疫苗臨床前研究指導(dǎo)原則課件

預(yù)防用疫苗臨床前研究

技術(shù)指導(dǎo)原則由病毒、細(xì)菌或其他病原微生物為起始材料，經(jīng)培養(yǎng)增殖制成的減毒、滅活的病原體，或再經(jīng)純化、裂解、亞單位（包括細(xì)菌類毒素）等方法處理制備的富含免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)而達(dá)到預(yù)防某種疾病的產(chǎn)品，為預(yù)防用疫苗。預(yù)防用疫苗臨床前研究

技術(shù)指導(dǎo)原則由病毒、細(xì)菌或其他病原微生1本指導(dǎo)原則適用于用病毒、細(xì)菌或其他病原微生物制備的預(yù)防用疫苗，其目的是為該類制劑提供一個共同的原則，指導(dǎo)制定臨床前研究的方案，和確定具體的研究內(nèi)容。本指導(dǎo)原則適用于用病毒、細(xì)菌或其他病原微生物制備的預(yù)防用疫苗2一、基本原則

（一）應(yīng)符合國家《藥品管理法》等相關(guān)法律法規(guī)的要求；

（二）對所預(yù)防的疾病的流行情況進(jìn)行研究,包括疾病的危害程度所涉及的人群及病原的型和亞型等；

（三）對研制該類制品用于預(yù)防疾病的有效性、安全性及必要性進(jìn)行分析；

一、基本原則

（一）應(yīng)符合國家《藥品管理法》等相關(guān)法律法規(guī)的3（四）應(yīng)對該制品用于預(yù)防該疾病的利益風(fēng)險比進(jìn)行研究。根據(jù)該制品的預(yù)防方案可能達(dá)到的效果及可能出現(xiàn)的副作用或危害，對總體的利弊權(quán)衡進(jìn)行評價，并提出擬采取避免或減少其危害性或副作用的措施。這種評價將是該方案能否獲得批準(zhǔn)的重要依據(jù)之一。（四）應(yīng)對該制品用于預(yù)防該疾病的利益風(fēng)險比進(jìn)行研究。根據(jù)該制4二、用于疫苗研究用的菌毒種

研究疫苗所用的菌毒種必須證明為引起本病的細(xì)菌、病毒或其他病原體，如該菌毒株分離自人體，下述內(nèi)容必須清楚。（一）菌毒株名稱及來源：

1．菌毒株名稱

2．菌毒株來源

（1）分離菌毒株的宿主一般情況；（2）發(fā)病地點(diǎn)、發(fā)病日期；臨床確診日期、實(shí)驗室確診日期；病人病程及病人轉(zhuǎn)歸。二、用于疫苗研究用的菌毒種

研究疫苗所用的菌毒種必須證明5菌、毒種系指直接用于制造和檢定生物制品的細(xì)菌、立克次體或病毒。菌、毒種系指直接用于制造和檢定生物制品的細(xì)菌、立克次體或病毒63．菌毒株分離原樣本：咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿液、尸解標(biāo)本的組織名稱；取樣日期；取樣時病人的病期。4．鑒于人類的血液在同一時間內(nèi)較少感染多種病毒或細(xì)菌，而咽試子、漱口液、痰液、尿液、糞便等樣品難免污染其他外源因子，因此用病人血液分離的菌、毒株較適宜用于研究疫苗。5．分離菌、毒株的其他自然樣本名稱、來源、數(shù)量、取樣方法等。

3．菌毒株分離原樣本：咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿7（二）菌、毒株分離過程

1．用細(xì)胞分離病毒，所用細(xì)胞名稱、代次、來源應(yīng)清楚，應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞無菌檢測、支原體和外原因子等檢測；病毒分離不宜使用腫瘤原性的細(xì)胞系。盡可能使用非腫瘤原性細(xì)胞，如人二倍體細(xì)胞或Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞

）等。

2．用動物分離病毒，對所用動物名稱、品系、級別、年齡、接種途徑、飼養(yǎng)條件和制備毒種的動物臟器名稱等須詳細(xì)記載；如再適應(yīng)到細(xì)胞，則還應(yīng)參照上述對分離用細(xì)胞的要求。（二）菌、毒株分離過程

1．用細(xì)胞分離病毒，所用細(xì)胞名稱、代8醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物分為四級：一級為普通動物；二級為清潔動物；三級為無特定病原體動物；四級為無菌動物和悉生動物。醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物分為四級：9普通動物（Conventioalanimals）是未經(jīng)積極的微生物學(xué)控制，普遍地飼養(yǎng)在開放衛(wèi)生環(huán)境里的動物。墊料和食物不經(jīng)高壓消毒，飲水為自來水，不喂青飼料。鼠應(yīng)排除肺炎病毒，沙門氏菌和鏈球菌，地鼠不應(yīng)有蟯蟲。普遍動物只能供教養(yǎng)和一般性實(shí)驗，不適用于研究實(shí)驗。普通動物（Conventioalanimals）是未經(jīng)積極10清潔普通動物（Cleanconventionalanimal,CCV）（亦稱最低限度疾病動物MOA）或稱清潔動物（Cleananimal,CL）來自屏障系統(tǒng)的SPF動物，飼養(yǎng)在溫濕度恒定的普通設(shè)施中的動物。墊料、飼料、用具等均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒。空氣亦應(yīng)經(jīng)過一定的過濾，工作人員穿干凈服裝操作，此類動物的微生物控制標(biāo)準(zhǔn)基本與SPF相同，不同之處為血清病毒抗體檢查（腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒……）經(jīng)?？蓹z出一定滴度的抗體，但不允許出現(xiàn)臨床癥狀和臟器的病理變化和自然死亡。清潔普通動物（Cleanconventionalanim11無特定病原體動物（Speceficpathogen-freeanimals）是指機(jī)體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在的動物，簡稱SPF動物。但非特定的微生物和寄生蟲是允許存在的，實(shí)際上就是指無傳染病的健康動物。一般大多先培育出無菌動物或悉生動物后，再把其轉(zhuǎn)移到有封閉系統(tǒng)（BarrierSystem）的設(shè)施中飼育繁殖。原則上SPF動物室內(nèi)是不允許存在病原菌的，但在封閉系統(tǒng)環(huán)境中，難免有很多非病原性微生物會逐漸進(jìn)入動物機(jī)體內(nèi)，故亦有人把這個轉(zhuǎn)移過程稱之為通常動物化。無特定病原體動物（Speceficpathogen-fre12悉生動物（Cnotobiotesanimals）是指機(jī)體內(nèi)帶著已知微生物的動物。此種動物原是無菌動物，系人為的將指定微生物投給其體內(nèi)，例如使大腸桿菌定居在無菌小鼠體內(nèi)，在進(jìn)行微生物檢查時，僅能檢出大腸桿菌。亦有人工投給二種以上的已知微生物。悉生動物一般分為單菌（Monoxenie）、雙菌（Dixenie）、三菌（Trixenie），或多菌（Polyxenie）動物。此種動物同無菌動物一樣是放在隔離器內(nèi)飼育的，但因其帶有已知的微生物，故隔離器內(nèi)有微生物及其代謝產(chǎn)物的污染。悉生動物（Cnotobiotesanimals）是指機(jī)體內(nèi)13無菌動物（Germfreeanimals）是指機(jī)體內(nèi)外均無任何寄生物（微生物和寄生蟲）的動物。此種動物在自然界中并不存在，必須用人為的方法培育出來。方法：一般將臨產(chǎn)前的健康動物用麻醉藥品或頸椎臼法處死后，立即浸泡在37℃滅菌液中，送進(jìn)無菌室（或無菌隔離器），按無菌手術(shù)進(jìn)行剖腹，切除帶胎子宮（子宮內(nèi)首先應(yīng)無菌），將其浸入消毒液里并輸送到另一隔離器中，切開子宮取胎，經(jīng)用滅菌紗布揩拭仔體并斷臍（電刀切斷）后，放隔離器內(nèi)人工喂乳或用其它品系的無菌母鼠作保姆供養(yǎng)。無菌動物（Germfreeanimals）是指機(jī)體內(nèi)外均14象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻煩，故采用保姆代養(yǎng)較為方便。而象豚鼠因在一定程度上能自力飲乳，故人工哺乳較容易。另外，象禽類、魚類、昆蟲類，因是在卵中無菌的前提下進(jìn)行的，故用藥物將卵周圍滅菌后移入無菌隔離器內(nèi)使其孵化即可，而且，這些動物一般在在出生后能自力采食，故較易育成。象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻煩，故采用保姆代養(yǎng)較為方便。而153．確定分離菌株所用培養(yǎng)基名稱、種類，以及分離培養(yǎng)的溫度和條件。（三）菌、毒株分離傳代特性

應(yīng)包括樣品處理方法、首次盲傳確證菌毒株陽性代次、菌毒株確證檢定方法、每代培養(yǎng)天數(shù)、病毒滴度、滴定方法、動物是否發(fā)病或死亡等資料。3．確定分離菌株所用培養(yǎng)基名稱、種類，以及分離培養(yǎng)的溫度和條16盲傳：一般是用于分離樣本（血清，體液等）中的微生物（主要是細(xì)胞內(nèi)寄生的，比如病毒）。取一定量的血清，接種某種細(xì)胞，培養(yǎng)一定時間（7天），無論上清中有沒有微生物（如病毒），都取該上清，繼續(xù)接種這種細(xì)胞，如此循環(huán)幾次，就稱為盲傳幾代。盲傳：一般是用于分離樣本（血清，體液等）中的微生物（主要是細(xì)17（四）菌毒種建立和保存

應(yīng)包括原始菌毒種代次、滴度，添加的保護(hù)劑的名稱和濃度、存儲條件等資料；原代菌毒種是指已適應(yīng)到可生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞或培養(yǎng)基，可穩(wěn)定傳代、保留抗原性、并經(jīng)過檢定可用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種。種子批的建立應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》“生物制品制品檢定用菌毒種管理規(guī)程”的要求，應(yīng)對種子批進(jìn)行菌毒種的傳代和限定代次的研究，以證明主種子批和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性與原始菌毒種的一致性。（四）菌毒種建立和保存

應(yīng)包括原始菌毒種代次、滴度，添加的保18原始種子批（Primary

Seed

Lot）：一定數(shù)量的已驗明其來源、歷史和生物學(xué)特性并經(jīng)臨床研究證明其安全性和免疫原性良好的病毒株（或菌株）或用于制備原疫苗（Original

Vaccine）的活病毒（或菌體）懸液。該懸液應(yīng)加工為單一批，以確保其組成均一，并經(jīng)充分鑒定。原始種子批用于制備主種子批。

原始種子批（Primary

Seed

Lot）：一定數(shù)量的已19主種子批（Master

Seed

Lot）：一定數(shù)量的來自原始種子批的病毒株（或菌株）或用于制備原疫苗（Original

Vaccine）的活病毒（或菌體）懸液。該懸液應(yīng)加工為單一批，以確保其組成均一，并經(jīng)全面鑒定。主種子批用于制備疫苗生產(chǎn)用的工作種子批。主種子批（Master

Seed

Lot）：一定數(shù)量的來自原20原疫苗（original

Vaccine）：指按生產(chǎn)單位技術(shù)規(guī)范制備的疫苗，在臨床試驗中是安全和有免疫原性的。

工作種子批（Working

Seed

Lot）：按國家藥品管理當(dāng)局（

NRA）批準(zhǔn)的方法，從主種子批傳代而得到的活病毒或細(xì)菌。工作種子批用于生產(chǎn)疫苗。原疫苗（original

Vaccine）：指按生產(chǎn)單位技術(shù)21（五）菌毒種的檢定

1．鑒別試驗：可采用血清學(xué)、生物學(xué)、核酸序列分析等方法證明為該菌毒種。明確該病原體及其它相關(guān)生物分子的基因序列及結(jié)構(gòu)，并與我國主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進(jìn)行分析以及明確其血清型、亞型和/或基因型，對該種基因型或血清型的流行情況進(jìn)行分析，若存在不同的血清型或基因型，應(yīng)對所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應(yīng)或交叉保護(hù)性進(jìn)行分析和研究。（五）菌毒種的檢定

1．鑒別試驗：可采用血清學(xué)、生物學(xué)、核酸222．無菌檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。3．外源因子檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定，取樣量應(yīng)足夠檢測試驗的需要。4．?dāng)U增能力和感染性滴度：應(yīng)能達(dá)到按生產(chǎn)工藝要求順利生產(chǎn)合格疫苗的要求。應(yīng)建立測定菌毒種擴(kuò)增能力和感染性滴度的方法和標(biāo)準(zhǔn)，并提供這些擴(kuò)增能力和感染性滴度與疫苗有效性之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)。2．無菌檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。23外源因子（Adventitious

Agents、Extraneous

Agents）：存在于接種物，細(xì)胞基質(zhì)及（或）生產(chǎn)制品所用的原材料及制品中的污染物，包括細(xì)菌、真菌、支原體和外源性病毒。

外源因子（Adventitious

Agents、Extra245．免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要指標(biāo)，應(yīng)制定和建立測定菌毒種免疫原性的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)，以評估該候選菌毒種能否進(jìn)行疫苗生產(chǎn)。5．免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要256．減毒特性（1）如研制減毒活疫苗應(yīng)對原始菌毒株的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性進(jìn)行研究；減毒方法、減毒過程、減毒程度和減毒后的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性，并進(jìn)行減毒前后的特性對比，尤其要對減毒后的安全性和免疫原性作出確切的結(jié)論；6．減毒特性26減毒株（Attenuated

Strains）：一種細(xì)菌或病毒，其對特定宿主的毒力已被適當(dāng)減弱或已消失。

減毒株（Attenuated

Strains）：一種細(xì)菌或病27（2）應(yīng)建立減毒特性指標(biāo)的驗證方法、動物模型和減毒后安全性的標(biāo)準(zhǔn)以及檢測和警戒毒力回復(fù)的依據(jù)等；（3）對制備注射劑的減毒活疫苗，除一般的外源因子檢測外，還應(yīng)驗證無逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。該驗證方法可采用PERT法（4）如已知該病毒具有嗜神經(jīng)毒性，其驗證要求可參考《IABSScientificworkshoponneurovirulencetestforlivevirusvaccines,WHO,31January2005》。（2）應(yīng)建立減毒特性指標(biāo)的驗證方法、動物模型和減毒后安全性的28三、疫苗的生產(chǎn)工藝研究（一）建立菌毒種庫

應(yīng)建立三級種子庫。對種子庫的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，明確該種子庫可以傳代的次數(shù)。生產(chǎn)用菌毒種、細(xì)胞和涉及生產(chǎn)的工藝技術(shù)應(yīng)注意專利，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)專利查詢。三、疫苗的生產(chǎn)工藝研究29（二）生產(chǎn)用細(xì)胞和/或培養(yǎng)基

1．生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》中“生物制品生產(chǎn)用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”的要求，如用傳代細(xì)胞系應(yīng)建立三級細(xì)胞庫。2．生產(chǎn)用培養(yǎng)基盡可能避免使用動物來源和可能引起人體不良反應(yīng)的原材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性原材料。（二）生產(chǎn)用細(xì)胞和/或培養(yǎng)基

1．生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)符合現(xiàn)行版《中30原始細(xì)胞庫（Primary

Cell

Bank，PCB）：一定量經(jīng)過充分鑒定的人、動物或其他來源的細(xì)胞；源自單一組織或細(xì)胞分裝于容器內(nèi)，組成應(yīng)均一，凍存于-13O℃或以下，其中一支（瓶）或多支（瓶）可用于制備主細(xì)胞庫（Master

Cell

Bank，MCB）。

原始細(xì)胞庫（Primary

Cell

Bank，PCB）：一31主細(xì)胞庫（Master

Cell

Bank，MCB）：經(jīng)過充分鑒定一定量的人、動物或其他來源且保存適宜的細(xì)胞，一般是由原始細(xì)胞庫（Primry

Cell

Bank）的細(xì)胞制備而成，分裝于容器內(nèi)，組成應(yīng)均一，保存于-13O℃或以下，通常用于制備工作細(xì)胞庫（Working

Cell

Bank，WCB）。

主細(xì)胞庫（Master

Cell

Bank，MCB）：經(jīng)過充32工作細(xì)胞庫（Working

Cell

Bank，WCB）：由有限傳代水平的主細(xì)胞庫制備而來的均一性細(xì)胞懸液，分裝適宜體積于多個容器中，適當(dāng)保存，常凍存于-13O℃或以下，其中一支（瓶）或多支（瓶）可用于生產(chǎn)。所有容器處理相同，其中一支（瓶）或多支（瓶）一旦由貯存庫中移出后，不得返回原種子貯存庫中。實(shí)際上，細(xì)胞種子是通過亞培養(yǎng)擴(kuò)增至一定代次（或適宜的群體倍增數(shù)）后，由制造單位選定并由國家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)。此細(xì)胞合并后分裝于安瓿，并低溫保存為WCB。

工作細(xì)胞庫（Working

Cell

Bank，WCB）：由33（三）疫苗原液生產(chǎn)工藝的研究

1．生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)的確定

（1）病毒與細(xì)胞的接種比例、病毒感染復(fù)數(shù)（MOI：multiplicityofinfection，含義是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值）的最佳參數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時間和收獲時間。菌毒種的接種量，培養(yǎng)和發(fā)酵條件等技術(shù)參數(shù)的研究確定；（三）疫苗原液生產(chǎn)工藝的研究

1．生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)的確34（2）滅活劑的選擇和依據(jù)；（3）滅活或裂解條件及滅活或脫毒效果的驗證，滅活效果驗證的依據(jù)、方法；滅活效果的驗證，應(yīng)采用盡可能敏感的細(xì)胞或培養(yǎng)基和方法進(jìn)行；

（2）滅活劑的選擇和依據(jù)；35滅活是指破壞病原體的生物學(xué)特性，但盡可能避免影響其免疫原性或破壞血清中補(bǔ)體活性的過程。常用的滅活劑有甲醛、β-丙內(nèi)酯(BPL)或其他有效滅活劑。滅活是指破壞病原體的生物學(xué)特性，但盡可能避免影響其免疫原性或36甲醛是一種有強(qiáng)烈刺激性的致癌物質(zhì)。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸堿基，又可作用病毒殼蛋白。作用于病毒殼蛋白時，易使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)或病毒顆粒聚集，不能再作用于殼蛋白內(nèi)的核酸。這樣，病原體蛋白的抗原性會遭到嚴(yán)重破壞，并可能有病原體存活；用甲醛滅活時間長，一般需要在37-39℃處理24h以上或更長時間。并且滅活的效果易受溫度、pH、濃度、是否存在有機(jī)物、病原體的種類和含氮量等因素影響，在研究中應(yīng)引起注意；殘留的游離甲醛，若隨疫苗注入機(jī)體后，會產(chǎn)生制激性反應(yīng)。甲醛是一種有強(qiáng)烈刺激性的致癌物質(zhì)。其既可作用于病毒含氨基的核37β-丙內(nèi)酯(BPL)在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活。它是一種雜環(huán)類化合物(C3H4O2)，沸點(diǎn)155℃，常溫下是無色粘稠狀液體，對病毒具有很強(qiáng)的滅活作用。它作用于病原體DNA或RNA，改變病毒核酸結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活目的，而不直接作用于蛋白。β-丙內(nèi)酯(BPL)在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活。它是一種38（4）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：純化和提取工藝中各種條件進(jìn)行優(yōu)化，純化和提取工藝對抗原活性成分是否影響，應(yīng)建立穩(wěn)定的純化工藝，包括純化時的回收率、抗原活性和純度等的穩(wěn)定性；并制定相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)和檢測方法，按GMP要求在符合GMP要求的生產(chǎn)環(huán)境下生產(chǎn)；

（5）初步確定起始投料、原液、半成品和成品的產(chǎn)出比的理論數(shù)據(jù)。

（4）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：純化和提39原液（Bulk）：系指用于制造最終配制物（Final

formulation）或半成品（Final

Bulk）的均一物質(zhì)。由一次或多次單一收獲物而得到，一般需要純化并可能配制一批或多批半成品。如屬微生物，通常視為原懸液（Bulk

Suspension）。如原液已濃縮，經(jīng)稀釋成為半成品。對于多價制品（如三價脊灰疫苗），原液是由單價原液配制而成。

原液（Bulk）：系指用于制造最終配制物（Final

for402．疫苗對佐劑的要求

目前能用于疫苗的佐劑多為氫氧化鋁，而鋁佐劑通常使疫苗產(chǎn)生的抗體滯后，且增加注射局部的副反應(yīng)幾率。如疫苗的抗原能滿足免疫的需要，則不加佐劑為宜。佐劑是非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)與抗原一起注射或預(yù)先注入機(jī)體時，可增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。2．疫苗對佐劑的要求

目前能用于疫苗的佐劑多為氫氧化鋁，而鋁41佐劑有很多種；例如氫氧化鋁佐劑、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子、明礬等。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑是目前動物試驗中最常用佐劑。弗氏完全佐劑是一種油包水的乳濁液，能夠非常有效的誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體。弗氏完全佐劑含結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分，可以加強(qiáng)對抗原的抗體反應(yīng)。佐劑活性來自于油滴中免疫原的持續(xù)釋放，并刺激局部免疫反應(yīng)。佐劑有很多種；例如氫氧化鋁佐劑、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因42如果在終制品中使用佐劑，則對以下問題應(yīng)進(jìn)行研究，對于已經(jīng)明確有佐劑效應(yīng)或者已經(jīng)商品化的佐劑，只需提供該類制劑的組分或化學(xué)組成，國內(nèi)外使用該類制劑的情況，無需再進(jìn)行毒理和安全性研究。若國內(nèi)外均未使用過該類佐劑,則必須對其作用原理、安全性及佐劑效應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的研究并建立切實(shí)可行的評價方法。如果在終制品中使用佐劑，則對以下問題應(yīng)進(jìn)行研究，對于已經(jīng)明確43（四）疫苗的配方研究

應(yīng)對疫苗的配方進(jìn)行研究，如疫苗中添加的穩(wěn)定劑成分，緩沖液、佐劑、以及凍干疫苗的賦形劑成分等是否對疫苗造成影響。（四）疫苗的配方研究

應(yīng)對疫苗的配方進(jìn)行研究，如疫苗中添加的44四、藥理、毒理和生物分布

疫苗不同于一般的化學(xué)藥品，藥理、毒理的實(shí)驗要求具有特殊性，因此，該制品的藥理學(xué)試驗主要包括發(fā)生作用的原理、生物效價與劑量的關(guān)系、免疫程序和接種途徑與效果的關(guān)系等；在毒理學(xué)方面主要考慮接種部位和全身的病理反應(yīng)、以及機(jī)體對該疫苗的非期望的免疫應(yīng)答反應(yīng)和這種反應(yīng)的持續(xù)時間。由于以上各方面是互相關(guān)聯(lián)的，因此，應(yīng)綜合考慮藥理、毒理和免疫原性或生物效價的因素。四、藥理、毒理和生物分布

疫苗不同于一般的化學(xué)藥品，藥理、毒45應(yīng)建立適當(dāng)?shù)脑囼灱皺z測方法來評價疫苗的免疫原性或生物效價，如果有動物模型或可建立動物模型的，可以采用動物模型直接評價疫苗的生物效價，如：對一些有動物模型的感染性疾病，可以采用病原體的攻擊實(shí)驗來評價該疫苗的保護(hù)效果。而且要建立劑量與生物效價的關(guān)系，通過實(shí)驗優(yōu)化免疫程序和接種途徑。若無法建立動物模型，應(yīng)建立能驗證該疫苗有效性的體外實(shí)驗進(jìn)行評價。應(yīng)建立適當(dāng)?shù)脑囼灱皺z測方法來評價疫苗的免疫原性或生物效46滅活疫苗的生物分布較難檢測和評價。減毒活疫苗的生物分布應(yīng)建立敏感的動物模型，可測定接種疫苗后的病毒血癥（或菌血癥）以及持續(xù)時間，排毒（菌）方式和途徑，對是否呈現(xiàn)體內(nèi)復(fù)制及感染的器官組織細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的研究。滅活疫苗的生物分布較難檢測和評價。減毒活疫苗的生物分布應(yīng)建立47五、質(zhì)量控制及檢定的要求（一）生產(chǎn)過程中質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)的建立及要求

在生產(chǎn)工藝的各個環(huán)節(jié)和步驟中的產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，以便后續(xù)工藝的進(jìn)行,保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的穩(wěn)定性。（二）產(chǎn)品的質(zhì)量檢定與要求

1．外觀檢查：根據(jù)樣品的特征建立外觀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

五、質(zhì)量控制及檢定的要求482．pH值檢測：可根據(jù)一般生物制品的要求建立標(biāo)準(zhǔn)，一般為7.2±0.5。3．純度：主要用于評價純化制品中含有有效成分的量和雜質(zhì)的最低限量，制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，通?？蓽y定有效抗原在疫苗中的絕對值或測定主要雜質(zhì)的量推算有效抗原在疫苗中的相對值。2．pH值檢測：可根據(jù)一般生物制品的要求建立標(biāo)準(zhǔn)，一般為7.494．宿主細(xì)胞DNA和蛋白殘留量檢測：采用傳代細(xì)胞生產(chǎn)疫苗，應(yīng)限制疫苗中的宿主細(xì)胞DNA和蛋白殘留量，進(jìn)行方法研究時應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品，并對檢測試劑的敏感性和特異性進(jìn)行驗證。疫苗中殘余宿主細(xì)胞DNA及蛋白殘留量可參考現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。4．宿主細(xì)胞DNA和蛋白殘留量檢測：505.無菌檢查：應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。6.熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：可參照現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求進(jìn)行；也可以用其它方法檢測疫苗中的熱原物質(zhì)。7.抗生素檢測：預(yù)防用疫苗在生產(chǎn)過程中不得添加青霉素或其他β-內(nèi)酰氨類抗生素；如在生產(chǎn)過程中添加除上述以外的其他抗生素，應(yīng)建立相應(yīng)的檢測方法并規(guī)定抗生素殘留量的要求。5.無菌檢查：應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。518.滅活效果的驗證：由于制備疫苗的病原體一般均對人類致病，因此應(yīng)建立有效的滅活方法對該制品中的病原體進(jìn)行滅活，并應(yīng)對滅活效果進(jìn)行驗證；在成品檢定中應(yīng)建立滅活劑殘留量檢測的方法和限度標(biāo)準(zhǔn)。9.異常毒性檢查：應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求。8.滅活效果的驗證：由于制備疫苗的病原體一般均對人類致病，5210.穩(wěn)定性試驗：是指疫苗在常規(guī)保存溫度下的穩(wěn)定性試驗。由于穩(wěn)定性試驗的結(jié)果直接與制品的效期有關(guān)，且試驗觀察時間較長，因此應(yīng)在生產(chǎn)工藝確定后盡早留樣進(jìn)行，定期取樣測定制品效力和其他相關(guān)的質(zhì)量指標(biāo)；對穩(wěn)定性試驗結(jié)果與加速穩(wěn)定性試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析對比，可為正式產(chǎn)品的有效期確定提供依據(jù)。10.穩(wěn)定性試驗：是指疫苗在常規(guī)保存溫度下的穩(wěn)定性試驗。由5311.效力試驗（生物效價）：由于用于預(yù)防的疫苗是通過機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生作用的，因此應(yīng)評價其體液免疫和細(xì)胞免疫的生物效價。在評價體液免疫效價時，應(yīng)選擇實(shí)驗動物的品系，建立檢測動物血清抗體的診斷試劑，并對該類試劑進(jìn)行驗證，可以計算小鼠ED50以及抗體產(chǎn)生的滴度，如有必要和可行，還應(yīng)當(dāng)建立評價抗體質(zhì)量的方法，對抗體的性質(zhì)進(jìn)行評價，如亞型測定及抗原中和位點(diǎn)分析等；11.效力試驗（生物效價）：由于用于預(yù)防的疫苗是通過機(jī)體的54在評價細(xì)胞免疫效價時，應(yīng)當(dāng)建立檢測評價細(xì)胞免疫的方法，也可通過對細(xì)胞因子的定量檢測評價其細(xì)胞免疫情況，如屬于常規(guī)檢定項目，該類方法應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)，并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。若有動物模型，可進(jìn)行動物保護(hù)性實(shí)驗。在評價細(xì)胞免疫效價時，應(yīng)當(dāng)建立檢測評價細(xì)胞免疫的方法，55半數(shù)有效量(50%effectivedose,ED50)：在量反應(yīng)中指能引起50％最大反應(yīng)強(qiáng)度的藥量，在質(zhì)反應(yīng)中指引起50%實(shí)驗對象出現(xiàn)陽性反應(yīng)時的藥量。半數(shù)有效量(50%effectivedose,ED5056六、臨床研究用樣品要求（一）申請臨床試驗用的疫苗，按照國家GMP的要求,在符合現(xiàn)行中國藥品GMP的生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的。（二）臨床試驗用疫苗樣品應(yīng)盡量使用與臨床前研究相同批的疫苗,其批量一般不少于1000人份，并能滿足臨床試驗對疫苗量的要求。（三）進(jìn)行臨床試驗的疫苗必須由中國藥品生物制品檢定所進(jìn)行質(zhì)量復(fù)核。六、臨床研究用樣品要求57預(yù)防用疫苗臨床前研究

技術(shù)指導(dǎo)原則由病毒、細(xì)菌或其他病原微生物為起始材料，經(jīng)培養(yǎng)增殖制成的減毒、滅活的病原體，或再經(jīng)純化、裂解、亞單位（包括細(xì)菌類毒素）等方法處理制備的富含免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)而達(dá)到預(yù)防某種疾病的產(chǎn)品，為預(yù)防用疫苗。預(yù)防用疫苗臨床前研究

技術(shù)指導(dǎo)原則由病毒、細(xì)菌或其他病原微生58本指導(dǎo)原則適用于用病毒、細(xì)菌或其他病原微生物制備的預(yù)防用疫苗，其目的是為該類制劑提供一個共同的原則，指導(dǎo)制定臨床前研究的方案，和確定具體的研究內(nèi)容。本指導(dǎo)原則適用于用病毒、細(xì)菌或其他病原微生物制備的預(yù)防用疫苗59一、基本原則

（一）應(yīng)符合國家《藥品管理法》等相關(guān)法律法規(guī)的要求；

（二）對所預(yù)防的疾病的流行情況進(jìn)行研究,包括疾病的危害程度所涉及的人群及病原的型和亞型等；

（三）對研制該類制品用于預(yù)防疾病的有效性、安全性及必要性進(jìn)行分析；

一、基本原則

（一）應(yīng)符合國家《藥品管理法》等相關(guān)法律法規(guī)的60（四）應(yīng)對該制品用于預(yù)防該疾病的利益風(fēng)險比進(jìn)行研究。根據(jù)該制品的預(yù)防方案可能達(dá)到的效果及可能出現(xiàn)的副作用或危害，對總體的利弊權(quán)衡進(jìn)行評價，并提出擬采取避免或減少其危害性或副作用的措施。這種評價將是該方案能否獲得批準(zhǔn)的重要依據(jù)之一。（四）應(yīng)對該制品用于預(yù)防該疾病的利益風(fēng)險比進(jìn)行研究。根據(jù)該制61二、用于疫苗研究用的菌毒種

研究疫苗所用的菌毒種必須證明為引起本病的細(xì)菌、病毒或其他病原體，如該菌毒株分離自人體，下述內(nèi)容必須清楚。（一）菌毒株名稱及來源：

1．菌毒株名稱

2．菌毒株來源

（1）分離菌毒株的宿主一般情況；（2）發(fā)病地點(diǎn)、發(fā)病日期；臨床確診日期、實(shí)驗室確診日期；病人病程及病人轉(zhuǎn)歸。二、用于疫苗研究用的菌毒種

研究疫苗所用的菌毒種必須證明62菌、毒種系指直接用于制造和檢定生物制品的細(xì)菌、立克次體或病毒。菌、毒種系指直接用于制造和檢定生物制品的細(xì)菌、立克次體或病毒633．菌毒株分離原樣本：咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿液、尸解標(biāo)本的組織名稱；取樣日期；取樣時病人的病期。4．鑒于人類的血液在同一時間內(nèi)較少感染多種病毒或細(xì)菌，而咽試子、漱口液、痰液、尿液、糞便等樣品難免污染其他外源因子，因此用病人血液分離的菌、毒株較適宜用于研究疫苗。5．分離菌、毒株的其他自然樣本名稱、來源、數(shù)量、取樣方法等。

3．菌毒株分離原樣本：咽試子、漱口液、痰液、血液、糞便、尿64（二）菌、毒株分離過程

1．用細(xì)胞分離病毒，所用細(xì)胞名稱、代次、來源應(yīng)清楚，應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞無菌檢測、支原體和外原因子等檢測；病毒分離不宜使用腫瘤原性的細(xì)胞系。盡可能使用非腫瘤原性細(xì)胞，如人二倍體細(xì)胞或Vero細(xì)胞（非洲綠猴腎細(xì)胞

）等。

2．用動物分離病毒，對所用動物名稱、品系、級別、年齡、接種途徑、飼養(yǎng)條件和制備毒種的動物臟器名稱等須詳細(xì)記載；如再適應(yīng)到細(xì)胞，則還應(yīng)參照上述對分離用細(xì)胞的要求。（二）菌、毒株分離過程

1．用細(xì)胞分離病毒，所用細(xì)胞名稱、代65醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物分為四級：一級為普通動物；二級為清潔動物；三級為無特定病原體動物；四級為無菌動物和悉生動物。醫(yī)學(xué)實(shí)驗動物分為四級：66普通動物（Conventioalanimals）是未經(jīng)積極的微生物學(xué)控制，普遍地飼養(yǎng)在開放衛(wèi)生環(huán)境里的動物。墊料和食物不經(jīng)高壓消毒，飲水為自來水，不喂青飼料。鼠應(yīng)排除肺炎病毒，沙門氏菌和鏈球菌，地鼠不應(yīng)有蟯蟲。普遍動物只能供教養(yǎng)和一般性實(shí)驗，不適用于研究實(shí)驗。普通動物（Conventioalanimals）是未經(jīng)積極67清潔普通動物（Cleanconventionalanimal,CCV）（亦稱最低限度疾病動物MOA）或稱清潔動物（Cleananimal,CL）來自屏障系統(tǒng)的SPF動物，飼養(yǎng)在溫濕度恒定的普通設(shè)施中的動物。墊料、飼料、用具等均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒。空氣亦應(yīng)經(jīng)過一定的過濾，工作人員穿干凈服裝操作，此類動物的微生物控制標(biāo)準(zhǔn)基本與SPF相同，不同之處為血清病毒抗體檢查（腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒……）經(jīng)?？蓹z出一定滴度的抗體，但不允許出現(xiàn)臨床癥狀和臟器的病理變化和自然死亡。清潔普通動物（Cleanconventionalanim68無特定病原體動物（Speceficpathogen-freeanimals）是指機(jī)體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在的動物，簡稱SPF動物。但非特定的微生物和寄生蟲是允許存在的，實(shí)際上就是指無傳染病的健康動物。一般大多先培育出無菌動物或悉生動物后，再把其轉(zhuǎn)移到有封閉系統(tǒng)（BarrierSystem）的設(shè)施中飼育繁殖。原則上SPF動物室內(nèi)是不允許存在病原菌的，但在封閉系統(tǒng)環(huán)境中，難免有很多非病原性微生物會逐漸進(jìn)入動物機(jī)體內(nèi)，故亦有人把這個轉(zhuǎn)移過程稱之為通常動物化。無特定病原體動物（Speceficpathogen-fre69悉生動物（Cnotobiotesanimals）是指機(jī)體內(nèi)帶著已知微生物的動物。此種動物原是無菌動物，系人為的將指定微生物投給其體內(nèi)，例如使大腸桿菌定居在無菌小鼠體內(nèi)，在進(jìn)行微生物檢查時，僅能檢出大腸桿菌。亦有人工投給二種以上的已知微生物。悉生動物一般分為單菌（Monoxenie）、雙菌（Dixenie）、三菌（Trixenie），或多菌（Polyxenie）動物。此種動物同無菌動物一樣是放在隔離器內(nèi)飼育的，但因其帶有已知的微生物，故隔離器內(nèi)有微生物及其代謝產(chǎn)物的污染。悉生動物（Cnotobiotesanimals）是指機(jī)體內(nèi)70無菌動物（Germfreeanimals）是指機(jī)體內(nèi)外均無任何寄生物（微生物和寄生蟲）的動物。此種動物在自然界中并不存在，必須用人為的方法培育出來。方法：一般將臨產(chǎn)前的健康動物用麻醉藥品或頸椎臼法處死后，立即浸泡在37℃滅菌液中，送進(jìn)無菌室（或無菌隔離器），按無菌手術(shù)進(jìn)行剖腹，切除帶胎子宮（子宮內(nèi)首先應(yīng)無菌），將其浸入消毒液里并輸送到另一隔離器中，切開子宮取胎，經(jīng)用滅菌紗布揩拭仔體并斷臍（電刀切斷）后，放隔離器內(nèi)人工喂乳或用其它品系的無菌母鼠作保姆供養(yǎng)。無菌動物（Germfreeanimals）是指機(jī)體內(nèi)外均71象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻煩，故采用保姆代養(yǎng)較為方便。而象豚鼠因在一定程度上能自力飲乳，故人工哺乳較容易。另外，象禽類、魚類、昆蟲類，因是在卵中無菌的前提下進(jìn)行的，故用藥物將卵周圍滅菌后移入無菌隔離器內(nèi)使其孵化即可，而且，這些動物一般在在出生后能自力采食，故較易育成。象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻煩，故采用保姆代養(yǎng)較為方便。而723．確定分離菌株所用培養(yǎng)基名稱、種類，以及分離培養(yǎng)的溫度和條件。（三）菌、毒株分離傳代特性

應(yīng)包括樣品處理方法、首次盲傳確證菌毒株陽性代次、菌毒株確證檢定方法、每代培養(yǎng)天數(shù)、病毒滴度、滴定方法、動物是否發(fā)病或死亡等資料。3．確定分離菌株所用培養(yǎng)基名稱、種類，以及分離培養(yǎng)的溫度和條73盲傳：一般是用于分離樣本（血清，體液等）中的微生物（主要是細(xì)胞內(nèi)寄生的，比如病毒）。取一定量的血清，接種某種細(xì)胞，培養(yǎng)一定時間（7天），無論上清中有沒有微生物（如病毒），都取該上清，繼續(xù)接種這種細(xì)胞，如此循環(huán)幾次，就稱為盲傳幾代。盲傳：一般是用于分離樣本（血清，體液等）中的微生物（主要是細(xì)74（四）菌毒種建立和保存

應(yīng)包括原始菌毒種代次、滴度，添加的保護(hù)劑的名稱和濃度、存儲條件等資料；原代菌毒種是指已適應(yīng)到可生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞或培養(yǎng)基，可穩(wěn)定傳代、保留抗原性、并經(jīng)過檢定可用于疫苗生產(chǎn)的菌毒種。種子批的建立應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》“生物制品制品檢定用菌毒種管理規(guī)程”的要求，應(yīng)對種子批進(jìn)行菌毒種的傳代和限定代次的研究，以證明主種子批和工作種子批在規(guī)定代次內(nèi)的生物學(xué)特性與原始菌毒種的一致性。（四）菌毒種建立和保存

應(yīng)包括原始菌毒種代次、滴度，添加的保75原始種子批（Primary

Seed

Lot）：一定數(shù)量的已驗明其來源、歷史和生物學(xué)特性并經(jīng)臨床研究證明其安全性和免疫原性良好的病毒株（或菌株）或用于制備原疫苗（Original

Vaccine）的活病毒（或菌體）懸液。該懸液應(yīng)加工為單一批，以確保其組成均一，并經(jīng)充分鑒定。原始種子批用于制備主種子批。

原始種子批（Primary

Seed

Lot）：一定數(shù)量的已76主種子批（Master

Seed

Lot）：一定數(shù)量的來自原始種子批的病毒株（或菌株）或用于制備原疫苗（Original

Vaccine）的活病毒（或菌體）懸液。該懸液應(yīng)加工為單一批，以確保其組成均一，并經(jīng)全面鑒定。主種子批用于制備疫苗生產(chǎn)用的工作種子批。主種子批（Master

Seed

Lot）：一定數(shù)量的來自原77原疫苗（original

Vaccine）：指按生產(chǎn)單位技術(shù)規(guī)范制備的疫苗，在臨床試驗中是安全和有免疫原性的。

工作種子批（Working

Seed

Lot）：按國家藥品管理當(dāng)局（

NRA）批準(zhǔn)的方法，從主種子批傳代而得到的活病毒或細(xì)菌。工作種子批用于生產(chǎn)疫苗。原疫苗（original

Vaccine）：指按生產(chǎn)單位技術(shù)78（五）菌毒種的檢定

1．鑒別試驗：可采用血清學(xué)、生物學(xué)、核酸序列分析等方法證明為該菌毒種。明確該病原體及其它相關(guān)生物分子的基因序列及結(jié)構(gòu)，并與我國主要流行株的核苷酸和氨基酸同源性進(jìn)行分析以及明確其血清型、亞型和/或基因型，對該種基因型或血清型的流行情況進(jìn)行分析，若存在不同的血清型或基因型，應(yīng)對所選擇的血清型或基因型與其它血清型或基因型交叉反應(yīng)或交叉保護(hù)性進(jìn)行分析和研究。（五）菌毒種的檢定

1．鑒別試驗：可采用血清學(xué)、生物學(xué)、核酸792．無菌檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。3．外源因子檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的相關(guān)要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定，取樣量應(yīng)足夠檢測試驗的需要。4．?dāng)U增能力和感染性滴度：應(yīng)能達(dá)到按生產(chǎn)工藝要求順利生產(chǎn)合格疫苗的要求。應(yīng)建立測定菌毒種擴(kuò)增能力和感染性滴度的方法和標(biāo)準(zhǔn)，并提供這些擴(kuò)增能力和感染性滴度與疫苗有效性之間的相關(guān)性數(shù)據(jù)。2．無菌檢查：按照現(xiàn)行版《中國藥典》的要求進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。80外源因子（Adventitious

Agents、Extraneous

Agents）：存在于接種物，細(xì)胞基質(zhì)及（或）生產(chǎn)制品所用的原材料及制品中的污染物，包括細(xì)菌、真菌、支原體和外源性病毒。

外源因子（Adventitious

Agents、Extra815．免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要指標(biāo)，應(yīng)制定和建立測定菌毒種免疫原性的有效方法和標(biāo)準(zhǔn)，以評估該候選菌毒種能否進(jìn)行疫苗生產(chǎn)。5．免疫原性檢查：菌毒種的免疫原性是衡量該疫苗是否有效的重要826．減毒特性（1）如研制減毒活疫苗應(yīng)對原始菌毒株的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性進(jìn)行研究；減毒方法、減毒過程、減毒程度和減毒后的生物學(xué)、血清型、基因型和免疫原性，并進(jìn)行減毒前后的特性對比，尤其要對減毒后的安全性和免疫原性作出確切的結(jié)論；6．減毒特性83減毒株（Attenuated

Strains）：一種細(xì)菌或病毒，其對特定宿主的毒力已被適當(dāng)減弱或已消失。

減毒株（Attenuated

Strains）：一種細(xì)菌或病84（2）應(yīng)建立減毒特性指標(biāo)的驗證方法、動物模型和減毒后安全性的標(biāo)準(zhǔn)以及檢測和警戒毒力回復(fù)的依據(jù)等；（3）對制備注射劑的減毒活疫苗，除一般的外源因子檢測外，還應(yīng)驗證無逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。該驗證方法可采用PERT法（4）如已知該病毒具有嗜神經(jīng)毒性，其驗證要求可參考《IABSScientificworkshoponneurovirulencetestforlivevirusvaccines,WHO,31January2005》。（2）應(yīng)建立減毒特性指標(biāo)的驗證方法、動物模型和減毒后安全性的85三、疫苗的生產(chǎn)工藝研究（一）建立菌毒種庫

應(yīng)建立三級種子庫。對種子庫的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，明確該種子庫可以傳代的次數(shù)。生產(chǎn)用菌毒種、細(xì)胞和涉及生產(chǎn)的工藝技術(shù)應(yīng)注意專利，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)專利查詢。三、疫苗的生產(chǎn)工藝研究86（二）生產(chǎn)用細(xì)胞和/或培養(yǎng)基

1．生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)符合現(xiàn)行版《中國藥典》中“生物制品生產(chǎn)用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”的要求，如用傳代細(xì)胞系應(yīng)建立三級細(xì)胞庫。2．生產(chǎn)用培養(yǎng)基盡可能避免使用動物來源和可能引起人體不良反應(yīng)的原材料，禁止使用來自瘋牛病疫區(qū)的牛源性原材料。（二）生產(chǎn)用細(xì)胞和/或培養(yǎng)基

1．生產(chǎn)用細(xì)胞應(yīng)符合現(xiàn)行版《中87原始細(xì)胞庫（Primary

Cell

Bank，PCB）：一定量經(jīng)過充分鑒定的人、動物或其他來源的細(xì)胞；源自單一組織或細(xì)胞分裝于容器內(nèi)，組成應(yīng)均一，凍存于-13O℃或以下，其中一支（瓶）或多支（瓶）可用于制備主細(xì)胞庫（Master

Cell

Bank，MCB）。

原始細(xì)胞庫（Primary

Cell

Bank，PCB）：一88主細(xì)胞庫（Master

Cell

Bank，MCB）：經(jīng)過充分鑒定一定量的人、動物或其他來源且保存適宜的細(xì)胞，一般是由原始細(xì)胞庫（Primry

Cell

Bank）的細(xì)胞制備而成，分裝于容器內(nèi)，組成應(yīng)均一，保存于-13O℃或以下，通常用于制備工作細(xì)胞庫（Working

Cell

Bank，WCB）。

主細(xì)胞庫（Master

Cell

Bank，MCB）：經(jīng)過充89工作細(xì)胞庫（Working

Cell

Bank，WCB）：由有限傳代水平的主細(xì)胞庫制備而來的均一性細(xì)胞懸液，分裝適宜體積于多個容器中，適當(dāng)保存，常凍存于-13O℃或以下，其中一支（瓶）或多支（瓶）可用于生產(chǎn)。所有容器處理相同，其中一支（瓶）或多支（瓶）一旦由貯存庫中移出后，不得返回原種子貯存庫中。實(shí)際上，細(xì)胞種子是通過亞培養(yǎng)擴(kuò)增至一定代次（或適宜的群體倍增數(shù)）后，由制造單位選定并由國家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)。此細(xì)胞合并后分裝于安瓿，并低溫保存為WCB。

工作細(xì)胞庫（Working

Cell

Bank，WCB）：由90（三）疫苗原液生產(chǎn)工藝的研究

1．生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)的確定

（1）病毒與細(xì)胞的接種比例、病毒感染復(fù)數(shù)（MOI：multiplicityofinfection，含義是感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值）的最佳參數(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的最佳溫度、培養(yǎng)時間和收獲時間。菌毒種的接種量，培養(yǎng)和發(fā)酵條件等技術(shù)參數(shù)的研究確定；（三）疫苗原液生產(chǎn)工藝的研究

1．生產(chǎn)工藝的主要技術(shù)參數(shù)的確91（2）滅活劑的選擇和依據(jù)；（3）滅活或裂解條件及滅活或脫毒效果的驗證，滅活效果驗證的依據(jù)、方法；滅活效果的驗證，應(yīng)采用盡可能敏感的細(xì)胞或培養(yǎng)基和方法進(jìn)行；

（2）滅活劑的選擇和依據(jù)；92滅活是指破壞病原體的生物學(xué)特性，但盡可能避免影響其免疫原性或破壞血清中補(bǔ)體活性的過程。常用的滅活劑有甲醛、β-丙內(nèi)酯(BPL)或其他有效滅活劑。滅活是指破壞病原體的生物學(xué)特性，但盡可能避免影響其免疫原性或93甲醛是一種有強(qiáng)烈刺激性的致癌物質(zhì)。其既可作用于病毒含氨基的核苷酸堿基，又可作用病毒殼蛋白。作用于病毒殼蛋白時，易使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)或病毒顆粒聚集，不能再作用于殼蛋白內(nèi)的核酸。這樣，病原體蛋白的抗原性會遭到嚴(yán)重破壞，并可能有病原體存活；用甲醛滅活時間長，一般需要在37-39℃處理24h以上或更長時間。并且滅活的效果易受溫度、pH、濃度、是否存在有機(jī)物、病原體的種類和含氮量等因素影響，在研究中應(yīng)引起注意；殘留的游離甲醛，若隨疫苗注入機(jī)體后，會產(chǎn)生制激性反應(yīng)。甲醛是一種有強(qiáng)烈刺激性的致癌物質(zhì)。其既可作用于病毒含氨基的核94β-丙內(nèi)酯(BPL)在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活。它是一種雜環(huán)類化合物(C3H4O2)，沸點(diǎn)155℃，常溫下是無色粘稠狀液體，對病毒具有很強(qiáng)的滅活作用。它作用于病原體DNA或RNA，改變病毒核酸結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活目的，而不直接作用于蛋白。β-丙內(nèi)酯(BPL)在國外已廣泛用于各種疫苗的滅活。它是一種95（4）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：純化和提取工藝中各種條件進(jìn)行優(yōu)化，純化和提取工藝對抗原活性成分是否影響，應(yīng)建立穩(wěn)定的純化工藝，包括純化時的回收率、抗原活性和純度等的穩(wěn)定性；并制定相應(yīng)的質(zhì)控指標(biāo)和檢測方法，按GMP要求在符合GMP要求的生產(chǎn)環(huán)境下生產(chǎn)；

（5）初步確定起始投料、原液、半成品和成品的產(chǎn)出比的理論數(shù)據(jù)。

（4）原液的濃縮和/或活性抗原的提取純化等工藝研究：純化和提96原液（Bulk）：系指用于制造最終配制物（Final

formulation）或半成品（Final

Bulk）的均一物質(zhì)。由一次或多次單一收獲物而得到，一般需要純化并可能配制一批或多批半成品。如屬微生物，通常視為原懸液（Bulk

Suspension）。如原液已濃縮，經(jīng)稀釋成為半成品。對于多價制品（如三價脊灰疫苗），原液是由單價原液配制而成。

原液（Bulk）：系指用于制造最終配制物（Final

for972．疫苗對佐劑的要求

目前能用于疫苗的佐劑多為氫氧化鋁，而鋁佐劑通常使疫苗產(chǎn)生的抗體滯后，且增加注射局部的副反應(yīng)幾率。如疫苗的抗原能滿足免疫的需要，則不加佐劑為宜。佐劑是非特異性免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)與抗原一起注射或預(yù)先注入機(jī)體時，可增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型。2．疫苗對佐劑的要求

目前能用于疫苗的佐劑多為氫氧化鋁，而鋁98佐劑有很多種；例如氫氧化鋁佐劑、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因子、明礬等。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑是目前動物試驗中最常用佐劑。弗氏完全佐劑是一種油包水的乳濁液，能夠非常有效的誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體。弗氏完全佐劑含結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分，可以加強(qiáng)對抗原的抗體反應(yīng)。佐劑活性來自于油滴中免疫原的持續(xù)釋放，并刺激局部免疫反應(yīng)。佐劑有很多種；例如氫氧化鋁佐劑、短小棒狀桿菌、脂多糖、細(xì)胞因99如果在終制品中使用佐劑，則對以下問題應(yīng)進(jìn)行研究，對于已經(jīng)明確有佐劑效應(yīng)或者已經(jīng)商品化的佐劑，只需提供該類制劑的組分或化學(xué)組成，國內(nèi)外使用該類制劑的情況，無需再進(jìn)行毒理和安全性研究。若國內(nèi)外均未使用過該類佐劑,則必須對其作用原理、安全性及佐劑效應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的研究并建立切實(shí)可行的評價方法。如果在終制品中使用佐劑，則對以下問題應(yīng)進(jìn)行研究，對于已經(jīng)明確100（四）疫苗的配方研究

應(yīng)對疫苗的配方進(jìn)行研究，如疫苗中添加的穩(wěn)定劑成分，緩沖液、佐劑、以及凍干疫苗的賦形劑成分等是否對疫苗造成影響。（四）疫苗的配方研究

應(yīng)對疫苗的配方進(jìn)行研究，如疫苗中添加的101四、藥理、毒理和生物分布

疫苗不同于一般的化學(xué)藥品，藥理、毒理的實(shí)驗要求具有特殊性，因此，該制品的藥理學(xué)試驗主要包括發(fā)生作用的原理、生物效價與劑量的關(guān)系、免疫程序和接種途徑與效果的關(guān)系等；在毒理學(xué)方面主要考慮接種部位和全身的病理反應(yīng)、以及機(jī)體對該疫苗的非期望的免疫應(yīng)答反應(yīng)和這種反應(yīng)的持續(xù)時間。由于以上各方面是互相關(guān)聯(lián)的，因此，應(yīng)綜合考慮藥理、毒理和免疫原性或生物效價的因素。四、藥理、毒理和生物分布

疫苗不同于一般的化學(xué)藥品，藥理、毒102應(yīng)建立適