最新基因診斷治療課件

進(jìn)入夏天，少不了一個(gè)熱字當(dāng)頭，電扇空調(diào)陸續(xù)登場(chǎng)，每逢此時(shí)，總會(huì)想起那一把蒲扇。蒲扇，是記憶中的農(nóng)村，夏季經(jīng)常用的一件物品。記憶中的故鄉(xiāng)，每逢進(jìn)入夏天，集市上最常見的便是蒲扇、涼席，不論男女老少，個(gè)個(gè)手持一把，忽閃忽閃個(gè)不停，嘴里叨叨著“怎么這么熱”，于是三五成群，聚在大樹下，或站著，或隨即坐在石頭上，手持那把扇子，邊嘮嗑邊乘涼。孩子們卻在周圍跑跑跳跳，熱得滿頭大汗，不時(shí)聽到“強(qiáng)子，別跑了，快來(lái)我給你扇扇”。孩子們才不聽這一套，跑個(gè)沒完，直到累氣喘吁吁，這才一跑一踮地圍過(guò)了，這時(shí)母親總是，好似生氣的樣子，邊扇邊訓(xùn)，“你看熱的，跑什么？”此時(shí)這把蒲扇，是那么涼快，那么的溫馨幸福，有母親的味道！蒲扇是中國(guó)傳統(tǒng)工藝品，在我國(guó)已有三千年多年的歷史。取材于棕櫚樹，制作簡(jiǎn)單，方便攜帶，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常會(huì)在上面作畫。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇諸名，實(shí)即今日的蒲扇，江浙稱之為芭蕉扇。六七十年代，人們最常用的就是這種，似圓非圓，輕巧又便宜的蒲扇。蒲扇流傳至今，我的記憶中，它跨越了半個(gè)世紀(jì)，也走過(guò)了我們的半個(gè)人生的軌跡，攜帶著特有的念想，一年年，一天天，流向長(zhǎng)長(zhǎng)的時(shí)間隧道，裊基因診斷治療進(jìn)入夏天，少不了一個(gè)熱字當(dāng)頭，電扇空調(diào)陸續(xù)登場(chǎng)，每逢此時(shí)1基因診斷基因診斷2最新基因診斷治療課件3最新基因診斷治療課件4最新基因診斷治療課件5最新基因診斷治療課件6最新基因診斷治療課件7最新基因診斷治療課件8(2)幾種不同形式的核酸分子雜交

a.Southern印跡(southernblot)雜交:

用于DNA的檢測(cè)，可用于基因的限制性內(nèi)切酶譜分析，基因突變分析等．b.Northern印跡(Northernblot)雜交:

用于RNA的檢測(cè)，能對(duì)組織細(xì)胞中的總RNA或mRNA進(jìn)行定性和定量分析．c.斑點(diǎn)雜交（dotblot):

既可以檢測(cè)DNA也可以檢測(cè)RNA,用于特定基因及其表達(dá)的定性和定量分析．方法簡(jiǎn)單、靈敏；但特異性低．

d.原位雜交（insituhybridization):

是細(xì)胞學(xué)技術(shù)與核酸雜交技術(shù)結(jié)合的一種核酸分析檢測(cè)技術(shù)．可分為DNA原位雜交和RNA原位雜交,用于檢測(cè)染色體中特定的基因位置，用于染色體疾病的診斷．

分類:①玻片原位雜交:如中期的染色體和組織切片.②膜上原位雜交:將菌落或噬菌斑影印在尼龍膜(如硝酸纖維膜)

(2)幾種不同形式的核酸分子雜交9原位雜交的鏡像圖原位雜交的鏡像圖10(二)PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用（１）等位基因特異性寡聚核苷酸（allelespecificoligonnucleotide,ASO)探針斑點(diǎn)雜交：PCR-ASO該方法是診斷已知點(diǎn)的突變：需分別合成野生型和突變型探針．在基因診斷時(shí)，只需用PCR擴(kuò)增受檢者目的DNA片段，再分別與上述探針雜交．雜交的結(jié)果有如下幾種情況：

①PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與正常探針雜交，不與突變探針雜交—不存在這種突變；②只與突變探針雜交--突變基因?yàn)榧兒献樱虎叟c正常探針和突變探針都可雜交--突變基因?yàn)殡s合子；④與正常探針和突變探針都不能雜交--突變基因不屬于已發(fā)現(xiàn)的類型(二)PCR技術(shù)在基因診斷中的應(yīng)用（１）等位基因特異性寡聚核11ASO探針雜交檢測(cè)已知點(diǎn)突變受檢者基因組DNA或含突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記的ASO探針雜交ASO1ASO2NormalHeteroHomoASO探針雜交檢測(cè)已知點(diǎn)突變受檢者基因組DNA或含ASO1A12（２）PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCRsinglestrandconformationploymorphism,PCR-SSCP)分析

是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法．DNA變性形成單鏈，在中性條件下長(zhǎng)度相同的單鏈DNA,如果堿基組成和(或)排列順序不同,形成的構(gòu)象就不同,這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性.這些分子在非變性PAGE電泳中表現(xiàn)出不同的遷移率.

SSCP特別適于分析小于400bp的PCR產(chǎn)物。據(jù)認(rèn)為SSCP可以區(qū)分1bp的差異

PCR-SSCP分析不能確定基因變異的內(nèi)容，因此電泳后結(jié)果有差異后還需進(jìn)行測(cè)序分析，確定變異性質(zhì)

（２）PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCRsinglestra13PCR-SSCP分析原理示意PCR-SSCP分析原理示意14(3)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,PCR-RFLP）分析基因突變導(dǎo)致的基因堿基組成或(和)順序發(fā)生改變,會(huì)在基因結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或使原有的位點(diǎn)消失.用限制酶對(duì)不同個(gè)體基因組進(jìn)行消化時(shí)，其電泳條帶的數(shù)目和大小就會(huì)產(chǎn)生改變，根據(jù)這些改變可以判斷出突變是否存在.(3)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCRrestric15

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)樣品一樣品二1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP為遺傳標(biāo)記繪制了第一張人類遺傳圖譜限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性樣品一樣品二1987年,H.Don16(4)PCR-變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)

雙鏈DNA在一定濃度變性劑(尿素,甲酰胺)作用下,會(huì)變性而解鏈,導(dǎo)致DNA分子電泳遷移率變化.當(dāng)在不同梯度濃度變性膠中電泳時(shí),

DNA泳動(dòng)到變性劑濃度能使DNA發(fā)生變性，DNA開始解鏈，從而不同的DNA片段會(huì)形成不同的遷移率條帶．優(yōu)點(diǎn)：可靠，檢出單堿基突變率可達(dá)９５％．缺點(diǎn)：富含高熔點(diǎn)GC區(qū)時(shí)，則難以檢測(cè)出突變．(4)PCR-變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)雙鏈DNA在一定17變性梯度凝膠電泳圖18變性梯度凝膠電泳圖18熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)是一種目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的定量PCR技術(shù),是通過(guò)始點(diǎn)定量和熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累計(jì)熒光強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn),具有靈敏度高,特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn).FQ-PCR技術(shù)的兩種定量形式:

①絕對(duì)定量:一般采用外標(biāo)準(zhǔn)品定量的制備來(lái)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量.如合成目的基因;將PCR產(chǎn)物直接梯度稀釋;或?qū)CR產(chǎn)物克隆到載體上,抽取質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)測(cè)量濃度和拷貝數(shù)可準(zhǔn)確定量.優(yōu)點(diǎn):穩(wěn)定,準(zhǔn)確.

②相對(duì)定量:指在測(cè)定目的基因的同時(shí)測(cè)定一內(nèi)源性管家基因(如β-actin,rRNA等),該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較,反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴(kuò)增的影響因素.(6)定量PCR(quantiativePCR,Q-PCR)

熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)(6)定量PCR(quan19(7）DNA序列測(cè)序1.1977年Sanger創(chuàng)建的鏈終止反應(yīng)序列測(cè)序法用放射性同位素標(biāo)記引物，用雙脫氧核苷酸隨機(jī)終止DNA鏈的延伸，產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的DNA片段，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離這些片段，放射自顯影讀出結(jié)果。(7）DNA序列測(cè)序1.1977年Sanger創(chuàng)建的鏈終止反20最新基因診斷治療課件212.自動(dòng)測(cè)序法采用四色熒光標(biāo)記代替了放射性同位素標(biāo)記。

DNA測(cè)序測(cè)定是基因突變檢測(cè)的最直接，最準(zhǔn)確的方法，它不僅可確定突變的部位，還可確定突變的性質(zhì)222.自動(dòng)測(cè)序法22（8）DNA芯片技術(shù)DNA芯片（DNAchip)又稱為基因芯片，DNA微陣列（DNAmicroarray)該技術(shù)的基礎(chǔ)仍然是利用核酸分子雜交原理：首先將一系列預(yù)先設(shè)計(jì)好的核酸探針（oligosorcDNA)有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龍膜等固體支持物上，制成DNA微陣列。用熒光標(biāo)記待測(cè)樣品（DNA,cDNA,RNA)與位于芯片上的核酸探針雜交后，通過(guò)激光共聚焦熒光掃描系統(tǒng)檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)度，再用特定的軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行綜合分析，就能獲得待測(cè)樣品的大量基因序列信息或表達(dá)信息。

（8）DNA芯片技術(shù)DNA芯片（DNAchip)又稱為基23基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)24

基因芯片按照用途分為：表達(dá)芯片，診斷芯片，指紋圖譜芯片，測(cè)序芯片，毒理芯片等。該技術(shù)可用于新基因鑒定，突變檢測(cè)，表達(dá)監(jiān)控和遺傳制圖等。25基因芯片按照用途分為：表達(dá)芯片，診斷芯片，指紋圖譜芯

基因表達(dá)的分析基因表達(dá)的分析26三、遺傳病的基因診斷一.遺傳病基因診斷的策略1.直接策略：采用基因突變的診斷方法，直接檢測(cè)致病基因。該策略的前提是基因已被克隆.

2.間接策略：即通過(guò)檢測(cè)與致病基因連鎖

的遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因診斷.三、遺傳病的基因診斷一.遺傳病基因診斷的策略27二、人類基因組上的DNA遺傳標(biāo)記

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLPs

)1985短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttendemrepeats,STRs,mini-satellites)1990s單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymor-phismsSNPs)二、人類基因組上的DNA遺傳標(biāo)記限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RF28短串聯(lián)重復(fù)序列STRs(shorttendemrepeats,Microsatellites)STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是1bp-8bp的串聯(lián)重復(fù)，重復(fù)次數(shù)n=15-60，已知8000多個(gè)主要形式為：

(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n為多見。1992年，Welssenbanch等以STR為標(biāo)記的第二代連鎖圖取代了RFLP連鎖圖。短串聯(lián)重復(fù)序列STR廣泛存在于人基因組，占約5%，基本單位是29

主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。與RFLP與STR不同,它是直接以序列的變異作為標(biāo)記,而不是以片段的長(zhǎng)度差異作為標(biāo)記.人類基因組圖譜的初步分析表明，共有3萬(wàn)至3.5萬(wàn)個(gè)基因。有300多萬(wàn)個(gè)單核苷酸多態(tài)性,SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，3-4個(gè)相鄰的標(biāo)記構(gòu)成的單倍型（haplotype）就可有8-16種。

1996年，Lander報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記制備第三代遺傳連鎖圖的遺傳標(biāo)記。單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA30

SNP用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：①SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來(lái)。②它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。③與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)(STR)相比，SNP是高度穩(wěn)定的.尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對(duì)人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。④部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會(huì)直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。⑤易于進(jìn)行自動(dòng)化分析，縮短了研究時(shí)間.SNP用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：①SNP在人群中是二等位31四、基因診斷技術(shù)在臨床的應(yīng)用32四、基因診斷技術(shù)在臨床的應(yīng)用3232血紅蛋白病的基因診斷

分為異常血紅蛋白病和地中海貧血,前者是由于珠蛋白的基因突變；后者是由于珠蛋白合成速率降低，a鏈和b鏈合成不平衡。（一）異常血紅蛋白病的基因診斷：

如鐮狀紅細(xì)胞貧血病:β鏈第六位氨基酸:GAA(谷)→GUA(纈)代替.

對(duì)該病的基因診斷應(yīng)采用:

1)PCR-限制酶切,即用PCR從患者基因組擴(kuò)增含突變位點(diǎn)的珠蛋白基因片段,再選適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,根據(jù)電泳圖譜上片段數(shù)量和大小做出判斷

2)Southern印跡雜交分析血紅蛋白病的基因診斷分為異常血紅蛋白病和地中海貧血,前者是33

HbA、HbS和HbC的密碼子及蛋白質(zhì)區(qū)別

β珠蛋白基因的第6位密碼子有三種形式：正常紅細(xì)胞的基因βA、鐮狀紅細(xì)胞的基因βS和另一種相對(duì)常見的血紅蛋白C的基因βC。HbA、HbS和HbC的密碼子及蛋白質(zhì)區(qū)別β珠蛋白基因的34設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增序列中必須包括第5、6、7密碼子，擴(kuò)增后用MstⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行水解，通過(guò)對(duì)水解片段的電泳分析或進(jìn)行Southern雜交分析可以做出正確的診斷。限制性內(nèi)切酶MstⅡ識(shí)別序列為CCTNAGG，N可以是任意核苷酸。因此β珠蛋白基因的第5、6密碼子和第7密碼子的第一個(gè)核苷酸序列是該內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。但是在發(fā)生鐮狀突變后該酶切位點(diǎn)消失。設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增序列中必須包括第5、6、7密35×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′36+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者酶切產(chǎn)物電泳分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者酶37酶切產(chǎn)物Southern印跡雜交分析用寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè)點(diǎn)突變被檢靶片段經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切，并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，與經(jīng)標(biāo)記寡核苷酸探針雜交探針為β珠蛋白基因5′端的基因片斷酶切產(chǎn)物Southern印跡雜交分析用寡核苷酸探針和PCR產(chǎn)38圖示β珠蛋白基因純合子A（AA）、純合子S(SS)和雜合子AS個(gè)體的DNA雜交結(jié)果圖示β珠蛋白基因純合子A（AA）、純合子S(SS)和雜合子A39PCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針進(jìn)行雜交含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交PCR產(chǎn)物分別與經(jīng)標(biāo)記的野生型和突變型靶基因序列的寡核苷酸探針雜交，根據(jù)有無(wú)雜交信號(hào)判斷被檢擴(kuò)增片段中是否帶有突變點(diǎn)PCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針進(jìn)行雜交40

b-珠蛋白基因點(diǎn)突變

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormalHeterobAprobebSprobeHomoNorm41（二）α地貧的基因診斷：1.定性分析：PCR法直接擴(kuò)增α1和α2，基因的3’端有差別，針對(duì)此可設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，如有缺失，則不能擴(kuò)增出產(chǎn)物。2.定量分析:α地貧的共同特點(diǎn)是α珠蛋白mRNA的量減少，因此可用RT-PCR定量分析mRNA的量以助診斷。（二）α地貧的基因診斷：42重型地貧:胎兒水腫綜合征

早產(chǎn)死胎或出生前后死亡

可導(dǎo)致嚴(yán)重產(chǎn)科并發(fā)癥

無(wú)理想治療方法重型地貧:胎兒水腫綜合征43α基因不同程度的缺失引起不同類型的α地貧，α基因缺失1～4個(gè)。正常Gene組用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一個(gè)αGene時(shí)可得到10kb片段。BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobeα地貧的Gene診斷

44BamHIBamHIα2α1α210kb14kbpro以αGene為探針，Southernblot方法檢測(cè)αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb45以αGene為探針，Southernblot方法檢測(cè)αα（三）β-地貧的基因診斷

1.DNA檢測(cè)與分析：①PCR-ASO探針?lè)橹饕椒ǎ焊鶕?jù)β-珠蛋白主要突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，擴(kuò)增可能發(fā)生突變的2個(gè)片段,再分別與相應(yīng)野生型探針和突變探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。②PCR-RFLP連鎖分析法：檢測(cè)與β-珠蛋白基因連鎖的遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因診斷,如β-珠蛋白5’端有一限制內(nèi)切酶HgiAI的多態(tài)性位點(diǎn),在中國(guó)人群的頻率為0.5③DNA芯片技術(shù)

2.RNA檢測(cè)與分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以助診斷（三）β-地貧的基因診斷46杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的基因診斷

(Duchennemusculardystrophy,DMD)

DMD：是性連鎖隱性遺傳病,是由抗肌萎縮蛋白(dystrophin)基因突變(突變或缺失)。其突出特點(diǎn)為橫紋肌進(jìn)行性萎縮，引起無(wú)力和攣縮。DMD患兒在5歲前發(fā)病，20歲左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，發(fā)病率在男性活嬰中約1/3500。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的基因診斷

(Duchennemuscul47DMD是一種嚴(yán)重致死性疾病（XR），臨床癥狀表現(xiàn)肌肉進(jìn)行性萎縮和乏力。BMD臨床癥狀與DMD相似，但癥狀較輕。Gene定位Xp21，Gene2300kb,79個(gè)Exon，cDNA全長(zhǎng)13974bp編碼3685Aa，分子量427kD。DMD/BMD70%左右為缺失型，基因很大，缺失可能發(fā)生在不同的部位。應(yīng)用多重PCR擴(kuò)增檢測(cè)，判斷缺失狀態(tài)。4848杜氏和貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的基因診斷

多重PCR檢測(cè)患者缺失凝膠電泳圖（9對(duì)引物）P1除外顯子1外其余均缺失；

P2外顯子8－19有小的缺失；P3外顯子44-50缺失；

P4外顯子45－52有小的缺失；B1空白對(duì)照；C1、C2正常對(duì)照。杜氏和貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的基因診斷多重PCR檢測(cè)患者缺失凝49臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機(jī)理也尚未闡明，但已證實(shí)APKDGene與α珠蛋白基因3’端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3’HVR）緊密連鎖，因此，可以通過(guò)RFLP連鎖分析進(jìn)行診斷。成年型多囊腎病的基因診斷—APKD，AD50臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最

以3’HVR為probe與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的Gene組DNA雜交——SouthernBlot雜交

Gene組DNAprobe（3'HVR）PvuII酶切

DNA片段

雜交結(jié)果51以3’HVR為probe與PvuII酶切后的家系有結(jié)果1212345

5．7kb3．4kb2．3kb

52結(jié)果1結(jié)果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,說(shuō)明致病基因與3.4kb片段連鎖,并按孟德爾方式遺傳.II5不含3.4kb片段,產(chǎn)前診斷正常.53結(jié)果分析

53甲型血友病的基因診斷血友病是一種遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，由于正常凝血過(guò)程中血漿凝血的活力有缺陷所致?；颊叱Ｒ虺鲅恢够蚶^發(fā)病而夭折，治療主要靠替代療法，輸入缺乏的血漿因子。重型血友病甲和乙的男性發(fā)病率為1/5000~1/50000。為甲型血友病和乙型血友病。

54甲型血友病的基因診斷血友病是一種遺傳性凝血功能障礙的出血性疾已知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA。

PCR142bpBcLI

142bp+99bp+43bp

電泳結(jié)果分析？p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+55p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-B問(wèn):1：Ⅱ2、Ⅲ1診斷；2：

Ⅲ1是男或是女發(fā)?。?/p>

142bp99bp12123ⅠⅡIII156問(wèn):1：Ⅱ2、Ⅲ1診斷；2：Ⅲ1是男或是女發(fā)病？142bp結(jié)果分析1）先癥者II2具有99bp片段而發(fā)病，該片段來(lái)自母親。2）II2有142bp/99bp雜合子。142bp來(lái)自父親，為正常片段，99bp片段是來(lái)自母親而成為攜帶者。3）Ⅲ1為99bp片段如果是男性為患者（99bp片段來(lái)自母親）；女性為攜帶者（來(lái)自父母雙方）。57結(jié)果分析1）先癥者II2具有99bp片段而發(fā)病，該片段來(lái)自母腫瘤的基因診斷腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因、多種因素、發(fā)生過(guò)程呈多階段性、發(fā)生的分子機(jī)制十分復(fù)雜,因此對(duì)不同的腫瘤要采用不同的基因診斷策略.58腫瘤的基因診斷腫瘤的發(fā)生涉及多個(gè)基因、多種因素、發(fā)生

一.通過(guò)檢測(cè)腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤淋巴造血系統(tǒng)腫瘤:

染色體易位及基因融合是較普遍的現(xiàn)象.如:淋巴瘤和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生.它是由于T細(xì)胞受體(TCR)基因和IgH基因重排,使原來(lái)相隔數(shù)百個(gè)堿基的IgH和TCR基因的V區(qū)和J區(qū)靠近在一起.用PCR擴(kuò)增該區(qū)域片段,通過(guò)長(zhǎng)度分析就能判斷是否發(fā)生了基因重排.

59二.通過(guò)檢測(cè)癌基因和抑癌基因診斷腫瘤

癌基因的激活及抑癌基因的失活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān).大多人類腫瘤組織或細(xì)胞中都能檢測(cè)到癌基因和(或)抑癌基因的突變1.癌基因-ras與腫瘤:ras是腫瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子機(jī)制主要是點(diǎn)突變,高發(fā)區(qū)是第12、13和61位密碼子.如90%的胰腺癌,50%的結(jié)直腸癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密碼子突變.ras癌基因點(diǎn)突變檢測(cè)方法:

a.PCR-ASO法:檢測(cè)速度快，靈敏度高，檢測(cè)樣品量大等優(yōu)點(diǎn)；但點(diǎn)突變的檢出僅限于寡核苷酸探針的探測(cè)位點(diǎn)和突變類型。

b.PCR-SSCP法：根據(jù)PCR擴(kuò)增的目標(biāo)DNA片段在非變性凝膠電泳中遷移率，將突變基因檢測(cè)出來(lái)。該法檢測(cè)點(diǎn)突變更方便；缺點(diǎn)：不能檢測(cè)出突變的具體位點(diǎn)和具體類型。二.通過(guò)檢測(cè)癌基因和抑癌基因診斷腫瘤癌基因的激活及抑癌60

2.P53基因與腫瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基因，失活的分子機(jī)制主要是基因突變，也有因?yàn)榛虮磉_(dá)異常而使p53失活，約50%以上的惡性腫瘤有p53基因突變。突變類型：130?290密碼子間常發(fā)生點(diǎn)突變，也有少量的插入或缺失突變。

基因檢測(cè)方法：①PCR-SSCP:可檢出有無(wú)突變

②

PCR-RFLP:通過(guò)內(nèi)切酶位點(diǎn)的消失或增加

檢測(cè)p53的基因突變。2.P53基因與腫瘤：61三.通過(guò)檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒診斷腫瘤

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，它們有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆轉(zhuǎn)錄病毒(retro-virus)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的致瘤作用已得到公認(rèn).還發(fā)現(xiàn)一些與人腫瘤發(fā)生有關(guān)的病毒如:

Burkitt

淋巴瘤人類乳頭瘤病毒(HPV)宮頸癌通過(guò)檢測(cè)這些病毒的基因就可以幫助診斷相應(yīng)的腫瘤.EB病毒三.通過(guò)檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒診斷腫瘤已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病毒與腫瘤62四.通過(guò)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物基因或mRNA診斷腫瘤腫瘤標(biāo)志物（tumormarker)是由腫瘤組織細(xì)胞產(chǎn)生的，與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的物質(zhì)，包括：腫瘤抗原，激素，酶和同工酶。僅存在腫瘤細(xì)胞中。

類型：基因標(biāo)志：是指基因本身突變和異常表達(dá)，能反映癌前啟動(dòng)階段的變化?；虮硇蜆?biāo)志：基因產(chǎn)物表達(dá)和調(diào)控異常，表現(xiàn)為所編碼的表達(dá)產(chǎn)物合成紊亂，產(chǎn)生胚胎性抗原，一般出現(xiàn)較晚。

基因診斷方法：①基因變異導(dǎo)致腫瘤標(biāo)記物的產(chǎn)生或含量改變，可選擇：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-測(cè)序，PCR-SSCP等技術(shù)。②導(dǎo)致腫瘤標(biāo)記物產(chǎn)生或含量改變分子機(jī)制不清楚，可用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物mRNA的存在或含量的改變。如：端?；钚悦富钚员挥脕?lái)作為腫瘤標(biāo)記物，在腫瘤細(xì)胞中該酶的活性增高。四.通過(guò)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物基因或mRNA診斷腫瘤腫瘤標(biāo)志物（tu63感染性疾病的基因診斷

每種病原體都有各自特異的遺傳物質(zhì),可以是DNA,也可以是RNA.每種病原生物都有各自種屬特異的基因.一.病毒感染性疾病的診斷

a.乙型肝炎病毒:

目前采用免疫法檢測(cè)血清中病毒抗原.HBV基因組包含4個(gè)開放閱讀框,S、C、P和X區(qū),C區(qū)變異性小,是基因診斷采用的目標(biāo)部位.在用PCR檢測(cè)時(shí)可擴(kuò)增HBV的特異核苷酸序列,通過(guò)PCR產(chǎn)物的直接電泳分析、或內(nèi)切酶譜分析、或點(diǎn)雜交、或Southern印跡等結(jié)果作出判斷.也可采用基因芯片技術(shù).感染性疾病的基因診斷每種病原體都有各自特異的遺傳物質(zhì)64PCR檢測(cè)HIV病毒攜帶者PCR檢測(cè)HIV病毒攜帶者65

b.傳染性非典型肺炎(SARS):

是由新型變異冠狀病毒(SARS-CoV)感染引起.SARS-CoV基因組為正鏈單股RNA,有11個(gè)開放閱讀框,基因組的特異保守序列為編碼RNA聚合酶的序列.基因診斷方法:

①

采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增保守序列

②

DNA芯片二.診斷細(xì)菌感染性的疾病用PCR技術(shù)通過(guò)對(duì)致病細(xì)菌所含質(zhì)粒的特異序列,設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)引起的疾病的細(xì)菌類型.

b.傳染性非典型肺炎(SARS):66基因診斷方法在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用微衛(wèi)星核心區(qū)重復(fù)序列的拷貝數(shù)的差異是微衛(wèi)星DNA多態(tài)性的主要成因，微衛(wèi)星的側(cè)翼序列多是相對(duì)保守的非重復(fù)序列，因此可以設(shè)計(jì)特異性引物，用PCR技術(shù)檢測(cè)微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性。人工合成很短的重復(fù)序列作為探針，與酶切的人體DNA作southernblot，同一個(gè)體的不同組織來(lái)源的DNA譜帶完全一致，而不同個(gè)體之間（除非同卵雙生）譜帶都不相同，如同人的指紋具有高度個(gè)體特異性一樣，這種southern印跡圖被稱為DNA指紋?；蛟\斷方法在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用67

PCR-STR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用PCR-STR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用68基因診斷用于親子鑒定69基因診斷用于親子鑒定69DNA指紋分析用于個(gè)體鑒定

DNA指紋分析用于個(gè)體鑒定70基因診斷意義

現(xiàn)證病人的診斷：爭(zhēng)取有效、針對(duì)性治療。產(chǎn)前診斷：意義更為重要，預(yù)防遺傳病患兒的出生71基因診斷意義

現(xiàn)證病人的診斷：爭(zhēng)取有效、針對(duì)性治療。71基因診斷存在的問(wèn)題與發(fā)展前景一.基因診斷技術(shù)應(yīng)用存在的問(wèn)題

1.理論問(wèn)題目前找到的致病基因不多,由多基因及基因與環(huán)境互作所引發(fā)多種疾病的分子機(jī)制還不清楚

2.技術(shù)問(wèn)題設(shè)備條件;操做人員;污染造成的假陽(yáng)性.3.倫理問(wèn)題二.發(fā)展前景基因診斷存在的問(wèn)題與發(fā)展前景一.基因診斷技術(shù)應(yīng)用存在的問(wèn)題72結(jié)束語(yǔ)

基因診斷利用分子生物學(xué)技術(shù),從DNA/RNA水平檢測(cè)基因的存在、分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài),從而對(duì)疾病作出診斷.基因診斷的基本技術(shù)是核酸分子雜交和PCR擴(kuò)增.前者是最直接、最準(zhǔn)確的基因診斷技術(shù),后者則是應(yīng)用前景最為廣闊的診斷技術(shù).目前,基因診斷技術(shù)已廣泛地應(yīng)用到遺傳病、腫瘤和感染性疾病的診斷.隨著醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,基因診斷技術(shù)將會(huì)更加廣泛.結(jié)束語(yǔ)基因診斷利用分子生物學(xué)技術(shù),從DNA/RNA水73基因治療

GeneTherapy基因治療

GeneTherapy74基因治療（Genetherapy

）

基因治療（Genetherapy

）

：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。為達(dá)到這一目的，實(shí)施相應(yīng)的策略?；蛑委煟℅enetherapy

）基因治療75基因治療三要素1.合適的目的基因：補(bǔ)充缺損基因；矯正異?；颍黄渌哂兄委熥饔玫幕?。2.合適的基因轉(zhuǎn)移方法。3.必須在體內(nèi)正常表達(dá)：基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。基因治療三要素1.合適的目的基因：補(bǔ)充缺損基因；矯正異常基因76基因治療流程1.確定病因（致病基因）2.治療基因的獲得：DNA重組3.將治療基因?qū)牖蛑委煱屑?xì)胞靶細(xì)胞：體細(xì)胞、生殖細(xì)胞（符合易培養(yǎng)、易取出和移植、壽命長(zhǎng)等條件）導(dǎo)入方法：物理法、化學(xué)法、融合法、病毒載體法4.將治療基因修飾的靶細(xì)胞回輸體內(nèi)5.觀察治療效果基因治療流程1.確定病因（致病基因）77本章內(nèi)容提示基因治療(genetherapy)概念基因治療策略治療靶細(xì)胞：體細(xì)胞、生殖細(xì)胞的基因治療基因轉(zhuǎn)移方法靶細(xì)胞特點(diǎn)、靶細(xì)胞種類反義寡核苷酸技術(shù)自殺基因與旁觀者效應(yīng)本章內(nèi)容提示基因治療(genetherapy)概念78一、基因治療策略策略：直接基因治療和間接基因治療1、直接基因治療：糾正突變基因

在原位修復(fù)缺陷的基因，以達(dá)到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問(wèn)題，目前正在努力之中。（未實(shí)現(xiàn)）一、基因治療策略792、間接療法：以正常的基因替代致病基因。

導(dǎo)入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而對(duì)靶細(xì)胞而言，沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。用DNA重組技術(shù)設(shè)法修復(fù)患者細(xì)胞中有缺陷的基因，使細(xì)胞恢復(fù)正常功能而達(dá)到治療遺傳病的目的。

2、間接療法：80途徑:

就基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同，基因治療有兩種途徑：

1、生殖細(xì)胞基因治療

2、體細(xì)胞基因治療途徑:

就基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同，基因治療有兩種途徑81

1、生殖細(xì)胞基因治療將正常基因轉(zhuǎn)移到患者生殖細(xì)胞（精細(xì)胞，卵細(xì)胞，早期胚胎）使其發(fā)育成正常個(gè)體。為理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中散播。

1、生殖細(xì)胞基因治療將正常基因轉(zhuǎn)移到患者生殖細(xì)胞（精細(xì)胞82但還存在某些問(wèn)題：1）靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無(wú)實(shí)質(zhì)性進(jìn)展；2）基因轉(zhuǎn)移效率不高，只能用顯微注射方法；3）只適用于排卵周期短而次數(shù)多的動(dòng)物，很難適用于人類。（但目前輔助生殖技術(shù)的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細(xì)胞的辦法。一次可獲取少者3-5個(gè)，多者十幾個(gè)。）但還存在某些問(wèn)題：1）靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無(wú)實(shí)質(zhì)性進(jìn)展；832．體細(xì)胞基因治療

somaticcellgenetherapy

將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。2．體細(xì)胞基因治療

somaticcellgeneth84

措施：（1）正常基因轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的體細(xì)胞，有效表達(dá)后，再回輸?shù)襟w內(nèi)。（2）正?；?qū)氚屑?xì)胞，定位整合到染色體上，準(zhǔn)確的替換異常基因，是理想的措施。（3）隨機(jī)整合，非特定座位，只要有效的表達(dá)即可達(dá)到治療的目的。（4）體細(xì)胞基因治療理論上不必矯正所有的體細(xì)胞。措施：（1）正?；蜣D(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的體細(xì)胞，85存在的問(wèn)題

對(duì)特定座位基因轉(zhuǎn)移，目前還存在較大困難；隨機(jī)插入可能引起后代的基因突變。存在的問(wèn)題86二、基因治療的方法基因治療的關(guān)鍵性步驟

目的基因的獲得與轉(zhuǎn)移

二、基因治療的方法87基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離

基因克隆↓定位↓表達(dá)↓評(píng)價(jià)表達(dá)情況一）目的基因的獲得—

正?；虻姆蛛x與克隆基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離一）目的基因的獲得88二）外源基因的轉(zhuǎn)移通過(guò)不同方法，將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。二）外源基因的轉(zhuǎn)移通過(guò)不同方法，將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。891）物理方法（1）電穿孔法（electroporotion）將細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)中，通過(guò)電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。

瞬間細(xì)胞細(xì)胞膜核膜通透性增加

高壓脈沖

DNA滲入細(xì)胞1）物理方法（1）電穿孔法（electroporotion）90（2）顯微注射法（microinjection）利用顯微操作把目的基因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核

（2）顯微注射法（microinjection）利用顯微操91例：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備

重組基因DNA

微注射（體外）

小鼠受精卵回植假妊娠

仔鼠

動(dòng)物模型：轉(zhuǎn)基因鼠

(每個(gè)鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳)例：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備92最新基因診斷治療課件93clonesheepDolly體細(xì)胞提取核重組細(xì)胞回植Dolly卵細(xì)胞去核細(xì)胞clonesheepDolly94（3）微粒子轟擊法

利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來(lái)形成微粒，通過(guò)物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。（3）微粒子轟擊法利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包952）化學(xué)法磷酸鈣沉淀法：目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。2）化學(xué)法磷酸鈣沉淀法：96磷酸鈣+DNA→混合微細(xì)顆?！?/p>

沉淀反應(yīng)20~30min

↓

細(xì)胞在沉淀物中暴露5~24h

方法簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)化效率低。磷酸鈣+DNA→混合微細(xì)顆粒973）脂質(zhì)體法（liposome）應(yīng)用人工制備的類似細(xì)胞膜的膜性結(jié)構(gòu)——脂質(zhì)體，包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其表達(dá)。

DNA細(xì)胞融合轉(zhuǎn)化細(xì)胞

PEG

仙苔病毒DNA脂膜3）脂質(zhì)體法（liposome）應(yīng)用人工制備的類似細(xì)胞膜的膜984）同源重組法

同源重組（homologusrecombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。

是將外源基因定位導(dǎo)入細(xì)胞的染色體上。

單交換

雙交換

4）同源重組法同源重組（homologusreco99通過(guò)同源重組定點(diǎn)插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaIδβ△βneoXbaIBstXIδΔββneo正常基因座位帶有珠蛋白基因的質(zhì)粒

C重組后，插入外源基因片段帶有——neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細(xì)胞在含有neo的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，沒有插入新基因的細(xì)胞死亡，將有重組的細(xì)胞篩選出來(lái)。通過(guò)同源重組定點(diǎn)插入珠蛋白基因XbaIBstXIXbaI1005）病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtransfer）是通過(guò)病毒為載體（vector），將外源基因通過(guò)重組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細(xì)胞感染細(xì)胞重組病毒5）病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtra101

逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)

常用的病毒載體

DNA病毒

1)逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）

目前應(yīng)用最多、最成功.病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。

102最新基因診斷治療課件103例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結(jié)構(gòu)：

LTRLTRψgagpolenvU3RU5U3RU5

U3=增強(qiáng)子，R=啟動(dòng)子，U5=轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。

Ψ=病毒包裝信號(hào)，gag=核心抗原，pol=逆轉(zhuǎn)錄酶，env=外殼蛋白。例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結(jié)構(gòu)：104逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)：①高效感染宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率可達(dá)100%②病毒基因和所載的外源基因都可能表達(dá)③宿主范圍廣，可同時(shí)感染大量細(xì)胞并長(zhǎng)期存留逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點(diǎn)：105缺點(diǎn)

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒隨機(jī)插入靶細(xì)胞基因組中，因病毒具有強(qiáng)大的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，能使插入點(diǎn)附近的基因過(guò)度表達(dá)或失活，插入的外源基因可能不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；缺點(diǎn)106③逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用，可能使受體細(xì)胞癌變。

根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點(diǎn)，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點(diǎn)，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包裝信號(hào)。③逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用，可能使受體細(xì)胞癌變。1076）受體載體轉(zhuǎn)移法將含有目的基因的重組質(zhì)粒和某些細(xì)胞表面受體能識(shí)別的特異性多肽（配體）形成復(fù)合物，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞途徑達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。重組質(zhì)粒配體細(xì)胞膜復(fù)合物6）受體載體轉(zhuǎn)移法將含有目的基因的重組質(zhì)粒和某些細(xì)胞表面受體108三）靶細(xì)胞的選擇靶細(xì)胞是指接受外源Gene的體細(xì)胞選擇靶細(xì)胞的原則是：1）必須較堅(jiān)固，便于體外培養(yǎng)和進(jìn)行遺傳技術(shù)操作；2）易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)3）具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)（能存活幾月至幾年，或整個(gè)生命周期）4）易于受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化。三）靶細(xì)胞的選擇靶細(xì)胞是指接受外源Gene的體細(xì)胞109常見的靶細(xì)胞外周血T淋巴細(xì)胞上皮細(xì)胞內(nèi)皮皮膚成纖維細(xì)胞造血干細(xì)胞——β地中海貧血、嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷病等基因治療肝C——家族性高膽固醇血癥、低密度脂蛋白病的基因治療肌細(xì)胞常見的靶細(xì)胞外周血T淋巴細(xì)胞110三、Gene治療的現(xiàn)狀與前景體細(xì)胞Gene治療臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開始，生殖細(xì)胞Gene治療正在完善。進(jìn)行基因治療必須具備下列條件：三、Gene治療的現(xiàn)狀與前景體細(xì)胞Gene治療臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)開111具備下列條件選擇適當(dāng)?shù)募膊。宄膊〉陌l(fā)病機(jī)理，Gene的結(jié)構(gòu)和功能。被糾正的基因已克隆，并清楚Gene表達(dá)與調(diào)控機(jī)制與條件。選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞并在體外有效表達(dá)。安全有效的基因轉(zhuǎn)移方法，以及供利用的動(dòng)物模型。具備下列條件選擇適當(dāng)?shù)募膊?，清楚疾病的發(fā)病機(jī)理，Gene的結(jié)112腫瘤基因治療臨床實(shí)踐

腫瘤基因治療臨床實(shí)踐113

腫瘤基因治療是應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，直接修復(fù)或糾正腫瘤相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)與功能缺陷，或者通過(guò)增強(qiáng)宿主的免疫防御功能殺傷腫瘤細(xì)胞，因此，腫瘤的基因治療也是生物治療的重要組成部分。腫瘤基因治療是應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)將外源基因?qū)?14目前腫瘤基因治療仍處于早期階段，盡管其在體外或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上有許多理想結(jié)果，但在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用還面臨許多困難，具體問(wèn)題體現(xiàn)在：如何選擇更有效的目的基因？如何確保載體的安全性？如何將帶有治療作用的載體高效率的轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)？如何保持這些重組載體在人體內(nèi)長(zhǎng)期和穩(wěn)定的高效表達(dá)出預(yù)定的基因產(chǎn)物？如何有效地將基因治療與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用？如何更有效的減輕人體對(duì)重組載體的免疫作用？這些都是當(dāng)前基因治療實(shí)踐中所遇到的重大困難，并成為目前腫瘤基因治療研究的熱點(diǎn)。目前腫瘤基因治療仍處于早期階段，盡管其在體外或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上有許115

目的基因成功轉(zhuǎn)移入靶細(xì)胞是基因治療最重要的環(huán)節(jié)。目前臨床上腫瘤基因治療方式可分為間接體內(nèi)（回體法）(exvivo)和直接體內(nèi)（invivo）兩種。所謂間接體內(nèi)法就是將靶細(xì)胞由患者體內(nèi)取出，于體外完成基因轉(zhuǎn)移后再回輸患者體內(nèi)，此種方法的優(yōu)點(diǎn)為靶細(xì)胞明確、轉(zhuǎn)染效率高；而直接體內(nèi)法是將目的基因插入載體，經(jīng)修飾后直接注入腫瘤部位或通過(guò)血液循環(huán)注入體內(nèi)，在體內(nèi)完成向靶細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，具有一定盲目性,轉(zhuǎn)染效率低，但較前者簡(jiǎn)便、費(fèi)用低，已被越來(lái)越多的臨床研究所選用。

目的基因成功轉(zhuǎn)移入靶細(xì)胞是基因治療最重要的環(huán)節(jié)116

腫瘤基因治療基因轉(zhuǎn)移方法較多，可分為物理、化學(xué)和生物三大類。前兩種是非病毒方法，包括裸露DNA直接注射、多價(jià)陽(yáng)離子-DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化，脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)化和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化等。第三種方法為病毒方法，指通過(guò)攜帶有目的基因的病毒感染靶細(xì)胞并表達(dá)出目的基因的方法。一、基因轉(zhuǎn)移的方式及所采用的載體腫瘤基因治療基因轉(zhuǎn)移方法較多，可分為物理、化學(xué)和117二、腫瘤基因治療的靶向性和目的基因調(diào)控的研究腫瘤基因治療中目的基因有選擇的進(jìn)入腫瘤細(xì)胞等靶細(xì)胞（靶向性基因治療），是治療成功的關(guān)鍵。近年來(lái)，人們對(duì)這些方面進(jìn)行了廣泛研究，并提出了許多方案。如通過(guò)改進(jìn)給藥途徑和方式，或通過(guò)修飾載體和基因，均可望提高腫瘤基因治療的定向性和可控性。二、腫瘤基因治療的靶向性和目的基因調(diào)控的研究腫瘤基因1181、給藥途徑：

腫瘤基因治療給藥途徑中，最多見的是向腫瘤組織直接注射，或者在超聲或CT導(dǎo)向下定位注射。這種方法簡(jiǎn)單易行，常用于體表的晚期腫瘤。但由于使用時(shí)很難達(dá)到瘤內(nèi)均勻分布，雖然有所謂旁觀者效應(yīng)的存在，仍可能使療效受一定影響。對(duì)于盆腹腔腫瘤可以采取腹腔注射的方法。而肺癌基因治療則可采取氣管內(nèi)給藥的方式。1、給藥途徑：1192、載體構(gòu)建

構(gòu)建出能特異結(jié)合進(jìn)入靶細(xì)胞的載體是實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療定向性的主要工作，具體研究成果有：（1）利用某些病毒能選擇性感染人體特異組織的性能，選擇和構(gòu)建特異性載體。如EB病毒和B淋巴細(xì)胞和鼻咽上皮細(xì)胞等。Kenney等以EB病毒為基礎(chǔ)，構(gòu)建出表達(dá)胞苷脫氨酶基因的載體，結(jié)果顯示有無(wú)復(fù)制能力的載體均可感染EB病毒受體CD21陽(yáng)性的細(xì)胞。（2）利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)的一些相對(duì)特異的受體來(lái)構(gòu)建載體。如研究發(fā)現(xiàn)VEGF在黑色素瘤、大腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達(dá)升高，Li等據(jù)此設(shè)計(jì)了含VEGF受體結(jié)合區(qū)的多肽，并將之與目的基因相連，可以介導(dǎo)目的基因在表達(dá)VEGF受體的細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2、載體構(gòu)建1203、目的基因的調(diào)控對(duì)目的基因的修飾，主要是為了能在局部選擇性的攻擊腫瘤細(xì)胞，即通過(guò)構(gòu)建含有細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列的重組載體來(lái)調(diào)控目的基因定向表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。如AFP啟動(dòng)子對(duì)肝腫瘤細(xì)胞的選擇性等。3、目的基因的調(diào)控121三、腫瘤基因治療的常用方法1、抑癌基因的導(dǎo)入：

目前對(duì)抑癌基因研究較多的是p53基因。1990年Baker等首先觀察到p53導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡。Roth于1993年應(yīng)用載有野生型p53的重組逆轉(zhuǎn)錄或腺病毒載體進(jìn)行人體肺癌的實(shí)驗(yàn)治療，出現(xiàn)了8%的部分緩解率，64%病情穩(wěn)定的效果。美國(guó)已從1995年起進(jìn)行了重組腺病毒p53制品的臨床試驗(yàn)。

三、腫瘤基因治療的常用方法1、抑癌基因的導(dǎo)入：1222、癌基因的反義核酸導(dǎo)入治療針對(duì)癌細(xì)胞癌基因異常活化而設(shè)計(jì)的反義核酸技術(shù)可有效調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中基因表達(dá)。具體應(yīng)用方法有二：一是利用質(zhì)粒載體或病毒載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出能與目的基因正義RNA相互補(bǔ)的反義RNA，從而阻斷目的基因蛋白質(zhì)的表達(dá)；二是體外人工合成反義寡核苷酸。由于第二種方法相對(duì)簡(jiǎn)單，故多數(shù)反義核酸基因治療研究均采用了這種技術(shù)。反義核酸基因治療在靶基因選擇上，可以分為癌基因、抑癌基因、生長(zhǎng)因子及其受體細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)、細(xì)胞周期調(diào)控物質(zhì)、酶類及其它。反義核酸基因治療不但在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型上取得了顯著效果，臨床試驗(yàn)亦顯示出良好效果。2、癌基因的反義核酸導(dǎo)入治療1233、免疫基因療法：

由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在著機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫瘤細(xì)胞本身的免疫性不強(qiáng)（如MHC表達(dá)不足），也可源于抗原遞呈細(xì)胞（APC）不能提供足夠的共刺激信號(hào)（如B7），或者機(jī)體免疫因子分泌不足等。因此可以通過(guò)以下三種方法糾正機(jī)體腫瘤免疫的耐受狀態(tài)。3、免疫基因療法：124

(1)將某些細(xì)胞因子（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等）的基因轉(zhuǎn)染到機(jī)體免疫細(xì)胞（如TIL、LAK細(xì)胞及細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞）中，以提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和反應(yīng)能力，這實(shí)質(zhì)上是免疫治療加上基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。這些細(xì)胞因子的基因治療在一定程度上克服了細(xì)胞因子注射療法需反復(fù)多次應(yīng)用、副作用嚴(yán)重等缺點(diǎn)，療效也有提高。腫瘤免疫細(xì)胞因子基因治療因其簡(jiǎn)單、有效、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法。(1)將某些細(xì)胞因子（如IL-2、IL-4、IL-1125（2）由于腫瘤細(xì)胞存在功能性MHCI類抗原和（或）共刺激信號(hào)表達(dá)不足，可以將一些與免疫識(shí)別有關(guān)的基因（如HLA、B7等）轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)照射后再植入腫瘤患者體內(nèi)；或者將表達(dá)HLA-B7的病毒載體或質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體復(fù)合物直接注射到瘤體內(nèi)，以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫原性，誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)。（3）制備腫瘤DNA瘤苗，即將編碼特異抗原的基因直接注入人體，通過(guò)其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)從而可以激發(fā)機(jī)體對(duì)編碼抗原的免疫反應(yīng)。如應(yīng)用癌胚抗原（CEA）制備的腫瘤DNA瘤苗在實(shí)驗(yàn)中顯示出一定的效果。（2）由于腫瘤細(xì)胞存在功能性MHCI類抗原和（或）共刺激信1264、自殺基因療法將某些細(xì)菌及病毒中特有的藥物敏感基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生某些酶類，將原來(lái)無(wú)毒的抗病毒藥物或化療前體藥物代謝轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性產(chǎn)物而殺傷宿主細(xì)胞，這種使腫瘤細(xì)胞自殺的基因稱為自殺基因。目前腫瘤基因治療中廣泛應(yīng)用并舉有較好臨床前景的自殺基因主要有：?jiǎn)渭儼捳畈《拘剀占っ富颍℉SV-tk）和細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶基因（CD）。

4、自殺基因療法127胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase）可將無(wú)害的5－氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素5－氟胞嘧啶。此病毒可感染正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，但將該酶基因連接到一種“分子開關(guān)”后，則只能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。Sikora等設(shè)計(jì)一個(gè)“嵌合小基因（chimericminigene）”，即將酶基因連接到erbB2基因啟動(dòng)子的下游，此啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，使erbB2在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)。此時(shí)，藥物5－FC注入細(xì)胞后即轉(zhuǎn)變?yōu)?－FU而致癌細(xì)胞死亡。而當(dāng)5－FC給予含有此嵌合基因卻無(wú)erbB2表達(dá)的細(xì)胞時(shí)，亦無(wú)藥物前體活性。這一基因治療的新策略，可有可能使人對(duì)腫瘤等不同疾病進(jìn)行基因治療。胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase）可將無(wú)害128自殺基因療法可以實(shí)現(xiàn)選擇性原位轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性殺傷，避免了應(yīng)用exvivo技術(shù)基因療法中步驟繁多、技術(shù)要求高、難度大的靶細(xì)胞獲取及培養(yǎng)、目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、篩選及回輸?shù)冗^(guò)程，從而使其成為較早進(jìn)入臨床的基因治療方法之一。自殺基因療法可以實(shí)現(xiàn)選擇性原位轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性殺傷1295、抗腫瘤血管形成基因治療：

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，腫瘤血管形成起重要作用，因此，抗血管形成治療成為腫瘤治療極有潛力的方法。血管生成抑制劑Angiostatin和Endostatin在腫瘤動(dòng)物模型中已有明確療效，但長(zhǎng)期連續(xù)給予蛋白質(zhì)藥物價(jià)格昂貴，抗血管生成基因治療則在較大程度上解決了這一問(wèn)題。近年來(lái)抗血管生成基因治療研究主要包括：（1）針對(duì)血管形成生長(zhǎng)因子及其受體的基因治療；（2）血管形成抑制因子基因治療；（3）針對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的自殺基因治療等。這些方法雖然尚未進(jìn)入臨床，但可以相信其會(huì)有較廣泛的臨床應(yīng)用前景。5、抗腫瘤血管形成基因治療：1306、耐藥基因基因治療多藥耐受基因（MDR）是研究較廣泛的一組耐藥基因，可將細(xì)胞內(nèi)的藥物包括化療藥物泵出細(xì)胞外，細(xì)胞可因此對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受。利用MDR的這種作用可設(shè)計(jì)出兩種基因治療的方法：一種是應(yīng)用反義RNA技術(shù)，以抑制異常活化的MDR基因，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥的作用；另一種是將MDR基因?qū)朐煅杉?xì)胞，獲表達(dá)后可使骨髓細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)化療藥物的抗性，抵御化療藥物的損害，從而達(dá)到增加化療藥物劑量，進(jìn)而提高化療療效的目的。6、耐藥基因基因治療131

10余年來(lái)所進(jìn)行的腫瘤基因臨床試驗(yàn)已表明，基因治療不僅作為一個(gè)新的生物醫(yī)學(xué)概念而為人們所接受，而且作為一種新的治療手段和方法已被廣大研究人員和臨床工作者所實(shí)踐。到目前為止所進(jìn)行的不少研究表明，基因治療實(shí)驗(yàn)是安全的、有效和易于操作的。

10余年來(lái)所進(jìn)行的腫瘤基因臨床試驗(yàn)已表明，基因治132四、腫瘤基因治療存在的問(wèn)題和發(fā)展方向

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，腫瘤相關(guān)基因的揭示，腫瘤發(fā)病分子機(jī)理的深入闡明，DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)的革新，以及對(duì)于在體內(nèi)重組載體表達(dá)的調(diào)控技術(shù)的提高，腫瘤的基因治療必將在腫瘤的治療中起重要作用，基因治療在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)中具有廣闊的前景。

四、腫瘤基因治療存在的問(wèn)題和發(fā)展方向1331.進(jìn)行基因治療需解決的關(guān)鍵問(wèn)題有哪些？2.基因治療技術(shù)路線3.外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞有哪些方法？4.腫瘤的基因治療目前有哪些具體策略？1.進(jìn)行基因治療需解決的關(guān)鍵問(wèn)題有哪些？134基因治療實(shí)例1、復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療（人類Gene治療成功例子）ADA缺乏癥-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏?；蛑委煂?shí)例1、復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療135ADA-Gene+vector（逆轉(zhuǎn)錄病毒）

重組分子患者TLyCIL-2刺激C分裂導(dǎo)入細(xì)胞生長(zhǎng)分裂

10天

Gene表達(dá)

回輸患兒體內(nèi)

1~2月治療一次,10個(gè)月患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)正常人的25%

ADA-Gene+vector（逆轉(zhuǎn)錄病毒）1362、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時(shí)間長(zhǎng)，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為1/30000。例如：我國(guó)學(xué)者薛京倫實(shí)施的FⅨ的基因治療。2、乙型血友病XR，患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在X137逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

+FⅨcDNA

重組體

5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①導(dǎo)入倉(cāng)鼠細(xì)胞（CHO）→FⅨ表達(dá)；②導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→FⅨ表達(dá)；③91年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）→回植病人皮下→FⅨ基因表達(dá)，F(xiàn)Ⅸ基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%。是我國(guó)基因治療成功的例子。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體+FⅨcDNA1383、黑色素瘤的基因治療腫瘤Gene治療是人們十分關(guān)注的問(wèn)題，進(jìn)行了廣泛的探索。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞——TIL，它積聚腫瘤部位，并在該處持續(xù)存在而無(wú)副作用，利用此特點(diǎn)協(xié)助治療腫瘤。3、黑色素瘤的基因治療腫瘤Gene治療是人們十分關(guān)注的問(wèn)題，139例：細(xì)胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療

①IL-2Gene②TNF-Gene

（白介2）

（腫瘤壞死因子）

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入

TIL（體外培養(yǎng)的自體細(xì)胞）回植患者體內(nèi)

TIL進(jìn)入自體腫瘤部位，提高細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。例：細(xì)胞因子基因治療和腫瘤壞死因子基因治療

①IL-2Ge1404、自殺基因的基因治療

原理：即用（逆轉(zhuǎn)錄）病毒載體將編碼某種酶的基因（自殺基因）轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞中，此酶可將一種無(wú)害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒復(fù)合物，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞不能復(fù)制而死亡）。這種基因載體只能在特定的組織或腫瘤中表達(dá)，而正常細(xì)胞中不表達(dá)。4、自殺基因的基因治療原理：即用（逆轉(zhuǎn)錄）病141如：自殺基因+病毒載體

轉(zhuǎn)染重組載體

藥物前體無(wú)毒Gene→酶→↓

藥物復(fù)合物有毒

細(xì)胞死亡如：142例如：

單純皰疹病毒

哺乳動(dòng)物細(xì)胞

HSVGene-TK

（在腫瘤