克霉唑的一體化試驗(yàn)

藥物分析一體化實(shí)驗(yàn)克霉唑的合成、含量測(cè)定和最低抑菌濃度MIC的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握克霉唑的性狀、化學(xué)性質(zhì)和藥理作用。2、掌握格氏反應(yīng)的原理及基本操作。3、進(jìn)一步鞏固重結(jié)晶的原理和實(shí)驗(yàn)方法。4、熟悉高效液相色譜的原理和操作。5、熟悉并掌握抗菌藥物的最小抑菌濃度MIC的檢測(cè)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理克霉唑?yàn)榘咨驘o色結(jié)晶性粉末。溶于無水乙醇、丙酮和氯仿，幾乎不溶于水，純品熔（一）克霉唑的合成克霉唑?yàn)榘咨驘o色結(jié)晶性粉末。溶于無水乙醇、丙酮和氯仿，幾乎不溶于水，純品熔142~145特別是對(duì)真菌的深度感染有較高療效。特別是對(duì)真菌的深度感染有較高療效。克霉唑的合成主要以鄰氯苯甲酸為初始克霉唑的合成主要以鄰氯苯甲酸為初始縮合而制得。格氏反應(yīng)是一個(gè)發(fā)生在金屬表面的非均相反應(yīng)。電子從金屬原子向反應(yīng)基質(zhì)RX-鹵鍵較弱而分解成一個(gè)自由基R﹒和一個(gè)自由基再與鎂反應(yīng)。在克霉唑的合成過自由基再與鎂反應(yīng)。在克霉唑的合成過-（2'-氯苯基）甲醇（縮合物應(yīng)生成克霉唑。反應(yīng)式：

COOH COOCH25CHOH,對(duì)甲苯磺酸2512~15hCl ClOMgBrMgBrCOOCOMgBrMgBrCOOC2H5,碘ClClOHC2H2SO4HOClOHCClClCOHCClClCCl905hClCClNClCClNNCl30℃,3h（二）克霉唑的含量測(cè)定液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成?？嗣惯蛟谧贤夤?60nm下有最佳吸收波長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法外標(biāo)法室溫檢測(cè)。高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。（（1）輸液泵：①流量穩(wěn)定；②流量范圍寬；③輸出壓力高；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。（2）進(jìn)樣器：一般④液缸容積??；⑤密封性能好，耐腐蝕。（2）進(jìn)樣器：一般HPLCHPLC完全裝液法兩種完全裝液法兩種被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測(cè)器時(shí),樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄（4）檢測(cè)器：HPLC的檢測(cè)器分為兩類①通用型檢測(cè)器可連續(xù)測(cè)量色譜柱的流出物的全部特性變化；②專用型檢測(cè)器用以測(cè)量被分離樣品組分某種特性的變柱(固定相)內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測(cè)器時(shí),樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。（三）克霉唑的抗菌實(shí)驗(yàn)P-450P-450霉唑?qū)龠量╊惪拐婢帲邚V譜抗真菌活性，對(duì)白念珠菌則可抑制其自芽孢轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u固醇的生物合成，損傷真菌細(xì)胞膜并改變其通透性，以致重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏;可抑制真固醇的生物合成，損傷真菌細(xì)胞膜并改變其通透性，以致重要的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外漏;可抑制真色菌所致的花斑癬，也可用于治療甲溝炎、須癬和頭癬。冷卻60℃以下，改裝成蒸餾裝置，在向四口瓶中滴加鄰氯苯甲酸乙酯1g-苯2.5g混合色菌所致的花斑癬，也可用于治療甲溝炎、須癬和頭癬。冷卻60℃以下，改裝成蒸餾裝置，在向四口瓶中滴加鄰氯苯甲酸乙酯1g-苯2.5g混合三、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器試劑：乙醇、鄰氯苯甲酸、對(duì)甲苯磺酸、碳酸氫鈉、氯仿、鎂、碘、無水乙醚、溴代苯、稀硫酸、氯化鈣、甲苯、活性炭、石油醚、無水丙酮、霉唑重結(jié)晶產(chǎn)物、克霉唑?qū)φ掌罚?0003、甲醇（色譜）等瓊脂粉、改良馬丁培養(yǎng)基、二甲亞砜、白色念珠菌儀器SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)、DH3600BPL4031號(hào)濾紙、EP四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）克霉唑的含量測(cè)定1、鄰氯苯甲酸乙酯的生成221g0.189g甲基苯磺酸,4.5g250mLCaCl干燥管的回流冷凝將溫度調(diào)至78℃，保持此溫度，然后攪拌回流帶水12h。將溫度調(diào)至78℃，保持此溫度，然后攪拌回流帶水12h。向三口瓶中加入足量的飽和碳酸氫鈉溶液并充分?jǐn)嚢?，然后加入適量的氯仿并攪拌。測(cè)向三口瓶中加入足量的飽和碳酸氫鈉溶液并充分?jǐn)嚢?，然后加入適量的氯仿并攪拌。測(cè)定上層溶液PH應(yīng)大于等于7，下層溶液PH應(yīng)等于7。取下層溶液作為反應(yīng)液，并將反應(yīng)液定上層溶液PH應(yīng)大于等于7，下層溶液PH應(yīng)等于7。取下層溶液作為反應(yīng)液，并將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中進(jìn)行萃取。分取下層溶液旋蒸除盡溶劑，得到液狀產(chǎn)物，產(chǎn)物呈淡黃或淺轉(zhuǎn)移至分液漏斗中進(jìn)行萃取。分取下層溶液旋蒸除盡溶劑，得到液狀產(chǎn)物，產(chǎn)物呈淡黃或淺黃綠色。計(jì)算收率。250mlCaCl干燥管的回流冷凝管22、二苯基-（250mlCaCl干燥管的回流冷凝管2及溫度計(jì)。向四口瓶中加入0.215g0.019g0.7g1.942g0.8g，緩慢攪拌使溶液混合，滴加完畢后升溫至56-701.5h。溶液，同時(shí)蒸出乙醚（在此步時(shí)，蒸乙醚時(shí)的溫度控制在60度以下）待乙醚完全蒸出后，溶液，同時(shí)蒸出乙醚（在此步時(shí)，蒸乙醚時(shí)的溫度控制在60度以下）待乙醚完全蒸出后，升至內(nèi)溫達(dá)77-80℃，繼續(xù)攪拌回流4h，放置10h。攪拌下向反應(yīng)液中加入苯0.7g，再加入升至內(nèi)溫達(dá)77-80℃，繼續(xù)攪拌回流4h，放置10h。攪拌下向反應(yīng)液中加入苯0.7g，再加入冷至5℃以下的8%稀硫酸，冰水浴下攪拌20分鐘左右，酸度不夠可加酸，保持溶液的pH冷至5℃以下的8%稀硫酸，冰水浴下攪拌20分鐘左右，酸度不夠可加酸，保持溶液的pH將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置，分取上層苯溶液，旋蒸盡可能除盡苯。安裝水蒸氣值為1-2。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置，分取上層苯溶液，旋蒸盡可能除盡苯。安裝水蒸氣蒸餾裝置，將旋蒸液加入三口瓶中進(jìn)行蒸餾，蒸餾至餾出液只有少許油狀物時(shí)停止蒸餾，將反應(yīng)物趁熱轉(zhuǎn)移至分液漏斗中進(jìn)行萃取。分取下層溶液進(jìn)行旋蒸，冷凍放置直至呈現(xiàn)淺黃色反應(yīng)物趁熱轉(zhuǎn)移至分液漏斗中進(jìn)行萃取。分取下層溶液進(jìn)行旋蒸，冷凍放置直至呈現(xiàn)淺黃色稠狀（若顏色較深可以進(jìn)行硅膠色譜柱純化處理稠狀（若顏色較深可以進(jìn)行硅膠色譜柱純化處理。計(jì)算收率。稱取1g二苯基-（2'-氯苯基）甲醇粗品，加入三口瓶中，然后加入1g甲苯及0.043g3、二苯基-（稱取1g二苯基-（2'-氯苯基）甲醇粗品，加入三口瓶中，然后加入1g甲苯及0.043g活性碳,加熱使粗品溶解，繼續(xù)升溫回流脫水，待脫水后，趁熱抽濾，濾渣用少量甲苯洗滌，活性碳,加熱使粗品溶解，繼續(xù)升溫回流脫水，待脫水后，趁熱抽濾，濾渣用少量甲苯洗滌，合并洗濾液。合并洗濾液。將洗濾液加入干燥的三口瓶中，溫度調(diào)至將洗濾液加入干燥的三口瓶中，溫度調(diào)至50-60℃，緩慢滴加0.83g氯化亞砜，繼續(xù)緩90242-3計(jì)算收率。4、克霉唑的制備將咪唑加入三口瓶中，用適量無水丙酮溶解。在25~28氯苯基）氯甲烷1g4530℃，待自然降溫至30℃左右，保溫355~57℃回流使2~33/4515（二）克霉唑的含量測(cè)定1、色譜條件色譜柱：4.6×150nm流動(dòng)相：甲醇—水（2g，三乙胺2.5ml,加水至1000ml,冰醋酸調(diào)PH2.5濾過，比例為6535。流速：1.0ml﹒min-1柱溫：25℃檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm進(jìn)樣量：20ul2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制50.24mg100ml10.0ml、15.0ml、20.0ml、25.0ml25ml520ul，記錄不同濃度對(duì)照品溶液的峰面積，以對(duì)照品溶液濃度與其相應(yīng)峰面積作圖求線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。3、樣品含量的測(cè)定精密稱取克霉唑樣品0.0300g,用流動(dòng)相溶解后轉(zhuǎn)移至100ml的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖均。精密稱取克霉唑標(biāo)準(zhǔn)品0.0298g100ml相色譜進(jìn)樣瓶中。按照色譜條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液各進(jìn)樣20ul。分別記錄標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的出峰時(shí)間、峰面積、峰面積百分比（三）克霉唑的抗菌實(shí)驗(yàn)2.85100mL放入滅菌鍋（12115mi121℃高15min4℃保存?zhèn)溆谩?.85g1.4g，加入100m蒸餾水，放入滅菌鍋（12115mi，滅菌完畢后，在50-6025mL/培養(yǎng)基。2.5%的接種量，接種至含10mL改良馬丁培養(yǎng)基的搖菌管中，于28℃，180rpm繼續(xù)振搖培養(yǎng)20~24h將部分過夜培養(yǎng)的菌種涂布于固體培養(yǎng)平板中4℃，可用于一周內(nèi)的菌種培養(yǎng)活化使用?？嗣惯驖舛鹊呐渲疲褐苯佑肈MSO配成濃度為1mg/mL，再配4,2,1/2,1/4~1/512μg/mL其DMSO含量為3.5%。96孔板MIC:將藥物按由高到低濃度自左至右加入962820-24小時(shí)，加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h物濃度的孔作為兩藥物是否具有協(xié)同作用的判斷指標(biāo)，或使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在570nm波長(zhǎng)處的吸光度值，以吸光度值的變化作為判斷指標(biāo)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1、克霉唑合成過程中的產(chǎn)率和總產(chǎn)率計(jì)算克霉唑合成產(chǎn)率步驟產(chǎn)品產(chǎn)率1鄰氯苯甲酸乙酯2二苯基-(2'-氯苯基)甲醇（縮合物）3二苯基-（2'-氯苯基）氯甲烷4克霉唑2、克霉唑標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和含量測(cè)定2、克霉唑標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和含量測(cè)定克霉唑?qū)φ掌返臐舛扰c面積表克霉唑?qū)φ掌返臐舛扰c面積表濃度10-mg/ml 面積mA˙min對(duì)照品11.004對(duì)照品22.008對(duì)照品33.012對(duì)照品44.016對(duì)照品55.020克霉唑含量測(cè)定表濃度mg/ml出峰時(shí)間min