原核表達的詳細步驟

原核表達詳細步驟Parti選擇表達的目的基因一、基因序列得到靶基因DNA(cDNA)序列，有幾種方式尋找正確的讀碼順序：利用生物信息學(xué)在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正確的讀碼。實驗方法，即得到蛋白，進行測序，然后在DNA上找到正確的讀碼。利用mRNA的特征，找到啟動子，編碼區(qū)，終止子。在編碼區(qū)中找到翻譯起始密碼子與終止密碼子(cDNA)。注意事項：區(qū)別ORF和CDS-ORF一般在DNA上的定義，尋找原則是翻譯起始密碼子和終止密碼子；CDS可以是DNA上的定義，也可以是mRNA上的定義，分為completeCDS和partialCDS,是從第一個核酸開始讀，連續(xù)讀下去，completeCDS讀碼是“M、、、、、、、、、大”，partialCDS的讀碼是相應(yīng)的AA在進行試驗設(shè)計時，充分利用生物信息學(xué)的信息后，在進行試驗設(shè)計。二、抗原決定簇的預(yù)測1、原理：蛋白質(zhì)表面部分可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的區(qū)域叫抗原決定簇。一般抗原決定簇是由6-12氨基酸或碳水基團組成，它可以是由連續(xù)序列(蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu))組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成。變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物，用來免疫動物具有更強的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會暴露出來，如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是可以的，如果用來檢測天然蛋白，可能會有假陽性。做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還要看將來該單抗用來干什么。2、選擇原則：、親水性：大部分抗原決定簇是親水性的。、處于結(jié)構(gòu)表面：大部分抗體只與蛋白質(zhì)表面部分結(jié)合。、有彈性：許多已知的抗原決定簇是在自由活動區(qū)域。所以一般來說蛋白質(zhì)的N端及C端是很好的抗原決定簇區(qū)域。3、選定抗原決定簇的步驟：預(yù)測：如軟件預(yù)測DNAstar(Protean)預(yù)測，Dnaman。在線網(wǎng)站預(yù)測(/molbio/hlabind/index.shtmlandhttp://www.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html)選定：接近N、C端；選取在此區(qū)間內(nèi)，(AntigenicIndex)Jameson-wolf抗原決定簇選正分高處；(Hydrophilicityplot)Kyte-Doolittle預(yù)測親水性強的區(qū)域。同時符合以上3點的區(qū)域較好(命名為多肽片斷A)。注：如果設(shè)計的多肽是跨膜蛋白，請盡量回避選擇蛋白的跨膜區(qū)，即頭端信號肽所在的區(qū)域NCBI(BlastP)比對：將多肽片斷A放入blastp進行同源性比對。如果制備某一動物種屬的抗體，該區(qū)必須與該動物的氨基酸序列沒有較高的同源性。注：這一步往往容易漏掉，所以學(xué)會應(yīng)用生物信息學(xué)，可以減少走彎路！?。】乖铣桑孩僭吮磉_：②化學(xué)合成：需要做化學(xué)偶聯(lián)增強多肽穩(wěn)定性。多肽的純度越純越好，一般＞80%就完全可以了。合成5-10mg就可以了。Partll選擇表達系統(tǒng)一、選擇表達載體1、選擇表達載體的原則蛋白質(zhì)大?。簺Q定在胞質(zhì)中表達還是以包涵體的形式表達，是否加標簽或以融合蛋白的形式表達。蛋白需求量：根據(jù)實驗方案確定蛋白需求量，選擇合適的載體。蛋白質(zhì)是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表達(胞質(zhì)蛋白)，無活性的不溶的蛋白(包涵體蛋白)2、原核表達載體通常為質(zhì)粒，典型的表達載體應(yīng)具有以下幾種元件：選擇標志的編碼序列：用于篩選重組子，有抗生素抗性基因、報告基因(GFP等)可控轉(zhuǎn)錄的啟動子：啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調(diào)控序列。啟動子的強弱是對表達量有決定影響的因素之一。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體所用的啟動子必須是原核啟動。原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點上游5?10bp處，有一段由6?8個堿基組成，富含A和T的區(qū)域，稱為Pribnow盒，又名TATA盒或一10區(qū)。來源不同的啟動子，Pribnow盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點上游35bp處，有一段由10bp組成的區(qū)域，稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時大腸桿菌RNA聚合酶識別并結(jié)合啟動子。-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結(jié)合，-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進，形成新生的RNA鏈。原核表達系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動子有Lac(乳糖啟動子)、Trp(色氨酸啟動子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子)、lPL(l噬菌體的左向啟動子)、T7噬菌體啟動子等。轉(zhuǎn)錄終止子：在一個基因的3¢末端或是一個操縱子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉(zhuǎn)錄功能，這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進，RNA的延伸也停止在終止信號上，完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。轉(zhuǎn)錄終止的機制較為復(fù)雜，并且結(jié)論尚不統(tǒng)一。但在構(gòu)建表達載體時，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因表達十擾載體的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點的下游插入一段很強的rrB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。核糖體結(jié)合位點(SD序列)：1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3?10bp處的由3?9bp組成的序列。這段序列富含嘌吟核苷酸，剛好與16SrRNA3¢末端的富含嘧啶的序列互補，是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會影響mRNA與核糖體的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。另外，真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后，才能產(chǎn)生一個完整的蛋白質(zhì)。（5）多克隆位點（MCS）:選擇的酶切位點在靶基因上沒有相應(yīng)的酶切序列，否則在構(gòu)建重組子進行酶切時會把靶基因給切開。在惠贈或交換的質(zhì)粒中確定MCS的正確性，否則會造成錯讀密碼子。（6）復(fù)制子：通常表達載體都會選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴謹方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI（pUC）類的復(fù)制子（復(fù)制起始部位）的拷貝數(shù)高達500以上，是表達載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達量是非線性的正相關(guān)，當然也不是越多越好，超過細胞的承受范圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要2個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就要考慮復(fù)制元（？）是否相容的問題。（7）融合Tag:基因融合是將兩個或多個開放閱讀框按一定順序連接起來，并且正確讀碼。在表達靶蛋白是加上融合標簽的好處，（a保護靶蛋白免受原核宿主蛋白酶的降解；b提供親和純化的配基結(jié)合位點；c改善靶蛋白的溶解性，使其正確折疊；d與已知酶或抗原結(jié)構(gòu)域連接，可以進行標記和分離；e與信號肽連接，可將融合蛋白分泌到特定細胞區(qū)域。）注：選擇融合蛋白表達載體時，融合標簽與靶蛋白的連接處如果有酶切位點，且想除去標簽，則載體的酶切序列在靶蛋白中不能出現(xiàn)。二、選擇表達宿主首先要看靶基因中有沒有細菌不常用的密碼子一一如果有，需要考慮換表達菌株。每種菌株都有自己獨特的設(shè)計，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細菌中存在更穩(wěn)定，表達的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在細菌中的菌株才可用于表達。采用不同調(diào)控機制會使用不同的表達菌株，所以換菌株一定要仔細看過載體的調(diào)控方式再換。以Novagen為例，如果使用BL21（DE3）表達不成功的話可以換Rosetta系列菌株，它能夠由一種氯霉素抗性的、與pET相容的質(zhì)粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達限制。有時不明原因的表達蛋白截短（比預(yù)期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密碼子造成的。另外一種可能是不嚴謹?shù)谋镜妆磉_產(chǎn)物抑制。1.原核表達系統(tǒng)（大腸桿菌）優(yōu)點：①遺傳圖譜明確②容易培養(yǎng)且費用低③對許多外源蛋白耐受能力強④能高水平表達這些蛋白缺點：①蛋白質(zhì)不能進行翻譯后修飾（在真核高爾基復(fù)合體中的糖基化修飾，特點位點的切割等產(chǎn)生具有活性的蛋白）②具有密碼子的偏好（？）真核表達系統(tǒng)優(yōu)點：可以產(chǎn)生修飾的蛋白缺點：①真核表達系統(tǒng)復(fù)雜②費用高注：不同的表達宿主有相應(yīng)的表達載體，二者應(yīng)是最佳表達組合。Partm構(gòu)建重組子一、重組子的構(gòu)建設(shè)計引物：a保證引物序列擴出的靶基因插入到表達載體MCS上，能夠正確讀碼；b引物兩端加入酶切位點；c遵循引物設(shè)計原則（一般性引物自動搜索可采用“PremierPrimer5”軟件，而引物的評價分析則可采用“Oligo6”軟件）。擴增靶基因：（1）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。（2）通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。注：但在PCR過程中，需要減少突變的發(fā)生，可采用高保真酶，盡量減少PCR循環(huán)次數(shù)，增加模板和引物的濃度。尤其注意不要引入終止密碼子。限制性內(nèi)切核酸酶消化載體DNA和目的基因：（1）載體雙酶切后回收：將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。（減少假陽性的重組質(zhì)粒連接，去除切下的小片段多克隆位點）（2）PCR產(chǎn)物雙酶切后回收：限制性消化和膠純化是制備插入片段的常規(guī)方法。一般先用PCR擴增帶酶切位點的目標基因，克隆進T一載體，然后用與消化載體相同的內(nèi)切酶進行消化和膠回收。注：雙酶切后，進行回收純化，可以提高陽性克隆的幾率。連接目的基因和載體二、重組子的驗證將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌（感受肽的制備，轉(zhuǎn)化）鑒定帶有重組質(zhì)?？寺。撼Ｓ梅椒ǖ挠衋-互補、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進行酶切分析、PCR以及雜交篩選。如果亞克隆成功，陽性菌落數(shù)遠大于陰性菌落（甚全全部為重組子）。篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，DNA序列測定。（正確測序）測序結(jié)果出來后，首先，看看載體的多克隆位點和片斷插入的序列，是否有因為酶切連接而意外引入了轉(zhuǎn)錄終止信號，讀碼是否正確，這是最有說服力的鑒定結(jié)果。有時載體幾經(jīng)多個實驗人員的周轉(zhuǎn)，反復(fù)插入片斷，或者是粘端相同的不同酶切片斷之間的連接，會意外在啟動子后面帶入終止位點，特別是用到XbaI之類的酶要小心。然后要對測序結(jié)果進行確定，確定插入的每個堿基都是正確的，沒有意外終止的情況。注：長期保存的重組子在高濃度甘油（19%）中會導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定，即脫質(zhì)粒?？梢詫⑤d體和宿主分別保存。PartW誘導(dǎo)表達一、誘導(dǎo)表達誘導(dǎo)表達類型組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。誘導(dǎo)調(diào)控型表達：表達載體采用誘導(dǎo)型啟動子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達的，也屬于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽(Tag)，表達產(chǎn)物為融合蛋白(有分N端或者C端融合表達)，方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag(如GST)以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包含體，而且表達產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間?？扇苄员磉_：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高(非常股復(fù)雜)。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。誘導(dǎo)表達挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50〃g/ml)中37°C過夜培養(yǎng)。按1：50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37C震蕩培養(yǎng)至OD6OO7O.4-1.0(最好0.6，大約需3h。取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入100mMIPTG至終濃度為0.4mM(T7啟動子)或1mM(T7lac啟動子)，作為實驗組，兩組繼續(xù)37C震蕩培養(yǎng)3h。分別取菌體1ml,離心12000gX30s收獲沉淀，用PBS重懸、洗滌、離心。對細菌沉淀進行處理，做SDS等分析。注意事項：關(guān)于表達不出來的原因有很多a如果測序都是正確的話，設(shè)計一個postiveexpressioncontrol，驗證整個表達系統(tǒng)沒問題。b檢測是否有毒性。涂一個IPTG的板子看菌落生長情況如何。c看看稀有密碼子情況，是不是存在成簇的N端的稀有密碼子。d看看穩(wěn)定性，上swissprot看看在大腸桿菌中的穩(wěn)定時間是多少。e如果表達的是真核蛋白，可能問題更復(fù)雜，可能涉及到伴侶蛋白等問題？f有人會檢測mRNA的穩(wěn)定性。g可以用親和層析等辦法富集你的目的蛋白，然后再跑膠。因為有時你的目的蛋白表達豐度過低，SDS檢測不到。提高外源基因表達水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段，以減輕宿主菌的負荷。IPTG：IPTG濃度0.2-0.5mMIPTG足夠了，不會降低表達量，反而會增加蛋白的可溶性。IPTG濃度過高，易使蛋白表達速度增大，來不及正確折疊而產(chǎn)生不溶性蛋白(包涵體)°T7lac啟動子是嚴謹啟動子，IPTG誘導(dǎo)時可以優(yōu)化最佳濃度(25uM-1mM之間)使目的蛋白達到最佳的活性和溶解性。溫度：一般37C誘導(dǎo)3-4小時，30C誘導(dǎo)6小時是蛋白表達的最大產(chǎn)量期。22C、18C、16C等低溫誘導(dǎo)時間在12h-48h。低溫誘導(dǎo)可使蛋白緩慢合成，利于蛋白正確折疊形成可溶性蛋白。為了得到更多的可溶性蛋白，可以考慮將溫度再降(但表達總量會有所降低)，可以考慮25°，誘導(dǎo)8-10個小時；20°誘導(dǎo)14-18個小時；甚至15°24-36小時誘導(dǎo)。二、檢測誘導(dǎo)表達細菌的裂解裂常用方法有：①高溫珠磨法；②高壓勻漿；③超聲破碎法；④酶溶法；⑤化學(xué)滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法①、②已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實驗室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法結(jié)合使用的實驗步驟。常用的溶解酶有溶菌酶；P-1,3-葡聚糖酶；P-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。4°C，5000rpm離心，15min，收集誘導(dǎo)表達的細菌培養(yǎng)液(30mL)。棄上清，1mL裂解緩沖液，懸浮沉淀，30C作用1h。超聲破碎細菌，40w,10s,10s,50次；12000rpm,4°。離心，15min，分別收集上清液和沉淀。分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2X凝膠電泳加樣緩沖液，待檢測。注意事項：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標本經(jīng)3-4次凍溶后更容易破碎。進行SDS檢測表達結(jié)果：a細胞質(zhì)中表達；b包涵體形式表達。包涵體的純化a包涵體的洗滌；b包涵體的溶解；c包涵體的檢測從基因角度改造一下，如果能夠去掉一些疏水區(qū)段會很大程度上改善蛋白的可溶性注意事項a所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性；b根據(jù)自己的需要選擇不同的表達載體，并注意不同的表達載體上的融合標簽和攜帶的抗性基因，其中有些標簽是可以去除的。具體的序列和說明都可以從中下載。c包涵體蛋白溶液保存在四度里，避免反復(fù)凍融，否則體系不穩(wěn)定，蛋白以沉淀析出；胞質(zhì)蛋白不能在四度放置很久，因為上清中含有很多蛋白酶，會把靶蛋白降解掉。PartW誘導(dǎo)表達一、誘導(dǎo)表達誘導(dǎo)表達類型組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。誘導(dǎo)調(diào)控型表達：表達載體采用誘導(dǎo)型啟動子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達的，也屬于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽(Tag)，表達產(chǎn)物為融合蛋白(有分N端或者C端融合表達)，方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag(如GST)以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包含體，而且表達產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間?？扇苄员磉_：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高(非常股復(fù)雜)。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。誘導(dǎo)表達挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50〃g/ml)中37°C過夜培養(yǎng)。按1：50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37C震蕩培養(yǎng)至OD6OO7O.4-1.0(最好0.6，大約需3h。取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入100mMIPTG至終濃度為0.4mM(T7啟動子)或1mM(T7lac啟動子)，作為實驗組，兩組繼續(xù)37C震蕩培養(yǎng)3h。分別取菌體1ml,離心12000gX30s收獲沉淀，用PBS重懸、洗滌、離心。對細菌沉淀進行處理，做SDS等分析。注意事項：(1)關(guān)于表達不出來的原因有很多a如果測序都是正確的話，設(shè)計一個postiveexpressioncontrol，驗證整個表達系統(tǒng)沒問題。b檢測是否有毒性。涂一個IPTG的板子看菌落生長情況如何。c看看稀有密碼子情況，是不是存在成簇的N端的稀有密碼子。d看看穩(wěn)定性，上swissprot看看在大腸桿菌中的穩(wěn)定時間是多少。e如果表達的是真核蛋白，可能問題更復(fù)雜，可能涉及到伴侶蛋白等問題？f有人會檢測mRNA的穩(wěn)定性。g可以用親和層析等辦法富集你的目的蛋白，然后再跑膠。因為有時你的目的蛋白表達豐度過低，SDS檢測不到。提高外源基因表達水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達分成兩個階段，以減輕宿主菌的負荷。IPTG：IPTG濃度0.2-0.5mMIPTG足夠了，不會降低表達量，反而會增加蛋白的可溶性。IPTG濃度過高，易使蛋白表達速度增大，來不及正確折疊而產(chǎn)生不溶性蛋白(包涵體)°T7lac啟動子是嚴謹啟動子，IPTG誘導(dǎo)時可以優(yōu)化最佳濃度(25uM-1mM之間)使目的蛋白達到最佳的活性和溶解性。溫度：一般37C誘導(dǎo)3-4小時，30C誘導(dǎo)6小時是蛋白表達的最大產(chǎn)量期。22C、18C、16C等低溫誘導(dǎo)時間在12h-48h。低溫誘導(dǎo)可使蛋白緩慢合成，利于蛋白正確折疊形成可溶性蛋白。為了得到更多的可溶性蛋白，可以考慮將溫度再降(但表達總量會有所降低)，可以考慮25°，誘導(dǎo)8-10個小時；20°誘導(dǎo)14-18個小時；甚至15°24-36小時誘導(dǎo)。二、檢測誘導(dǎo)表達細菌的裂解裂常用方法有：①高溫珠磨法；②高壓勻漿；③超聲破碎法；④酶溶法；⑤化學(xué)滲透等。前三種方法屬機械破碎法，并且方法①、②已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實驗室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法結(jié)合使用的實驗步驟。常用的溶解酶有溶菌酶；P-1,3-葡聚糖酶；P-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。4°C,5000rpm離心，15min，收集誘導(dǎo)表達的細菌培養(yǎng)液(30mL)。棄上清，1mL裂解緩沖液，懸浮沉淀，30C作用1h。超聲破碎細菌，40w,10s,10s,50次；12000rpm,4°。離心，15min，分別收集上清液和沉淀。分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2X凝膠電泳加樣緩沖液，待檢測。注意事項：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標本經(jīng)3-4次凍溶后更容易破碎。進行SDS檢測表達結(jié)果：a細胞質(zhì)中表達；b包涵體形式表達。包涵體的純化a包涵體的洗滌；b包涵體的溶解；c包涵體的檢測從基因角度改造一下，如果能夠去掉一些疏水區(qū)段會很大程度上改善蛋白的可溶性注意事項a所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性；b根據(jù)自己的需要選擇不同的表達載體，并注意不同的表達載體上的融合標簽和攜帶的抗性基因，其中有些標簽是可以去除的。具體的序列和說明都可以從中下載。c包涵體蛋白溶液保存在四度里，避免反復(fù)凍融，否則體系不穩(wěn)定，蛋白以沉淀析出；胞質(zhì)蛋白不能在四度放置很久，因為上清中含有很多蛋白酶，會把靶蛋白降解掉。PartW誘導(dǎo)表達—、誘導(dǎo)表達誘導(dǎo)表達類型組成型表達：表達載體的啟動子為組成型啟動子，也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達通常表達量比較高，成本低，但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產(chǎn)物會影響細菌的生長，反過來影響表達量的積累。誘導(dǎo)調(diào)控型表達：表達載體采用誘導(dǎo)型啟動子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的，但是啟動子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達的，也屬于誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。融合表達：表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽(Tag)，表達產(chǎn)物為融合蛋白(有分N端或者C端融合表達)，方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag(如GST)以獲得穩(wěn)定表達；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。分泌表達：在起始密碼和目的基因之間加入信號肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細胞膜，避免表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)的過度累積而影響細胞生長，或者形成包含體，而且表達產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質(zhì)空間?？扇苄员磉_：大腸桿菌表達效率很高，特別是強啟動子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高(非常股復(fù)雜)。分泌表達可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。誘導(dǎo)表達挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50〃g/ml)中37°C過夜培養(yǎng)。按1：50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37C震蕩培養(yǎng)至OD6OO7O.4-1.0(最好0.6，大約需3h。取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組，余下的加入100mMIPTG至終濃度為0.4mM(T7啟動子)或1mM(T7lac啟動子)，作為實驗組，兩組繼續(xù)37C震蕩培養(yǎng)3h。分別取菌體1ml,離心12000gX30s收獲沉淀，用PBS重懸、洗滌、離心。對細菌沉淀進行處理，做SDS等分析。注意事項：(1)關(guān)于表達不出來的原因有很多a如果測序都是正確的話，設(shè)計一個postiveexpressioncontrol，驗證整個表達系統(tǒng)沒問題。b檢測是否有毒性。涂一個IPTG的板子看菌落生長情況如何。c看看稀有密碼子情況，是不是存在成簇的N端的稀有密碼子。d看看穩(wěn)定性，上swissprot看看在大腸桿菌中的穩(wěn)定時間是多少。e如果表達的是真核蛋白