明我們獲得了mox40ig融合蛋白的分泌性表達。同時,我們對mox40ig融合蛋白的功能進行了初步的體外研究。3htdr摻入試驗表示清楚,分泌表達的mox40ig融合蛋白能夠明顯促進b細胞增殖,若將其與抗cd40mab共同作用于b細胞,其促增殖作用更為明顯。本研究中我們成功地構(gòu)建了pcdna3.1mox40ig真核表達載體,將其轉(zhuǎn)染cho細胞,獲得了可溶性mox40ig融合蛋白的穩(wěn)定表達,并進行了初步的鑒定和生物學(xué)活性檢測,為進一步研究ox40分子在移植耐受的誘導(dǎo)及本身免疫病治療中的作用打下良好的基礎(chǔ)?！疽韵聻閰⒖嘉墨I】[1]huddlestonca,weinbergad,parkerdc.ox40(cd134)engagementdrivesdifferentiationofcd4+tcellstoeffectorcells[j].eurjimmunol,2006,36(5):1093-1103.[2]mendeli,shevachem.activatedtcellsexpresstheox40ligand:requirementsforinductionandcostimulatoryfunction[j].immunology,2006,117(2):196-204.[3]wangyh,itot,wangyh,etal.maintenanceandpolarizationofhumanth2centralmemorytcellsbythymicstromallymphopoietinactivateddendriticcells[j].immunity,2006,24(6):827-838.[4]原江水,馮永堂,王菲,等.小鼠ox40穩(wěn)定表達細胞株的構(gòu)建及其對b細胞促分化作用的研究[j].細胞與分子雜志,2005,21〔6〕:767-771.[5]songa,songj,tangx,erationbetweencd4andcd8tcellsforantitumoractivityisenhancedbyox40signals[j].eurjimmunol,2007,37(5):1224-1232.[6]bansalp,jemberag,groftm.signalingthroughox40(cd134)breaksperipheraltcelltolerance[j].natmed,2001,7(8):907-912.[7]horit.