腫瘤分子生物標志物的流式定量分析課件

腫瘤分子生物標志物的流式定量分析

1編輯課件腫瘤分子生物標志物的流式定量分析

1編輯課件近年來已經發(fā)現多種腫瘤生物分子標志物，已將標志物應用于腫瘤診斷、判定療效、預測預后和轉移等方面，且有較大的腫瘤臨床和研究的實用價值，并在研究癌變的發(fā)生和發(fā)展機制中引起人們的極大關注，特別在癌前期病變腫瘤標志物研究中，成為腫瘤防治研究的熱點之一，已經顯示出在癌變研究中具有重要意義。流式細胞應用于腫瘤分子生物標志的檢測已有較多的文獻報道，如DNA異倍體、激素受體、癌基因和抗癌基因蛋白產物等，發(fā)現這些標志物與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和細胞的分化、分級、轉移和預后有一定相關性，現分述如下：2編輯課件近年來已經發(fā)現多種腫瘤生物分子標志物，已將標志物應用于腫瘤診一、DNA異倍體

研究證明，大部分惡性腫瘤有DNA含量的異常改變(DNA含量的增多或減少)，Badogie等報道，實體瘤的異倍體檢出率在60-100%。由于腫瘤細胞在增殖分裂過程中出現DNA合成的丟失或不分離，而產生了DNA異常的細胞群，即出現DNA異常的干系(克隆)，這種DNA異常干系，即稱為DNA異倍體。流式細胞術定量分析DNA異倍體，應用于腫瘤的早期診斷和預后評價方面。

3編輯課件一、DNA異倍體研究證明，大部分惡性腫瘤有DNA含量的異常㈠癌前病變出現DNA異倍體及在癌變早期診斷的意義。

癌前期病變是腫瘤防治研究中的一個重要課題，從癌前病變中發(fā)現早期癌變的患者，并找出作為早期癌變的特征性標志物，是人們一直努力探尋的方法，使腫瘤得到早期發(fā)現、早期治療具有重要意義。研究發(fā)現，在眾多的癌前病例中，并非所有的癌前病變都將發(fā)生、發(fā)展成為癌癥。哪些癌前病變將發(fā)生癌變，哪此將不發(fā)生癌變，是人們正在努力尋找作為癌變的恃征性標志物。4編輯課件㈠癌前病變出現DNA異倍體及在癌變早期診斷的意義。癌前期病目前，從病理形態(tài)學方法對于可能癌變的病例作出一個確切的診斷標準還十分困難。

研究證明，DNA異倍體的出現可能是癌前病變發(fā)生癌變的一個重要標志物，已有作者對食管、宮頸、胃、鼻咽、口腔粘膜癌前病變進行了流式DNA倍體分析研究。Tedori等應用FCM分析了20例胃粘膜萎縮性胃炎伴不典型增生細胞的DNA倍體，發(fā)現DNA異倍體9例，其中5例在隨診半年后被病理學確診為癌變，發(fā)現異倍體與癌前病變細胞不典型增生程度有關。5編輯課件目前，從病理形態(tài)學方法對于可能癌變的病例作出一個確切的診斷標作者對208例石蠟包埋組織、和1000多例食管脫落細胞的癌前病變細胞流式DNA倍體分析(見表15)，并指出如下診斷標準，供參考。

1.出現DNA異倍體峰位診斷陽性。2.S期細胞大于15%，G2M期大于10%(突出的四倍體峰位)診斷為陽性。3.S期細胞大于10-15%，并有突出四倍體峰位，診斷為可疑癌。4.GO/1期細胞峰的CV值大于9%，作為參考指標。

6編輯課件作者對208例石蠟包埋組織、和1000多例食管脫落細胞的癌7編輯課件7編輯課件我們的研究結果(見表16)，表明DNA異倍體可能是重要的癌變標志物。

8編輯課件我們的研究結果(見表16)，表明DNA異倍體可能是重要的癌變從癌前病變中發(fā)現早期癌變和潛在癌變病例，并對其作出一個早期預警性診斷，已成為人們十分關注的研究焦點，通過對癌前病變細胞DNA異倍體的FCM檢測，可能有助于對癌前病變作出病理學診斷的超早期癌診斷。研究發(fā)現癌前病變細胞DNA含量與病變不典型增生程度密切相關(見表17)。DNA指數隨不典型增生增高逐漸漸升高，從DNA含量進一步說明癌變并非由正常細胞突發(fā)為癌細胞，而是經過一個量變到質變的過程，癌前病變即處于量變過程。

9編輯課件從癌前病變中發(fā)現早期癌變和潛在癌變病例，并對其作出一個早期預10編輯課件10編輯課件11編輯課件11編輯課件出現DNA異倍體細胞群則證明從量變到質變的過程，Tedori等認為，當癌前病變出現DNA異倍體時，說明已發(fā)生癌變或已具有潛在癌變的可能性，盡管還不具備病理形態(tài)學的癌變診斷標準，大多數研究者還發(fā)現，癌前病變不典型增生程度越重，DNA非整倍體出現率越高，不典型增生程度越重，癌變的發(fā)生率越高。由此可見，癌前病變出現DNA非整倍體對預測和診斷癌變是一個重要而有價值的標志物，對于形態(tài)學上診斷為癌前病變的病例，有必要進行DNA倍體的檢測，對出現DNA異倍體病人，應進行密切的隨訪，及時發(fā)現早期癌變征象，做到早診斷、早治療。12編輯課件出現DNA異倍體細胞群則證明從量變到質變的過程，Tedori二、抑癌基因P53蛋白

從生物分子水平研究證明，腫瘤是基因性疾病，是由某些致癌基因激活或抑癌基因的失活(突變或丟失)及其功能的調控失常而促發(fā)腫瘤，當各種致癌因子參與下誘導癌基因和抑癌基因的異常改變，其效應分子的基因蛋白產物的過量表達，它們相互之間在腫瘤的發(fā)生發(fā)展上起著重要作用。13編輯課件二、抑癌基因P53蛋白從生物分子水平研究證明，腫瘤是基因性因此，對癌基因與抗癌基因與癌變的關系研究成為腫瘤研究的熱點之一，已隨著分子生物技術的迅速發(fā)展和單克隆抗體技術的應用，大量具有高度特異性識別腫瘤細胞內外抗原的單克降抗體出現，為腫瘤研究尋找到了很多新的標志物。癌基因和抑癌基因在人體組織的調整作用，是通過其效應分子蛋白質產物。近年來，由于生產出多種高度特異的癌基因蛋白產物的單克隆抗體，為探索癌基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及與腫瘤的生物學特性關系的研究辟出了新徑。

14編輯課件因此，對癌基因與抗癌基因與癌變的關系研究成為腫瘤研究的熱點之P53基因是近年來發(fā)現的具有重要作用的抑癌基因，定位于人的17號染色體(17、13、1)其早在1979年就發(fā)現了P53基因。當時是在被惡性轉化的細胞內發(fā)現，被認為是一個原癌基因(oncogene)，因此沒有引起研究者的重視，直到1989年，一些科學家的研究有了新發(fā)現，認為P53基因存在兩種類型：即野生型(wildtype)和突變型(Mutanttype)，這兩種類型的P53基因在人體內具有兩種不同的作用。15編輯課件P53基因是近年來發(fā)現的具有重要作用的抑癌基因，定位于人的1野生型P53可以阻止細胞發(fā)生惡性轉化，并可阻止受損傷細胞DNA無法修復的細胞DNA復制過程，引起細胞凋亡(Apoptosis)或程序性細胞死亡(programcelldeath.pcd)。這一發(fā)現使人們認識到野生型P53的一個重要功能是作用細胞增殖周期的一個調控點(check-point)。野生型P53基因的丟失和突變，使P53基因正常功能喪失，而成為突變型P53基因，科學家研究認為，突變型P53可導致細胞增殖功能的增強。突變后的P53不但失去了正常調控細胞增殖分化的功能，而且可變?yōu)橐粋€直接的腫瘤基因，對細胞惡性轉化起促進作用。

16編輯課件野生型P53可以阻止細胞發(fā)生惡性轉化，并可阻止受損傷細胞D近年來的研究發(fā)現，在人類大多數惡性腫瘤中均存在P53突變基因，而且不同的致癌物可引起不同的特異性突變譜。因此P53基因的突變已引起腫瘤研究者極大關注。研究認為，癌基因致癌作用是通過其效應分子的癌基因蛋白來發(fā)揮其對細胞的轉化作用的。因此，檢測癌基因蛋白的表達量是一種極有效的研究方法。研究證明，野生型P53基因蛋白具有極不穩(wěn)定的構型，半衰期很短(約30分鐘)，因此，在正常狀態(tài)下細胞內含量甚微，一般方法很難測量到。然而，突變后的P53基因，其蛋白發(fā)生了構型上的改變，半衰期明顯延長，穩(wěn)定性增強，在細胞內形成堆積，含量增高。17編輯課件近年來的研究發(fā)現，在人類大多數惡性腫瘤中均存在P53突變基因近年來許多學者應用流式細胞免疫熒光技術并結合鼠抗人P53基因蛋白單克隆抗體，對多種人類腫瘤進行了P53基因蛋白的定量檢測，均檢出異常P53蛋白的過量表達。Morkve等應用FCM首先對石蠟包埋支氣管肺癌細胞的P53蛋白進行了定量檢測，并提出用熒光指數(FluoresenceInd-exFI)來表示P53蛋白表達量。他們的研究發(fā)現，P53的表達量與肺癌細胞的分化程度相關，未分化型的小細胞肺癌P53的表達量和陽性表達均明顯高于分化型的肺癌的P53表達量，還發(fā)現P53表達陽性的腫瘤細胞S期細胞百分比明顯高于P53表達陰性者。18編輯課件近年來許多學者應用流式細胞免疫熒光技術并結合鼠抗人P53基因由此認為，突變后的P53蛋白可能調節(jié)惡性腫瘤細胞增殖速度加快，DNA合成加速起重要作用。齊鳳英等應用FCM分析了乳癌和乳腺良性病變細胞P53蛋白表達量，發(fā)現良性病變伴有導管上皮異型增生細胞P53蛋白的表達量增高。說明P53蛋白的過量表達在乳腺正常細胞轉化一一癌變過程中起直接參與作用，揭示P53突變蛋白的表達將有可能作為癌變早期診斷的一個標志物。研究發(fā)現P53蛋白的表達量與乳癌細胞的分化程度密切相關，P53蛋白的高表達多在浸潤性乳癌，高度浸潤性生長分化差的乳癌P53表達強陽性。19編輯課件由此認為，突變后的P53蛋白可能調節(jié)惡性腫瘤細胞增殖速度加快他們還研究了乳癌P53表達量與DNA倍體和預后的關系，發(fā)現DNA異倍體乳癌P53表達量明顯高于二倍體乳癌，P53表達量高的乳癌細胞增殖活性高于P53表達量低的乳癌。研究結果表明，P53蛋白的表達量與乳癌的預后密切相關，P53陽性表達的乳癌生存期短，P53陰性表達的乳癌生存期長，認為檢測P53蛋白的表達量可作為乳癌一個實用的新的預后標志物。20編輯課件他們還研究了乳癌P53表達量與DNA倍體和預后的關系，發(fā)現D還有作者研究FCM檢測乳癌P53蛋白表達的單因素與預后的關系，發(fā)現P53陽性表達的乳癌生存期短，且常伴有淋巴結轉移的乳癌P53表達陽性，既使淋巴結無轉移，但P53表達陽性乳癌生存期亦短，證實P53突變，表達量增高可能是一個有別于其他預后因素而成為一個獨立的預后監(jiān)測指標。還有一些作者研究了膀胱癌、結直腸癌等細胞的P53表達，也證實了P53與腫瘤病理分級相關，隨病理分級的增高而P53表達增強。P53的表達與腫瘤的復發(fā)、生存率亦有關，過量表達的腫瘤患者生存期短，易復發(fā)，預后差。21編輯課件還有作者研究FCM檢測乳癌P53蛋白表達的單因素與預后的關系應用FCM檢測腫瘤P53基因蛋白的異常表達提供了客觀的量化參量，為判斷腫瘤的惡性度、預后以及指導臨床治療，提供新的腫瘤標志物。P53基因失活性突變參與了一系列人類實體癌的早期發(fā)展，業(yè)已證明P53基因突變直接影響（3階段)直腸腺瘤(包括結腸腺瘤)向直腸腺癌(包括結腸腺癌)的轉化。從臨床腫瘤學的觀點P53基因突變是處在癌變前的階段。但從癌癥發(fā)生的全過程來看，P53基因突變是處于癌癥發(fā)生與發(fā)展的中后階段(如圖26)。

22編輯課件應用FCM檢測腫瘤P53基因蛋白的異常表達提供了客觀的量化參圖－26結直腸癌的多階段發(fā)生過程23編輯課件圖－26結直腸癌的多階段發(fā)生過程23編輯課件至今癌癥的確診主要依靠細胞病理學，大多不能分辨癌癥的病因，發(fā)現P53特征性突變將有可能使癌癥的研究從細胞水平進入分子水平，從能確診癌的細胞病理學進入能分析基因特征結構的分子生物學，流式細胞技術是能保持細胞和亞細胞成分的完整生活狀態(tài)下，進行定量分子分析方法。并可為其他分析技術，提供富集制樣基礎，無疑地，它將為上述轉變提供重要的技術基礎。

24編輯課件至今癌癥的確診主要依靠細胞病理學，大多不能分辨癌癥的病因，發(fā)三、癌基因蛋白產物

㈠

rasP21蛋白

自八十年代發(fā)現ras原癌基因以來，腫瘤研究人員對其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用進行了深入的研究，發(fā)現多種人類腫瘤中存在ras癌基因的激活，認為ras基因在腫瘤發(fā)生的生物機制中起著十分重要的作用，并發(fā)現與人類腫瘤的早期發(fā)生和預后有關，所以ras癌基因的激活和其蛋白P21的表達研究已成為目前研究的熱點之一。25編輯課件三、癌基因蛋白產物㈠rasP21蛋白

25編輯課件在眾多的癌基因中，人們最關注、研究最深入的是ras原癌基因。在人類惡性腫瘤中，最常見的癌基因之一，ras基因的激活能啟動和加速細胞的生長、增殖以致引發(fā)細胞的惡性轉化，ras原癌基因族(K-ras、N-ras、Ha-ras)P21蛋白產物是一種共同表達的蛋白。

研究證明，ras癌基因的激活與細胞惡性轉化有關，當癌變發(fā)生時，ras癌基因首先激活，P21蛋白常出現過量表達，rasP21蛋白已被證明在各種人類腫瘤(乳腺癌、肺癌、胃癌)有過量表達。26編輯課件在眾多的癌基因中，人們最關注、研究最深入的是ras原癌基因。有作者應用FCM定量分析了膀胱早期癌P21蛋白的表達含量，發(fā)現早期癌病變中的P21蛋白表達增高，認為P21蛋白是腫瘤早期階段的標志物，推測ras癌基因在腫瘤早期就已激活，并隨著腫瘤的發(fā)展，進一步參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。還有作者應用流式細胞術定量研究胃癌前病變，口腔癌前病變的rasP21蛋臼的表達，發(fā)現rasP21蛋白的表達量與癌前病變不典型增生程度密切相關，說明ras癌基因的激活，在癌變過程中起重要作用，而隨不典型增生程度的加重，其表達量逐漸增高。認為rasP21蛋白的表達量有希望成為癌變早期診斷的一個標志物。27編輯課件有作者應用FCM定量分析了膀胱早期癌P21蛋白的表達含量，發(fā)同時還發(fā)現P21蛋白的表達量與胃癌惡性程度無關，與口腔癌惡性分級有關，但大多數研究證明，rasP21表達是與腫瘤的DNA倍體相關，DNA異倍體的腫瘤P21表達量明顯高于DNA二倍體的腫瘤，說明rasP21的表達量多少，明顯地調控及影響著惡性細胞DNA合成及其DNA含量的異常改變。P21的表達與腫瘤的增殖分裂具有極好的相關性，表達陽性的腫瘤其S期百分率明顯高于表達陰性的腫瘤。說明rasP21蛋白在腫瘤生長增殖過程中起著重要調控作用。28編輯課件同時還發(fā)現P21蛋白的表達量與胃癌惡性程度無關，與口腔癌惡性大多定量研究rasP21表達量的報道證實P21蛋白的表達與腫瘤病人的預后密切相關，有作者在對膀胱癌的研究結果發(fā)現，P21蛋白表達量高(或表達陽性)復發(fā)率及死亡率明顯高于陰性表達者，且存活期短，說明P21的過量表達，預示腫瘤具有更惡性生物學行為，揭示腫瘤易復發(fā)，預后不良。有些作者認為，P21表達量檢測，可以作為腫瘤復發(fā)的一個早期信號，如果結合病理分級、臨床分期和P21的定量分析，綜合性的判斷惡性腫瘤病人的預后，對評價預后無疑具有十分重要的意義。

29編輯課件大多定量研究rasP21表達量的報道證實P21蛋白的表達與㈡癌基因C-erbB-2蛋白產物癌基因C-erbB-2位于17號染色體Q21區(qū)帶上，編碼分子為185－190k。有作者研究認為，C-erbB-2癌基因活化，其蛋白產物過量表達在癌癥的發(fā)生機制中起重要作用。近來有人發(fā)現C-erbB-2基因蛋白過量表達和乳腺癌的轉化機制有特殊關系，他們用NIH/3T3細胞做轉染實驗，發(fā)現C-erbB-2基因具有促發(fā)腫瘤的作用，C-erbB-2蛋白的過量表達，使細胞增殖失去調控，促進細胞惡性轉化。30編輯課件㈡癌基因C-erbB-2蛋白產物癌基因C-erbB-2位于目前研究最多是c-erbB-2癌基因蛋白與乳腺癌的關系，很多文獻報道了C-erbB-2在乳癌細胞中的過量表達與乳癌的組織分級，淋巴結轉移及激素受體、細胞增殖周期和DNA倍體以及和臨床預后關系。有人應用流式細胞術的免疫熒光技術定量研究了乳腺癌、乳腺囊性增生和囊性增生癌變細胞的C-erbB-2蛋白表達，發(fā)現囊性增生和囊增癌變細胞的C-erbB-2蛋白表達量逐漸增高，提示在囊性增生并癌變的過程中，C-erbB-2蛋白的過量表達是早期癌變的一個標志物，可作為乳癌早期診斷的一個參考指標。

31編輯課件目前研究最多是c-erbB-2癌基因蛋白與乳腺癌的關系，很多他們的研究還發(fā)現，C-erbB-2蛋白過量表達的乳癌，DNA含量常為異倍體，且增殖指數也增高。說明C-erbB-2蛋白過量表達對加速細胞DNA合成和細胞增殖有重要作用，大部分研究報道認為，乳腺癌細胞中C-erbB-2蛋白的表達與如下參量有關：

32編輯課件他們的研究還發(fā)現，C-erbB-2蛋白過量表達的乳癌，DNA①與組織學分級有關，隨分級的增高，C-erbB-2呈現高表達。②與淋巴結轉移和無轉移有關。③與DNA倍體有關，二倍體腫瘤表達量低，異倍體腫瘤表達高。④與雌激素受體有關，C-erbB-2蛋白過量表達的乳癌，受體常為陰性。而表達量低的乳癌，受體常為陽性。⑤與臨床預后有關，C-erbB-2表達過量的乳癌，無病生存期和總存活期明顯縮短，常出現腫瘤復發(fā)，而C-erbB-2蛋白表達量低，預后較好，認為是一個重要的預后參數。

33編輯課件①與組織學分級有關，隨分級的增高，C-erbB-2呈現高表達四、腫瘤轉移基因CD44CD44基因位于人類11號染色體的短臂上，可分為兩種類型，按其外顯子表達方式，可稱為組成型CD44S和變異型CD44V。研究表明，正常情況下，CD44S基因蛋白是廣泛存在細胞膜的跨膜糖蛋白，在大多數上皮細胞、間質細胞和淋巴細胞等均可以檢測到該糖蛋白的表達，研究發(fā)現，CD44基因蛋白的作用，主要參與細胞與細胞、細胞與基質之間的特異性連接，有如下功用:

34編輯課件四、腫瘤轉移基因CD44CD44基因位于人類11號染色體的短①介導淋巴細胞與毛細血管的小靜脈內皮細胞的結合。②參與淋巴細胞的活化。③能與細胞外基質中的透明質酸膠原蛋白、纖維粘連蛋白、層連蛋白分子結合。④參與細胞骨架蛋白結合，使細胞偽足形成，參與細胞遷移運動。變異型CD44V基因與腫瘤轉移的關系，是近期人們最新的實驗中發(fā)現的，目前已成為研究腫瘤轉移的一個新的熱點課題。

35編輯課件①介導淋巴細胞與毛細血管的小靜脈內皮細胞的結合。35編輯課件研究發(fā)現，正常組織中和沒有轉移能力的惡性細胞主要有

CD44S基因蛋白表達，而具有轉移能力的惡性細胞主要是變異型CD44V基因蛋白的高表達，但在正常上皮細胞中變異型CD44V僅有很弱的表達，確切證實變異型CD44V基因與腫瘤轉移有關，是在1991年德國學者Gunth-er等首先報道了他們突破性研究結果。他們從大鼠胰腺癌細胞中分離到了具有轉移能力的細胞株和沒有轉移能力的細胞株，然后用具有轉移能力的細胞膜蛋白作為抗原，制備出了單抗腫瘤細胞與抗體結合，而不與沒有轉移能力的細胞結合，經過對這一單抗的序列分析后證實為變異型CD44V基因蛋白。

36編輯課件研究發(fā)現，正常組織中和沒有轉移能力的惡性細胞主要有CD44將變異型CD44V基因首先用于臨床腫瘤標本的研究是英國學者Matsumura和他的同事們，他們檢測了乳腺癌和結腸癌，發(fā)現轉移癌都有高水平的CD44V表達而從非轉移癌細胞僅能檢出很弱的表達。最近有學者應用流式細胞術和抗人CD44單克隆抗體，對種植于小鼠體內黑色素瘤細胞進行了研究分析，認為CD44在腫瘤的生長和轉移機制中具有重要作用。37編輯課件將變異型CD44V基因首先用于臨床腫瘤標本的研究是英國學者M我們應用流式細胞術分析了膀胱癌，乳腺癌細胞的變異型CD44V基因蛋白產物的表達，發(fā)現有淋巴結轉移的乳癌均有強的表達量，無淋巴結轉移的乳癌僅有較弱的表達量。變異型CD44基因蛋白的表達和腫瘤轉移的關系的研究尚處于初步研究階段。

有許多未知有待更深入的探討，相信隨著CD44基因的研究進一步深入將會為腫瘤的轉移和診斷提供新的標志物。

38編輯課件我們應用流式細胞術分析了膀胱癌，乳腺癌細胞的變異型CD44V五、血型糖蛋白A(GlyCopt1orinA.GPA)

人類體細胞突變的發(fā)生，及其在癌發(fā)生的生物分子機制中的作用研究，越來越引起腫瘤學者的極大關注。當人體遭受到致癌因子的損害后，存在于骨髓中的紅系造血干細胞的血型糖蛋白A基因位點發(fā)生突變，并產生變異的子代紅細胞，這種改變可成為一種標記而長期保留下來，而形成紅細胞變異株。變異株紅細胞表面所攜帶有GPA抗原(即

M/N血型決定簇)，這種變異的GPA抗原物質是一種特異性的標志物，它的一對等位基因位于染色體4Q28-31。

39編輯課件五、血型糖蛋白A(GlyCopt1orinA.GPA)目前，已經分離克隆出抗變異型紅細胞GPA的單克隆抗體，用熒光探針標記這些抗體就可用流式細胞術檢測這些血液中紅細胞的GPA變異株的頻率，為研究人類活體細胞突變找到一個簡便的新方法。有作者使用流式細胞術并結合抗GPA變異型單克隆抗體，對食管癌前病變患者紅細胞膜GPA的表達和變異株頻率進行了檢測，發(fā)現癌前病變患者的M/N血型的變異株GPA表達明顯高于正常人，說明GPA變異株的檢測頻率，對有癌變傾向的個體，可作為一個有重要意義的監(jiān)測標志物。

40編輯課件目前，已經分離克隆出抗變異型紅細胞GPA的單克隆抗體，用熒光也有學者將FCM-GPA表達的檢測應用于放射線損害和腫瘤化療藥物引起人類體細胞突變的檢測，發(fā)現在日本廣島原子彈爆炸后的幸存者中，其GPA變異紅細胞頻率與其爆炸時(1945年)的受輻射劑量相關，至今已40多年后的幸存者，其骨髓紅系造血干細胞GPA位點上仍有突變點并仍可檢出變異的子代細胞。這種FCM檢測紅細胞膜上GPA變異株的方法，比其他檢測體細胞突變的方法(DNA修復試驗，微核檢測，染色體畸變率檢測等，這些方法都需要在體外進行細胞培養(yǎng)，需要幾天或幾周時間才可得出結果)有很大優(yōu)點?？芍苯訌幕铙w取少量全血，在1-2小時之內就可檢出結果，可應用于大量人群體細胞突變的研究，為腫瘤的早期診斷和防治工作提供新的線索和依據。

41編輯課件也有學者將FCM-GPA表達的檢測應用于放射線損害和腫瘤化療六、腫瘤多藥抗藥性基因蛋白的流式分析

多抗藥性(Multidrugresistant，Mdr)基因蛋白P－糖白是近年來的腫瘤抗藥性的分子學基礎。腫瘤細胞的抗藥性具有極復雜的分子生物機制，是影響腫瘤化療療效的主要障礙，腫瘤細胞一旦對一種化療藥物產生抗性，對其他結構和功能不同的化療藥物也會產生抗藥現象(即為多抗藥性)。因此腫瘤多抗藥性的研究尤其引人重視。

42編輯課件六、腫瘤多藥抗藥性基因蛋白的流式分析多抗藥性(Multid80年代中期已經有人從Mdr細胞株中分離出人類Mdr基因，其基因產物的編碼為P-糖蛋白，并將人類多抗藥基因轉染小鼠NIH3T3細胞，得到了多抗藥性的細胞株，用抗P-糖蛋白的特異性單克隆抗體檢出了該細胞株有人類Mdr基因蛋白產物的表達，進一步證實了P-糖蛋白是產生多抗藥性的物質基礎。P-糖蛋白介導多抗藥基因，在人類分兩型，即Mdr1型、Mdr2型，均位于人的7號染色體上，Mdr1型和Mdr2型基因產物具有80%的同源性，但經過基因轉染試驗證實Mdr2基因產物與多抗藥性無關，但Mdr2的作用和生理功能有待進一步探討。

43編輯課件80年代中期已經有人從Mdr細胞株中分離出人類Mdr基因，其Mdr1型是與腫瘤多抗藥性有關的重要基因之一，P-170kd糖蛋白是Mdr1型基因表型的分子基礎，它具有ATP依賴性主動轉運泵的功能，可將藥物從細胞中泵出，從而降低細胞內的藥物濃度，P-糖蛋白是一種跨膜蛋白分子，主要分布在胞漿膜內一側，僅有很少一部分分子在細胞膜表面。近年來，已經對P-糖蛋白與臨床腫瘤多抗藥性的關系進行了大量的探索，并已克隆產生了抗P-糖蛋白的單克隆抗體，現在已有售出商品的單抗，由Malvern等生產的抗P-170糖蛋白C219單抗、Scheper等生產的JSB-1單抗、VictorLing等生產的Ab-1多克隆抗體，這些抗體的問世，大大推動了腫瘤多抗藥性的研究工作。

44編輯課件Mdr1型是與腫瘤多抗藥性有關的重要基因之一，P-170kd最近幾年，又將流式細胞術應用到測定腫瘤細胞多抗藥性的研究，有作者認為，FCM定量測定P-糖蛋白的表達量和測定藥物的溢出量可能是檢測人類腫瘤多抗藥基因表達的最好方法，Maslak應用FCM定量分析了64例白血病患者P-糖蛋白表達，其中32例新診斷未經任何治療的病人僅有8例表達陽性，32例緩解后又復發(fā)的白血病人有22例P-糖蛋白表達陽性，同時他們還研究用柔紅霉素誘導治療下的藥物蓄積量試驗，發(fā)現P-糖蛋白表達陽性的病人，柔紅霉素藥在細胞內的蓄積量明顯少于P-糖蛋白表達陰性的患者(見圖28)45編輯課件最近幾年，又將流式細胞術應用到測定腫瘤細胞多抗藥性的研究，有他們還使用了Mdr表型P-Gp的拮抗劑異搏停，結果發(fā)現使用拮抗劑異搏停后，柔紅霉素在細胞內的蓄積量明顯增加，用拮抗劑后與臨床治療反應明顯相關，他們的研究結果揭示出：①新診斷未經治療的腫瘤病人P-糖蛋白也可以表達陽性②緩解后復發(fā)的白血病人有69%的患者存在P-Gp陽性表達③P-Gp表達陽性的復發(fā)的白血病人，影響其治療效果④P-Gp的高表達與其藥物溢出泵的功能相關。

46編輯課件他們還使用了Mdr表型P-Gp的拮抗劑異搏停，結果發(fā)現使用拮大多數研究證明，P-Gp表達水平高的腫瘤病人對化療不敏感，療效差，緩解率低，提示P-Gp的高表達與腫瘤的抗藥相關。但在臨床實踐過程中，同時也發(fā)現P-Gp的陰性表達或很弱的表達的腫瘤病人對化療反應不佳，因此，人們推測，在具有抗藥性的腫瘤細胞中，P-Gp是腫瘤多抗藥性中的一種生物分子機制?？赡苓€有存在其他抗藥機制，即非P-Gp介導下的抗藥作用，稱為非典型的多抗藥性。

47編輯課件大多數研究證明，P-Gp表達水平高的腫瘤病人對化療不敏感，療最近研究發(fā)現，谷脫甘肽-S-轉移酶基因蛋白與多抗藥性有關，其中主要是GST－∏起抗藥性，其主要抗藥機制與P-Gp不同，它主要以解毒方式起到抗藥作用，當化療藥物進入細胞內，產生損害細胞的自由基，GST－∏則與自由基結合，使其失去損害細胞的作用，而發(fā)揮其抗藥功能。有人研究認為，GST－∏的多抗藥性與P-Gp產生抗藥無關，它是人類細胞內產生抗藥的另一個耐藥基因。48編輯課件最近研究發(fā)現，谷脫甘肽-S-轉移酶基因蛋白與多抗藥性有關，其研究腫瘤多抗藥性，對于揭示腫瘤細胞的抗藥機制具有重要意義，對腫瘤細胞抗藥基因蛋白檢測，使人們進一步了解抗藥基因與抗藥性的關系，另一方面人們可以設法尋找對抗耐藥的措施，以大大提高腫瘤的治療效果。近年來已發(fā)現了許多種拮抗多抗藥性的藥物，已有人報道了異搏停、喹寧、喹啉類衍生物等，都具有阻斷P-Gp外排藥物的作用，使耐藥基因失去溢出泵的作用，細胞Mdr基因表型也消失，為腫瘤臨床化療將展示更好的前景。

49編輯課件研究腫瘤多抗藥性，對于揭示腫瘤細胞的抗藥機制具有重要意義，對腫瘤分子生物標志物的流式定量分析

50編輯課件腫瘤分子生物標志物的流式定量分析

1編輯課件近年來已經發(fā)現多種腫瘤生物分子標志物，已將標志物應用于腫瘤診斷、判定療效、預測預后和轉移等方面，且有較大的腫瘤臨床和研究的實用價值，并在研究癌變的發(fā)生和發(fā)展機制中引起人們的極大關注，特別在癌前期病變腫瘤標志物研究中，成為腫瘤防治研究的熱點之一，已經顯示出在癌變研究中具有重要意義。流式細胞應用于腫瘤分子生物標志的檢測已有較多的文獻報道，如DNA異倍體、激素受體、癌基因和抗癌基因蛋白產物等，發(fā)現這些標志物與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和細胞的分化、分級、轉移和預后有一定相關性，現分述如下：51編輯課件近年來已經發(fā)現多種腫瘤生物分子標志物，已將標志物應用于腫瘤診一、DNA異倍體

研究證明，大部分惡性腫瘤有DNA含量的異常改變(DNA含量的增多或減少)，Badogie等報道，實體瘤的異倍體檢出率在60-100%。由于腫瘤細胞在增殖分裂過程中出現DNA合成的丟失或不分離，而產生了DNA異常的細胞群，即出現DNA異常的干系(克隆)，這種DNA異常干系，即稱為DNA異倍體。流式細胞術定量分析DNA異倍體，應用于腫瘤的早期診斷和預后評價方面。

52編輯課件一、DNA異倍體研究證明，大部分惡性腫瘤有DNA含量的異常㈠癌前病變出現DNA異倍體及在癌變早期診斷的意義。

癌前期病變是腫瘤防治研究中的一個重要課題，從癌前病變中發(fā)現早期癌變的患者，并找出作為早期癌變的特征性標志物，是人們一直努力探尋的方法，使腫瘤得到早期發(fā)現、早期治療具有重要意義。研究發(fā)現，在眾多的癌前病例中，并非所有的癌前病變都將發(fā)生、發(fā)展成為癌癥。哪些癌前病變將發(fā)生癌變，哪此將不發(fā)生癌變，是人們正在努力尋找作為癌變的恃征性標志物。53編輯課件㈠癌前病變出現DNA異倍體及在癌變早期診斷的意義。癌前期病目前，從病理形態(tài)學方法對于可能癌變的病例作出一個確切的診斷標準還十分困難。

研究證明，DNA異倍體的出現可能是癌前病變發(fā)生癌變的一個重要標志物，已有作者對食管、宮頸、胃、鼻咽、口腔粘膜癌前病變進行了流式DNA倍體分析研究。Tedori等應用FCM分析了20例胃粘膜萎縮性胃炎伴不典型增生細胞的DNA倍體，發(fā)現DNA異倍體9例，其中5例在隨診半年后被病理學確診為癌變，發(fā)現異倍體與癌前病變細胞不典型增生程度有關。54編輯課件目前，從病理形態(tài)學方法對于可能癌變的病例作出一個確切的診斷標作者對208例石蠟包埋組織、和1000多例食管脫落細胞的癌前病變細胞流式DNA倍體分析(見表15)，并指出如下診斷標準，供參考。

1.出現DNA異倍體峰位診斷陽性。2.S期細胞大于15%，G2M期大于10%(突出的四倍體峰位)診斷為陽性。3.S期細胞大于10-15%，并有突出四倍體峰位，診斷為可疑癌。4.GO/1期細胞峰的CV值大于9%，作為參考指標。

55編輯課件作者對208例石蠟包埋組織、和1000多例食管脫落細胞的癌56編輯課件7編輯課件我們的研究結果(見表16)，表明DNA異倍體可能是重要的癌變標志物。

57編輯課件我們的研究結果(見表16)，表明DNA異倍體可能是重要的癌變從癌前病變中發(fā)現早期癌變和潛在癌變病例，并對其作出一個早期預警性診斷，已成為人們十分關注的研究焦點，通過對癌前病變細胞DNA異倍體的FCM檢測，可能有助于對癌前病變作出病理學診斷的超早期癌診斷。研究發(fā)現癌前病變細胞DNA含量與病變不典型增生程度密切相關(見表17)。DNA指數隨不典型增生增高逐漸漸升高，從DNA含量進一步說明癌變并非由正常細胞突發(fā)為癌細胞，而是經過一個量變到質變的過程，癌前病變即處于量變過程。

58編輯課件從癌前病變中發(fā)現早期癌變和潛在癌變病例，并對其作出一個早期預59編輯課件10編輯課件60編輯課件11編輯課件出現DNA異倍體細胞群則證明從量變到質變的過程，Tedori等認為，當癌前病變出現DNA異倍體時，說明已發(fā)生癌變或已具有潛在癌變的可能性，盡管還不具備病理形態(tài)學的癌變診斷標準，大多數研究者還發(fā)現，癌前病變不典型增生程度越重，DNA非整倍體出現率越高，不典型增生程度越重，癌變的發(fā)生率越高。由此可見，癌前病變出現DNA非整倍體對預測和診斷癌變是一個重要而有價值的標志物，對于形態(tài)學上診斷為癌前病變的病例，有必要進行DNA倍體的檢測，對出現DNA異倍體病人，應進行密切的隨訪，及時發(fā)現早期癌變征象，做到早診斷、早治療。61編輯課件出現DNA異倍體細胞群則證明從量變到質變的過程，Tedori二、抑癌基因P53蛋白

從生物分子水平研究證明，腫瘤是基因性疾病，是由某些致癌基因激活或抑癌基因的失活(突變或丟失)及其功能的調控失常而促發(fā)腫瘤，當各種致癌因子參與下誘導癌基因和抑癌基因的異常改變，其效應分子的基因蛋白產物的過量表達，它們相互之間在腫瘤的發(fā)生發(fā)展上起著重要作用。62編輯課件二、抑癌基因P53蛋白從生物分子水平研究證明，腫瘤是基因性因此，對癌基因與抗癌基因與癌變的關系研究成為腫瘤研究的熱點之一，已隨著分子生物技術的迅速發(fā)展和單克隆抗體技術的應用，大量具有高度特異性識別腫瘤細胞內外抗原的單克降抗體出現，為腫瘤研究尋找到了很多新的標志物。癌基因和抑癌基因在人體組織的調整作用，是通過其效應分子蛋白質產物。近年來，由于生產出多種高度特異的癌基因蛋白產物的單克隆抗體，為探索癌基因與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及與腫瘤的生物學特性關系的研究辟出了新徑。

63編輯課件因此，對癌基因與抗癌基因與癌變的關系研究成為腫瘤研究的熱點之P53基因是近年來發(fā)現的具有重要作用的抑癌基因，定位于人的17號染色體(17、13、1)其早在1979年就發(fā)現了P53基因。當時是在被惡性轉化的細胞內發(fā)現，被認為是一個原癌基因(oncogene)，因此沒有引起研究者的重視，直到1989年，一些科學家的研究有了新發(fā)現，認為P53基因存在兩種類型：即野生型(wildtype)和突變型(Mutanttype)，這兩種類型的P53基因在人體內具有兩種不同的作用。64編輯課件P53基因是近年來發(fā)現的具有重要作用的抑癌基因，定位于人的1野生型P53可以阻止細胞發(fā)生惡性轉化，并可阻止受損傷細胞DNA無法修復的細胞DNA復制過程，引起細胞凋亡(Apoptosis)或程序性細胞死亡(programcelldeath.pcd)。這一發(fā)現使人們認識到野生型P53的一個重要功能是作用細胞增殖周期的一個調控點(check-point)。野生型P53基因的丟失和突變，使P53基因正常功能喪失，而成為突變型P53基因，科學家研究認為，突變型P53可導致細胞增殖功能的增強。突變后的P53不但失去了正常調控細胞增殖分化的功能，而且可變?yōu)橐粋€直接的腫瘤基因，對細胞惡性轉化起促進作用。

65編輯課件野生型P53可以阻止細胞發(fā)生惡性轉化，并可阻止受損傷細胞D近年來的研究發(fā)現，在人類大多數惡性腫瘤中均存在P53突變基因，而且不同的致癌物可引起不同的特異性突變譜。因此P53基因的突變已引起腫瘤研究者極大關注。研究認為，癌基因致癌作用是通過其效應分子的癌基因蛋白來發(fā)揮其對細胞的轉化作用的。因此，檢測癌基因蛋白的表達量是一種極有效的研究方法。研究證明，野生型P53基因蛋白具有極不穩(wěn)定的構型，半衰期很短(約30分鐘)，因此，在正常狀態(tài)下細胞內含量甚微，一般方法很難測量到。然而，突變后的P53基因，其蛋白發(fā)生了構型上的改變，半衰期明顯延長，穩(wěn)定性增強，在細胞內形成堆積，含量增高。66編輯課件近年來的研究發(fā)現，在人類大多數惡性腫瘤中均存在P53突變基因近年來許多學者應用流式細胞免疫熒光技術并結合鼠抗人P53基因蛋白單克隆抗體，對多種人類腫瘤進行了P53基因蛋白的定量檢測，均檢出異常P53蛋白的過量表達。Morkve等應用FCM首先對石蠟包埋支氣管肺癌細胞的P53蛋白進行了定量檢測，并提出用熒光指數(FluoresenceInd-exFI)來表示P53蛋白表達量。他們的研究發(fā)現，P53的表達量與肺癌細胞的分化程度相關，未分化型的小細胞肺癌P53的表達量和陽性表達均明顯高于分化型的肺癌的P53表達量，還發(fā)現P53表達陽性的腫瘤細胞S期細胞百分比明顯高于P53表達陰性者。67編輯課件近年來許多學者應用流式細胞免疫熒光技術并結合鼠抗人P53基因由此認為，突變后的P53蛋白可能調節(jié)惡性腫瘤細胞增殖速度加快，DNA合成加速起重要作用。齊鳳英等應用FCM分析了乳癌和乳腺良性病變細胞P53蛋白表達量，發(fā)現良性病變伴有導管上皮異型增生細胞P53蛋白的表達量增高。說明P53蛋白的過量表達在乳腺正常細胞轉化一一癌變過程中起直接參與作用，揭示P53突變蛋白的表達將有可能作為癌變早期診斷的一個標志物。研究發(fā)現P53蛋白的表達量與乳癌細胞的分化程度密切相關，P53蛋白的高表達多在浸潤性乳癌，高度浸潤性生長分化差的乳癌P53表達強陽性。68編輯課件由此認為，突變后的P53蛋白可能調節(jié)惡性腫瘤細胞增殖速度加快他們還研究了乳癌P53表達量與DNA倍體和預后的關系，發(fā)現DNA異倍體乳癌P53表達量明顯高于二倍體乳癌，P53表達量高的乳癌細胞增殖活性高于P53表達量低的乳癌。研究結果表明，P53蛋白的表達量與乳癌的預后密切相關，P53陽性表達的乳癌生存期短，P53陰性表達的乳癌生存期長，認為檢測P53蛋白的表達量可作為乳癌一個實用的新的預后標志物。69編輯課件他們還研究了乳癌P53表達量與DNA倍體和預后的關系，發(fā)現D還有作者研究FCM檢測乳癌P53蛋白表達的單因素與預后的關系，發(fā)現P53陽性表達的乳癌生存期短，且常伴有淋巴結轉移的乳癌P53表達陽性，既使淋巴結無轉移，但P53表達陽性乳癌生存期亦短，證實P53突變，表達量增高可能是一個有別于其他預后因素而成為一個獨立的預后監(jiān)測指標。還有一些作者研究了膀胱癌、結直腸癌等細胞的P53表達，也證實了P53與腫瘤病理分級相關，隨病理分級的增高而P53表達增強。P53的表達與腫瘤的復發(fā)、生存率亦有關，過量表達的腫瘤患者生存期短，易復發(fā)，預后差。70編輯課件還有作者研究FCM檢測乳癌P53蛋白表達的單因素與預后的關系應用FCM檢測腫瘤P53基因蛋白的異常表達提供了客觀的量化參量，為判斷腫瘤的惡性度、預后以及指導臨床治療，提供新的腫瘤標志物。P53基因失活性突變參與了一系列人類實體癌的早期發(fā)展，業(yè)已證明P53基因突變直接影響（3階段)直腸腺瘤(包括結腸腺瘤)向直腸腺癌(包括結腸腺癌)的轉化。從臨床腫瘤學的觀點P53基因突變是處在癌變前的階段。但從癌癥發(fā)生的全過程來看，P53基因突變是處于癌癥發(fā)生與發(fā)展的中后階段(如圖26)。

71編輯課件應用FCM檢測腫瘤P53基因蛋白的異常表達提供了客觀的量化參圖－26結直腸癌的多階段發(fā)生過程72編輯課件圖－26結直腸癌的多階段發(fā)生過程23編輯課件至今癌癥的確診主要依靠細胞病理學，大多不能分辨癌癥的病因，發(fā)現P53特征性突變將有可能使癌癥的研究從細胞水平進入分子水平，從能確診癌的細胞病理學進入能分析基因特征結構的分子生物學，流式細胞技術是能保持細胞和亞細胞成分的完整生活狀態(tài)下，進行定量分子分析方法。并可為其他分析技術，提供富集制樣基礎，無疑地，它將為上述轉變提供重要的技術基礎。

73編輯課件至今癌癥的確診主要依靠細胞病理學，大多不能分辨癌癥的病因，發(fā)三、癌基因蛋白產物

㈠

rasP21蛋白

自八十年代發(fā)現ras原癌基因以來，腫瘤研究人員對其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用進行了深入的研究，發(fā)現多種人類腫瘤中存在ras癌基因的激活，認為ras基因在腫瘤發(fā)生的生物機制中起著十分重要的作用，并發(fā)現與人類腫瘤的早期發(fā)生和預后有關，所以ras癌基因的激活和其蛋白P21的表達研究已成為目前研究的熱點之一。74編輯課件三、癌基因蛋白產物㈠rasP21蛋白

25編輯課件在眾多的癌基因中，人們最關注、研究最深入的是ras原癌基因。在人類惡性腫瘤中，最常見的癌基因之一，ras基因的激活能啟動和加速細胞的生長、增殖以致引發(fā)細胞的惡性轉化，ras原癌基因族(K-ras、N-ras、Ha-ras)P21蛋白產物是一種共同表達的蛋白。

研究證明，ras癌基因的激活與細胞惡性轉化有關，當癌變發(fā)生時，ras癌基因首先激活，P21蛋白常出現過量表達，rasP21蛋白已被證明在各種人類腫瘤(乳腺癌、肺癌、胃癌)有過量表達。75編輯課件在眾多的癌基因中，人們最關注、研究最深入的是ras原癌基因。有作者應用FCM定量分析了膀胱早期癌P21蛋白的表達含量，發(fā)現早期癌病變中的P21蛋白表達增高，認為P21蛋白是腫瘤早期階段的標志物，推測ras癌基因在腫瘤早期就已激活，并隨著腫瘤的發(fā)展，進一步參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。還有作者應用流式細胞術定量研究胃癌前病變，口腔癌前病變的rasP21蛋臼的表達，發(fā)現rasP21蛋白的表達量與癌前病變不典型增生程度密切相關，說明ras癌基因的激活，在癌變過程中起重要作用，而隨不典型增生程度的加重，其表達量逐漸增高。認為rasP21蛋白的表達量有希望成為癌變早期診斷的一個標志物。76編輯課件有作者應用FCM定量分析了膀胱早期癌P21蛋白的表達含量，發(fā)同時還發(fā)現P21蛋白的表達量與胃癌惡性程度無關，與口腔癌惡性分級有關，但大多數研究證明，rasP21表達是與腫瘤的DNA倍體相關，DNA異倍體的腫瘤P21表達量明顯高于DNA二倍體的腫瘤，說明rasP21的表達量多少，明顯地調控及影響著惡性細胞DNA合成及其DNA含量的異常改變。P21的表達與腫瘤的增殖分裂具有極好的相關性，表達陽性的腫瘤其S期百分率明顯高于表達陰性的腫瘤。說明rasP21蛋白在腫瘤生長增殖過程中起著重要調控作用。77編輯課件同時還發(fā)現P21蛋白的表達量與胃癌惡性程度無關，與口腔癌惡性大多定量研究rasP21表達量的報道證實P21蛋白的表達與腫瘤病人的預后密切相關，有作者在對膀胱癌的研究結果發(fā)現，P21蛋白表達量高(或表達陽性)復發(fā)率及死亡率明顯高于陰性表達者，且存活期短，說明P21的過量表達，預示腫瘤具有更惡性生物學行為，揭示腫瘤易復發(fā)，預后不良。有些作者認為，P21表達量檢測，可以作為腫瘤復發(fā)的一個早期信號，如果結合病理分級、臨床分期和P21的定量分析，綜合性的判斷惡性腫瘤病人的預后，對評價預后無疑具有十分重要的意義。

78編輯課件大多定量研究rasP21表達量的報道證實P21蛋白的表達與㈡癌基因C-erbB-2蛋白產物癌基因C-erbB-2位于17號染色體Q21區(qū)帶上，編碼分子為185－190k。有作者研究認為，C-erbB-2癌基因活化，其蛋白產物過量表達在癌癥的發(fā)生機制中起重要作用。近來有人發(fā)現C-erbB-2基因蛋白過量表達和乳腺癌的轉化機制有特殊關系，他們用NIH/3T3細胞做轉染實驗，發(fā)現C-erbB-2基因具有促發(fā)腫瘤的作用，C-erbB-2蛋白的過量表達，使細胞增殖失去調控，促進細胞惡性轉化。79編輯課件㈡癌基因C-erbB-2蛋白產物癌基因C-erbB-2位于目前研究最多是c-erbB-2癌基因蛋白與乳腺癌的關系，很多文獻報道了C-erbB-2在乳癌細胞中的過量表達與乳癌的組織分級，淋巴結轉移及激素受體、細胞增殖周期和DNA倍體以及和臨床預后關系。有人應用流式細胞術的免疫熒光技術定量研究了乳腺癌、乳腺囊性增生和囊性增生癌變細胞的C-erbB-2蛋白表達，發(fā)現囊性增生和囊增癌變細胞的C-erbB-2蛋白表達量逐漸增高，提示在囊性增生并癌變的過程中，C-erbB-2蛋白的過量表達是早期癌變的一個標志物，可作為乳癌早期診斷的一個參考指標。

80編輯課件目前研究最多是c-erbB-2癌基因蛋白與乳腺癌的關系，很多他們的研究還發(fā)現，C-erbB-2蛋白過量表達的乳癌，DNA含量常為異倍體，且增殖指數也增高。說明C-erbB-2蛋白過量表達對加速細胞DNA合成和細胞增殖有重要作用，大部分研究報道認為，乳腺癌細胞中C-erbB-2蛋白的表達與如下參量有關：

81編輯課件他們的研究還發(fā)現，C-erbB-2蛋白過量表達的乳癌，DNA①與組織學分級有關，隨分級的增高，C-erbB-2呈現高表達。②與淋巴結轉移和無轉移有關。③與DNA倍體有關，二倍體腫瘤表達量低，異倍體腫瘤表達高。④與雌激素受體有關，C-erbB-2蛋白過量表達的乳癌，受體常為陰性。而表達量低的乳癌，受體常為陽性。⑤與臨床預后有關，C-erbB-2表達過量的乳癌，無病生存期和總存活期明顯縮短，常出現腫瘤復發(fā)，而C-erbB-2蛋白表達量低，預后較好，認為是一個重要的預后參數。

82編輯課件①與組織學分級有關，隨分級的增高，C-erbB-2呈現高表達四、腫瘤轉移基因CD44CD44基因位于人類11號染色體的短臂上，可分為兩種類型，按其外顯子表達方式，可稱為組成型CD44S和變異型CD44V。研究表明，正常情況下，CD44S基因蛋白是廣泛存在細胞膜的跨膜糖蛋白，在大多數上皮細胞、間質細胞和淋巴細胞等均可以檢測到該糖蛋白的表達，研究發(fā)現，CD44基因蛋白的作用，主要參與細胞與細胞、細胞與基質之間的特異性連接，有如下功用:

83編輯課件四、腫瘤轉移基因CD44CD44基因位于人類11號染色體的短①介導淋巴細胞與毛細血管的小靜脈內皮細胞的結合。②參與淋巴細胞的活化。③能與細胞外基質中的透明質酸膠原蛋白、纖維粘連蛋白、層連蛋白分子結合。④參與細胞骨架蛋白結合，使細胞偽足形成，參與細胞遷移運動。變異型CD44V基因與腫瘤轉移的關系，是近期人們最新的實驗中發(fā)現的，目前已成為研究腫瘤轉移的一個新的熱點課題。

84編輯課件①介導淋巴細胞與毛細血管的小靜脈內皮細胞的結合。35編輯課件研究發(fā)現，正常組織中和沒有轉移能力的惡性細胞主要有

CD44S基因蛋白表達，而具有轉移能力的惡性細胞主要是變異型CD44V基因蛋白的高表達，但在正常上皮細胞中變異型CD44V僅有很弱的表達，確切證實變異型CD44V基因與腫瘤轉移有關，是在1991年德國學者Gunth-er等首先報道了他們突破性研究結果。他們從大鼠胰腺癌細胞中分離到了具有轉移能力的細胞株和沒有轉移能力的細胞株，然后用具有轉移能力的細胞膜蛋白作為抗原，制備出了單抗腫瘤細胞與抗體結合，而不與沒有轉移能力的細胞結合，經過對這一單抗的序列分析后證實為變異型CD44V基因蛋白。

85編輯課件研究發(fā)現，正常組織中和沒有轉移能力的惡性細胞主要有CD44將變異型CD44V基因首先用于臨床腫瘤標本的研究是英國學者Matsumura和他的同事們，他們檢測了乳腺癌和結腸癌，發(fā)現轉移癌都有高水平的CD44V表達而從非轉移癌細胞僅能檢出很弱的表達。最近有學者應用流式細胞術和抗人CD44單克隆抗體，對種植于小鼠體內黑色素瘤細胞進行了研究分析，認為CD44在腫瘤的生長和轉移機制中具有重要作用。86編輯課件將變異型CD44V基因首先用于臨床腫瘤標本的研究是英國學者M我們應用流式細胞術分析了膀胱癌，乳腺癌細胞的變異型CD44V基因蛋白產物的表達，發(fā)現有淋巴結轉移的乳癌均有強的表達量，無淋巴結轉移的乳癌僅有較弱的表達量。變異型CD44基因蛋白的表達和腫瘤轉移的關系的研究尚處于初步研究階段。

有許多未知有待更深入的探討，相信隨著CD44基因的研究進一步深入將會為腫瘤的轉移和診斷提供新的標志物。

87編輯課件我們應用流式細胞術分析了膀胱癌，乳腺癌細胞的變異型CD44V五、血型糖蛋白A(GlyCopt1orinA.GPA)

人類體細胞突變的發(fā)生，及其在癌發(fā)生的生物分子機制中的作用研究，越來越引起腫瘤學者的極大關注。當人體遭受到致癌因子的損害后，存在于骨髓中的紅系造血干細胞的血型糖蛋白A基因位點發(fā)生突變，并產生變異的子代紅細胞，這種改變可成為一種標記而長期保留下來，而形成紅細胞變異株。變異株紅細胞表面所攜帶有GPA抗原(即

M/N血型決定簇)，這種變異的GPA抗原物質是一種特異性的標志物，它的一對等位基因位于染色體4Q28-31。

88編輯課件五、血型糖蛋白A(GlyCopt1orinA.GPA)目前，已經分離克隆出抗變異型紅細胞GPA的單克隆抗體，用熒光探針標記這些抗體就可用流式細胞術檢測這些血液中紅細胞的GPA變異株的頻率，為研究人類活體細胞突變找到一個簡便的新方法。有作者使用流式細胞術并結合抗GPA變異型單克隆抗體，對食管癌前病變患者紅細胞膜GPA的表達和變異株頻率進行了檢測，發(fā)現癌前病變患者的M/N血型的變異株GPA表達明顯高于正常人，說明GPA變異株的檢測頻率，對有癌變傾向的個體，可作為一個有重要意義的監(jiān)測標志物。

89編輯課件目前，已經分離克隆出抗變異型紅細胞GPA的單克隆抗體，用熒光也有學者將FCM-GPA表達的檢測應用于放射線損害和腫瘤化療藥物引起人類體細胞突變的檢測，發(fā)現在日本廣島原子彈爆炸后的幸存者中，其GPA變異紅細胞頻率與其爆炸時(1945年)的受輻射劑量相關，至今已40多年后的幸存者，其骨髓紅系造血干細胞GPA位點上仍有突變點并仍可檢出變異的子代細胞。這種FCM檢測紅細胞膜上GPA變異株的方法，比其他檢測體細胞突