免疫組織化學法可以偵測到基因的最終產物-蛋白質及特殊

摘要免疫組織化學法可以偵測到基因的最終產物－蛋白質及特殊的微量分子，它是一種可用來偵測基因表現(xiàn)的方法。本試驗中我們利用免疫組織化學法，追蹤水稻的磷酸酵素以及茶葉的ABA。（一）水稻：有一種磷酸酵素可以將有機磷分解為無機磷，它可以使原本沒有此酵素的單胃動物分解有機磷，而消化吸收無機磷，使排泄物中有機磷減少，以降低環(huán)境汙染。目前已經有利用農桿菌法轉殖此酵素的基因的轉殖水稻，本試驗中取其子代發(fā)芽5天，經固定、切片後做免疫組織化學法位置，追蹤基因表現(xiàn)的位置。實驗結果發(fā)現(xiàn)，位於糊粉層的細胞反應最明顯，最外層的退化細胞及種皮細胞也有少許反應，表示糊粉層、退化細胞和種皮細胞中都有此磷酸酵素的存在。位於內側含有澱粉的胚乳細胞也有磷酸酵素存在，推測是糊粉層的磷酸酵素擴散所產生的結果，其餘的部位，如水稻葉片，則推測是利用維管束運送磷酸酵素的結果。未轉殖的水稻本身則僅有少許的磷酸酵素，顯示在基因轉殖的水稻中，磷酸酵素確實能大量表現(xiàn)。（二）茶葉：在茶葉方面，我們發(fā)現(xiàn)在不同溫度下，葉片細胞內ABA的表現(xiàn)有明顯的差異，溫度愈高，ABA的反應愈強烈，尤以上下表皮細胞的反應最為明顯，內部的柵狀、海棉細胞的藍色反應則為較分散。另外，我們也發(fā)現(xiàn)，溫度愈高，柵狀細胞的排列愈不整齊，細胞也愈小，而海棉細胞在溫度愈高則愈緊密，氣室愈小。根據(jù)前人的實驗數(shù)據(jù)得知，溫度愈高，葉片厚度愈薄，推測是茶葉葉片細胞排列愈緊，細胞外形愈小，以致整體厚度變薄。一般茶葉在低溫的生長條件下品質較佳，可能是因為溫度較高時，茶樹葉片產生較多的ABA，會限制葉片細胞之生長與擴大，此種現(xiàn)象有可能即為生長於高山低溫環(huán)境的茶葉品質較好，生長情形較高溫環(huán)境佳的原因。我們也觀察到茶葉切片兩端切口的細胞ABA反應較切片中間的細胞強烈，而且溫度愈高，差異愈明顯，推測可能是在取樣時，受外力施壓而產生某種反應，使得ABA反應更為強烈。茶樹葉片在不同的固定液下也有不同的反應，我們使用FAA及Paraformaldhyde兩種固定液，發(fā)現(xiàn)在Paraformaldhyde固定液固定之下，染色的反應較為強烈，推測可能是因為FAA只能保持細胞型態(tài)，內部許多構造會被高濃度的酒精溶解，而Paraformaldhyde對細胞內分子的保存較有利，使得Paraformaldhyde固定的茶葉切片ABA反應較明顯。研究動機現(xiàn)在有越來越多人投入基因轉殖的工作，基因轉殖的技術越趨成熟，是目前生物科技中最具前瞻性的技術?；蜣D殖應用在農業(yè)方面，可以增加農產品的產量及附加價值。舉例來說：在水稻的改良上，將基因轉殖到水稻中，使基因表現(xiàn)在水稻植株中，可以增加水稻的抗逆境能力或是附加的營養(yǎng)價值。對於轉殖成功的植物，我們需要觀察轉殖後基因的表現(xiàn)位置，以及基因在組織中表現(xiàn)的情形，並依此改善基因轉殖的技術。目前，在基因轉殖技術上，偵測基因表現(xiàn)的方法很多，其中以免疫組織化學法(Immunohistochemistry)可以偵測到基因的最終產物—蛋白質，並且可以追蹤到細胞的層次，將有助於了解基因表現(xiàn)的確實位置及可能的功能。而且免疫化學組織法是一種非常靈敏的偵測方法，即使是基因產物非常微小，含量非常低，都可以偵測出來。因此是分子生物學研究上必備的技術。在茶葉方面，我們也用相同的技術，以觀察溫度對茶葉中ABA的影響。溫度是影響植物生長的主要條件之一，而高山茶成長於低溫環(huán)境中，一般認為品質較好，其原因則不明。據(jù)前人研究顯示，當植物處於溫度逆境時，細胞內ABA的含量發(fā)生變化，ABA是一種重要的植物激素，也是訊息傳導的重要物質，會影響許多生理變化，但目前尚沒有研究探討其是否也與品質有關，因此，這個現(xiàn)象吸引了我們探討溫度、ABA與茶葉品質之間的關係。由於ABA含量非常低，無法用一般的化學反應偵測，而免疫組織化學法的靈敏性是最理想的偵測ABA位置的方法。研究目的利用免疫組織化學法，追蹤水稻種子內基因表現(xiàn)位置與反應程度，以了解種子內各種不同組織的反應，以及已轉殖的基因表現(xiàn)。應用在茶葉上，觀察在不同溫度之下生長的茶葉葉片中，ABA表現(xiàn)的位置與反應的程度，以及各種組織間的差異，並比較不同溫度中，茶葉葉部解剖構造上的變化。研究設備與器材研究設備與器材真空抽氣器烘箱陶瓷方模切片機超音波洗淨器加熱箱（55～58℃）方型玻璃染色缸玻片架免疫反應盒磁性攪拌器pH儀電子天枰溫室製冰機蒸餾水製造機振動攪拌器計時器光學顯微鏡照相機酒精燈底片藥品basicfuschinbrome-4-chloro-3-indolyl-phosphatechromealbumdistH2Oethanolentellen膠formalingelatinglutaraldehydeglacialaceticacidglycerolH2SO4HClH5IO4KCr2O7MgCl2.6H2ONaOHNaClNa2HPO4.12H2ONaH2PO4.H2Oparaffin（石蠟）paraformaldehydeprimaryantibody—抗磷酸酵素primaryantibody—抗ABASAPsafraninsecondaryantibodysodiummetasilicatesodiumbisufitet－butanoltristween20xylene活性碳4-nitrobluetetrazolumchloride研究內容研究問題植物在經過基因轉殖之後，基因會表現(xiàn)在植物的哪一個組織、構造中？轉殖後的基因，在植物的子代細胞中的表現(xiàn)情形如何？在水稻各個不同的部位中，基因的表現(xiàn)有何不同？在不同溫度下，茶葉細胞與組織有何差異？在不同溫度的影響下，茶葉細胞中的ABA有何不同？比較不同品種之茶樹葉片對溫度反應之差別。實驗原理(1)轉殖磷酸酵素的水稻多胃型動物的胃中，有一種磷酸酵素可以將有機磷結合態(tài)分解出磷酸，再被動物消化利用。而動物所排出的糞便中，就會因為磷酸已被消化分解而沒有磷酸排出，會使得水的汙染降低。而單胃的動物中無法自行製造這種酵素。因此有機磷沒被分解，會隨排泄物排到水中造成許多藻類生長，進而引起優(yōu)養(yǎng)化，所以我們轉殖這種酵素到水稻裡，在種子發(fā)芽時表現(xiàn)，產生更多此種酵素，用以餵食單胃型動物。一方面促進動物對磷酸的利用效率，並降低水源的污染，另一方面則可以增加水稻的附加價值。(2)茶葉臺茶12號與青心烏龍這兩種茶葉品種非常受到國人喜愛，尤其臺茶12號（又名金萱茶）味甘甜特別受到年輕人的喜愛。此兩種茶葉因習性與其他各品種之茶葉相近，因此具代表性可用來作為研究茶葉葉片內之ABA與溫度的關係。實驗中將茶葉經取樣、固定、切片之後，再經免疫組織化學法，追蹤ABA在不同溫度及不同組織下的分布情形，並推測ABA與茶葉品質的關係。(3)免疫組織化學法(參考圖一)我們加入primaryantibody(PAb)找到原來的antigen，因為PAb在細胞裡面還是太小了，所以我們再加入secondaryantibody(SAb)將鍵結連接到PAb，再加入SAP連結SAb，因為SAP會產生一連串的反應，必須在一段時間內終止反應，再加入呈色劑呈色可看出藍色反應即為基因表現(xiàn)位置，如果一開始用磷酸酵素的PAb，則呈色位置即為磷酸酵素，如果一開始用ABA的PAb，則呈色位置表示ABA的存在。實驗步驟(1)取樣：A.水稻：利用Agrobacterium-mediatedtransformation(農桿菌法)將磷酸酵素轉殖到水稻裡(T0)，再利用自交產生的子代(T1)種子，使它發(fā)芽5天，使磷酸分解酵素產量達到最高，進行固定切片觀察，利用免疫組織化學法追蹤基因的表現(xiàn)位置。[註][註]基因結構：◎啟動子(promoter)：α-Amylase7，α-Amylase8種子泡水時，胚開發(fā)生長，分泌GA，當糊粉層受GA刺激會分泌α-澱粉分解酵素(α-Amylase)，將澱粉分解為葡萄糖等其他小物質。利用這澱粉分解酵素的promoter，當成磷酸酵素的promoter，可以使磷酸酵素在水稻種子發(fā)芽時大量表現(xiàn)?！騡enebody：ruminal(牛胃)和E.coli(大腸桿菌)的磷酸分解酵素?！騮erminator：nos或3’UTRB.茶葉：茶樹栽種在30/25℃、25/20℃、20/15℃、15/13℃(日/夜)的人工氣候室中，採取枝條上距離新芽第二片的葉片，用打洞器取葉的圓片，進行固定切片、觀察、利用免疫組織化學法偵測ABA的變化。(2)組織切片步驟A、固定(fixation)：目的：保持組織完整形態(tài)及內容物。方法：a.FAA固定：為最常用的固定法，對細胞質與細胞核的保存均佳，用於一般染色觀察。b.Paraformaldhyde：glutaldehyde固定：對膜系構造、蛋白質及脂質等有較佳保存效果，適用於電子顯微鏡觀察及組織免疫化學法。步驟：1.配製FAA----福馬林(formalin)：冰醋酸(glacialaceticacid)：50%~70%酒精=5：5：90(v/v/v)。需要量為材料體積的20倍以上，用時新配。2.配製paraformaldhyde：glutaldehy溶液----配法：4%paraformaldehyde1%glutaraldehyde0.8%NaCl10mMphosphatebufferpH7.2◎首先製200mL10mMphosphatebuffer：A液：0.2MNa2HPO412H2O(7.16g/100mL)B液：0.2MNaH2PO4?H2O(2.76g/100mL)取A液7.2mL，B液2.8mL加水至200mL，即為10mMphosphatebuffer，測定pH應為7.2左右[註：若>7.2則加B液NaH2PO4調整，若<7.2則加A液Na2HPO4調整]◎秤取8gparaformaldehyde，加入phosphatebuffer以磁場攪拌，可略加溫，以助paraformaldehyde溶解。◎完全溶解後，加入1.6gNaCl?！蚣尤?mLglutaraldehyde3.處理材料----將固定液置於蠟板上或培養(yǎng)皿內，立刻剪取新鮮材料並放置在固定液內，進行切割。最好能將材料切成標準大小0.4x0.4x0.6cm若類似榖類等不易切割的材料，則應將根、芽與種子切離，再個別處理。4.將處理好的材料、固定液(材料的20倍體積)加入瓶中(一個固定瓶約10mL，以鉛筆書寫標籤(不可用原子筆、簽字筆書寫，會被有機溶液溶掉)，同材料一併裝入瓶中，勿貼於瓶壁外側。5.打開瓶蓋，置於抽氣缸內抽氣30分鐘至1小時，使組織內氣泡釋出，材料沉在固定液內。6.停止抽氣，取出固定瓶，加蓋。靜置固定24小時(不宜過久)。靜置期間，每隔一段時間需將培養(yǎng)液加以搖勻，幫助局部水分累積濃度能散開。7.固定完成後可以50%酒精清洗，繼續(xù)進行脫水步驟?；蛞?0%酒精置換固定液後，放置冰箱4℃保存。B、脫水(dehydration)：目的：去除組織內水分，便於保存。且水與蠟不互溶，必須以有機溶劑取代水，增加滲蠟效果。步驟：1.配製脫水溶液(本實驗室使用丁醇butanol系列)。依照下列脫水流程的比例在使用前配製並先估計所需的量，約為材料體積的20倍，配製適量即可，不要浪費。各溶液並加以標示：將瓶身上原有標籤清除，避免重複標示的錯誤，各溶液要標示其成分，且瓶身、瓶蓋皆要有相同的標示。2.以脫水溶液置換固定液後，依脫水流程所標示的時間靜置脫水，每隔30分鐘需將溶液加以搖勻，幫助局部水分累積濃度能散開。◎脫水流程：漸進地將水抽離，避免空氣的水蒸氣。(1)t-butanol：95%ethanol：H2O=10：40：502小時(2)t-butanol：95%ethanol：H2O=20：50：302小時(3)t-butanol：95%ethanol：H2O=35：50：152小時(4)t-butanol：95%ethanol=55：452小時(5)t-butanol：100%ethanol=75：252小時(6)t-butanol(含少量safanin使樣品染成紅色，易於觀察組織位置與方向）2小時(7)t-butanol隔夜[註]：材料若堅實不易滲透者，可延長脫水時間。C、滲蠟(infiltrationofparaffin)：目的：以蠟取代組織內丁醇，使蠟與材料的軟硬度較接近，避免切片時造成彎帶、過分皺縮等情況。步驟：1.純蠟的製備----以容器盛置蠟塊，置烘箱中(55℃~60℃)熔化，以濾紙過濾雜質即可。舊蠟過濾2次，新蠟過濾1次就可以了。(回收的舊蠟顆粒較細，所產生沉澱的顆粒較小，雜質較少，效果較新蠟佳)2.取滲蠟專用的固定瓶，瓶內填充約半瓶的純蠟，待其凝固後，加入蠟體積1/3的t-butanol，將材料連同標籤一併移入瓶內，不加蓋。若標籤被safanin染色太深，則更換新標籤。3.置於烘箱(55℃~60℃)中2天，讓t-butanol慢慢揮發(fā)，取出再換1次純蠟(約加滿至4/5瓶)，置回烘箱(55℃~60℃)2天後即可。滲蠟過程中，應經常打開烘箱門，以排除箱內的butanol。D、埋蠟(embedding)：目的：將材料固定於蠟塊中，方便切片。步驟：1.確定滲蠟瓶中有適量純蠟(約4/5瓶)。2.將陶瓷方模上的蠟及污垢清理乾淨，擦乾，塗上薄薄一層glycerol，置於酒精燈上加點溫度(約60℃~70℃)。[註]：glycerol可方便凝固蠟塊取出(glycerol不要塗太多或不均，會在蠟塊上形成油滴的凹洞或不規(guī)則的花紋)3.取出烘箱內蠟瓶，鑷子加熱，一口氣把材料與蠟倒入陶瓷方內以燒熱鑷子輔助推出材料，小心不要傷到材料。每一個方模放置適當數(shù)目之材料，例如標準大小的材料可放置6~8個。4.以燒熱鑷子將材料排列整齊，各材料間留有適當間距，待底部蠟有點凝固，以燒熱鑷子調整材料高度，注意材料不要太靠近底部或頂部，預留可以修飾的空間。此外，並將標籤插在蠟塊的角落。5.準備一盆水，底放一支鑷子，待模內蠟凝固後，小心放入水中架在鑷子上，使蠟塊冷卻均勻。待凝固後取出，以單面鋼刀插入模與蠟的交接處模的邊緣，將蠟塊取出。6.靜置蠟塊待冷透，再進行切片(可放入冰箱內加速冷卻)。E、載玻片的處理：目的：去除載玻片上的黴菌、灰塵、油污後，覆上粘附劑。步驟：1.淘汰發(fā)黴的載玻片。2.以清潔劑加水浸泡載玻片1小時。3.用乾淨的紗布擦洗載玻片，然後用微波振動器清洗(約20分鐘)，用清水沖掉清潔劑，再用蒸餾水潤洗一下。4.載玻片靜置晾乾後浸泡在95%酒精中保存。5.配製粘附劑----動物膠(gelatin)：chromealbum：H2O=0.5(g)：0.05(g)：99.45(ml)(w/w/v)將gelatin粉末及水加入燒杯中，放入攪拌子置於電磁加熱攪拌器上，微溫(不可過熱，gelatin為蛋白質，過熱會被分解)輕緩攪拌至全溶(攪拌不宜太劇烈，會破壞gelatin)，加入chromealbum，待溶解後再加入少量麝香（thymol）並過濾即可。6.將清潔的載玻片自95%ethanol取出，排列於不銹鋼玻片架籃上，待ethanol揮發(fā)後，浸入黏附劑中，10~15分鐘後取出自然乾燥即可。F、切片：目的：利用切片機埋在蠟中的材料切成連續(xù)薄片。步驟：1.粗修蠟塊----用單面鋼刀將蠟塊割成十塊，每一塊中含有一個材料，並使多餘蠟切除，使材料位於中央，前後預留適當?shù)木嚯x，前端以切片機前十刀不要切到材料為宜，但也不必要留的太多，基部可保留較多蠟塊，以便固定在軟木塞上。蠟塊上、下、左、右要保持平行。要注意蠟的方向，決定粗修的位置。2.將蠟塊固定在軟木塞或木塊上----(1)木塊裁切成適當大小(2)軟木塞或木塊上先要覆上一點蠟(3)鑷子燒熱在軟木塞或木塊上的蠟上沾一沾，使蠟熔化，將粗修蠟黏上軟木塞或木塊。依切片機的情況適度調整蠟塊最適位置，以燒熱的鑷子將固蠟塊基部週圍的蠟堆到蠟塊基部，以強固蠟塊。(4)待蠟冷固後，換雙面軟刀再對蠟塊作細修，一雙對邊保持平行，切片後蠟帶才不易彎曲。3.將木塊上切片機上，確實固定，，調整蠟塊和切片刀之間角，保持間角在4°~6°最佳，旋緊切片機上該旋緊的螺絲。平行的兩逼要和切片刀平行成三條平行線。4.調整切片厚度(通常為10μm)，利用轉輪將蠟塊推進到接近切片的位置，即可開始切片。5.一邊切片一邊以毛筆將蠟帶輕輕的往左帶，可避免靜電造成蠟帶捲曲。6.將蠟帶移到乾淨白紙上，觀察其外型及正面、反面，好的蠟帶必須是平整直線不捲曲，沒有傷痕缺裂，及明顯皺縮，每一片的大小厚薄均相同，面積不可小於原來蠟塊切面的2/3。[註]：若蠟帶不理想，請參考<<植物組織切片技術綱要>>(臺大植物系蔡淑華著)p37~p41，討論各種切片效果不佳的可能原因及改善方法，加以改進。7.張貼蠟帶----(1)取一以黏附劑處理過的乾淨載玻片，先在磨砂部分，用鉛筆寫上樣品代號，及日期等然後在無磨砂部份的玻璃上覆一層蒸餾水。(2)取一乾淨軟刀，等距切下蠟帶(不要太長，約為軟刀之4/5即可，以免展蠟後組織長度超過載玻片，或封片時組織長度超過蓋玻，造成浪費)，以鑷子沾水黏附蠟帶，將蠟帶帶到載玻片上，使其漂浮於蒸餾水面(勿用鑷子夾取蠟帶，以免損傷材料)，一片載玻片上要放多少條蠟帶，依不同的材料大小而有所不同，約為4~6條。以鑷子輕輕調整蠟帶避免重疊、折皺或超過載玻片外圍，並使蠟帶完全自由地漂浮在水面上，特別注意蠟帶不要卡在水滴的週邊，以免會影響到蠟帶的展開。8.展蠟----將載玻片置於加熱箱的下層(55℃~58℃)數(shù)分鐘，使蠟帶展開，溫度不要過高，時間不可太久，以免水分蒸發(fā)，產生氣泡甚或造成蠟的熔化。展蠟完畢後，倒去多餘的蒸餾水，調整蠟帶至載玻片中央，移到加熱箱上層(溫度較低)待其餘水分慢慢地完全蒸乾，即可收藏在切片保存盒內，待進一步工作。[註]：張貼蠟帶及展蠟過程中與玻片保存時，均要注意避免灰塵，粒子粘附在玻片上。影響切片優(yōu)劣的因素甚多，應多練習，切片較易成功且清楚美觀。G、脫蠟染色：目的：去掉組織上的蠟，並將組織與細胞染色以便於以光學顯微鏡察。步驟：脫蠟染色流程----xylene10minxylene10minxylene：100%ethanol(1：1)10min(4)100%ethanol5min(5)95%ethanol5min(6)85%ethanol5min(7)75%ethanol5min(8)50%ethanol5min(9)1.5%safranin(溶於50%ethanol中)隔夜(10)以蒸餾水將多餘染劑洗除----先用自來水不斷沖洗玻片約15min，再改泡於蒸餾水中2~3次，每次10min。將各上述溶液配製好，放入染色玻璃缸內，每缸大約150mL，並清楚標示編號、溶液名稱，依序排好，將切片展蠟後的玻片整齊置於玻片架籃上，注意有切片的一面都朝向同一方向，依上述程序泡入缸中，至步驟(9)隔夜。[註]：1、在配製85%、75%、50%ethanol時，可同時配製兩缸，封片過程也要用到。2、玻片架要由前一缸溶液換到第二缸溶液時，要儘量將多餘的溶液瀝乾，以免溶液互相污染?？蓪⒉Ｆ芑@靠著玻璃缸四角，傾斜讓多餘玻璃缸壁流下，然後取出玻片架籃放在紙巾上，儘量吸掉多餘的溶液。3、Safranin染劑易殘留在架籃上，使用後須徹底清洗乾淨。H、免疫化學法：目的：以免疫染色法觀察某些物質在組織中分布的位置。步驟：免疫流程----(1)Dist.H2O(2)TBSTbuffer10minx3(3)primaryantibody(PAb)60min(4)TBSTbuffer10minx3(5)secondaryantibody(SAb)60min(6)TBSTbuffer10minx3(7)SAP60min(8)TBSTbuffer10minx3(9)NBT+BCIPstain15~30min(indark)(10)Dist.H2O溶液的配製----(1)TBST緩衝液----20mMtris-HCl，500mMNaCl，0.3%tween20(v/v)，調整pH值為8.2?？膳溲u成5倍貯存液，存放於4℃，使用時稀釋為1倍溶液。(2)Primaryantibody(PAb)使用液配製----將貯存液取出，以TBST緩衝液稀釋1000倍(v/v)。(3)Secondaryantibody(SAb)使用液----將貯存液取出，以TBST緩衝液稀釋1000倍(v/v)。(4)SAP溶液使用液----購得SAP原液後，先分裝在500μLeppendorftube，每管中有50μL，存放於4℃使用時，將貯存液取出，以TBST緩衝液稀釋成100μl/45ml。(5)呈色劑----◎藥品來源----NBT：4-Nitrobluetetrazolumchloride，PIERE，溶於70%dimethylformamide，分裝於1.5mLeppendorftube，存在於-20℃。BCIP：Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，PIERE，溶於100%dimethylformamide，分裝於1.5mLeppendorftube，存在於-20℃?！蚴褂靡号溲u----取100μLNBT及50μLBCIP加入的鹼性磷酵素緩衝液(alkalinephosphatasebuffer：100mMNaCl，5mMMgCl2?6H2O及100mMTris，調整pH值為9.5)，配成100μlNBT和50μLBCIP兩種溶液。再加入15ml的磷酵素緩衝液。待要使用時再迅速混合，快速加入免疫反應盒中，置於黑暗中。保持黃色。準備投影片，將乾淨投影片切割成玻璃蓋玻片的大小(5.2x2.5cm)，泡在95%酒精內，取出以乾淨紗布擦拭乾淨，置於乾淨的培養(yǎng)皿中。將完成脫蠟處理的玻片置於免疫反應盒中，每盒可放5個玻片，依上述流程以TBST緩衝液潤洗3次(10分鐘/次)。取出免疫反應盒中的玻片，滴加100μL的Primaryantibody後，蓋上投影片。取一大小適中的塑膠盒，底舖紙巾，加入蒸餾水保持濕潤，上層加一架子，將玻片整齊排列架上，蓋上蓋子靜置於室溫下60min。最好在黑暗中進行，保持潮濕。待反應完後，取下投影片，以1mLTBST沖洗樣品2~3次，再進行下一步驟。投影片用過即丟棄，塑膠盒內紙巾及蒸餾水每次皆須更換。將玻片換至新免疫反應盒中，以TBST沖洗3次(10分鐘/次)玻片取出，進行SAb處理，方法同第4步驟PAb處理。取下投影片，將玻片置入新的免役反應盒，加入TBST沖洗3次(10分鐘/次)。9.再將玻片換到新的反應盒中，加入15mLSAP液，反應60min。10.玻片再換到新的反應盒中，以TBST沖洗3次(10分鐘/次)11.加呈色劑時，需將樣品換到新的反應盒中，迅速配製新鮮的呈色劑，快速倒入反應盒中，隨即置於室溫黑暗中反應15~30min。12.呈色反應後，浸入蒸餾水中，換過一次水即可，可在這一步驟隔夜。I、Starch染色：步驟：Starch染色流程----可以安排在脫蠟染色或在免疫染色步驟之後。(1)Dist.H2O(2)0.5%periodicacid(H5IO4)15min(3)Dist.H2O10min(4)Schiff’sreagent10min(5)Dist.H2O10min(6)2%sodiumbisulfite2min(7)Dist.H2O1、各溶液的配製：0.5%periodicacid(H5IO4)----取1.0gperiodicacid粉末，溶於200ml蒸餾水中即可，製備完成的溶液要避光保存。Schiff’sreagent----0.5%basicfuschin，0.5%sodiumMetasilicate，0.15NHCl(83mL的37%HCl配成1L為1N)，均勻溶解後，加入多量活性碳，脫色10min。後NO1濾紙過濾，活性碳處理需重複數(shù)次直到紫紅色退為透明即可。製備完成的溶液避光。2%sodiumbisulfite----取4.0gsodiumbisufite溶於200mL蒸餾水即可。製備完成的溶液要避光保存(可用鋁箔或黑色膠紙，包好貯存3種溶液之玻璃缸)。2、Schifftsreagent染色力極強可重複使用甚多次，但必須注意保持在黑暗中貯存，若溶液呈現(xiàn)桃紅色，可再用活性碳脫色，過濾後再使用。3、用於染色的那個玻片架籃做上記號，以後都用此架籃做染色。J、封片：目的：將玻片脫水做成永久玻片，便於保存。步驟：封片程序----(1)50%ethanol5min(2)75%ethanol5min(3)85%ethanol5min(4)95%ethanol5min(5)100%ethanol10min(6)100%ethanol10min(7)xylene：100%ethanol(1：1)10min(8)xylene10min(9)xylene保存在xylene中至少10min至封片時再取出將玻片放到玻片架籃上，依上列程序浸泡溶液，注意前一次溶液要儘量去除，尤其到後來100%ethanol要達到完全無水狀態(tài)。製備乾淨的蓋玻片----將玻璃蓋玻片浸泡在95%ethanol中，以乾淨的紗布一片片擦拭，把蓋玻片上的油漬、灰塵去掉(注意，手碰過的那一面紗布，就不要再去擦拭蓋玻片)，將乾淨的蓋玻片裝入乾淨的培養(yǎng)皿內，加蓋並標示。取部分entellen膠(Merck)置於有蓋可旋緊的15mL塑膠離心管中備用，因為entellen容易凝固，可加入xylene使之溶解)，準備一支約15cm長的乾淨玻棒置於另一15mL離心管內。依下列步驟封片----(1)自xylene玻璃缸中取出一片載玻片，略為風乾，有材料的面朝上，磨砂標示在左側，切片在右側。(2)以玻棒沾取entellen膠，滴在載玻片中央形成一條帶，將玻棒置回離心管內存在，以免到處沾黏。(3)取一乾淨蓋玻片，托住使傾斜45°慢慢放下，讓Entellen膠慢慢展開，蓋住所有切片，注意不要有氣泡生成，若膠分布不均，可將玻片傾斜靠在盒子邊上，幫助展開均勻。(4)處理好之玻片，置於平面玻片板存放上，上覆一層塑膠袋防灰塵等異物，約一天後；封膠可完全乾燥，玻片不會再滑動，即完成封片。六.研究結果與討論（一）水稻在水稻發(fā)芽種子的切片中，確實可以看到免疫反應，而且不同部位，不同組織中，反應強弱差別很大，由於切片的位置不同(參考圖二)，分為以下兩個部分說明：胚乳(endosperm)簡稱En根據(jù)實驗結果，在胚乳最外一層的退化細胞及種皮、糊粉層，即內部一些澱粉細胞染上顏色，可知道在這些細胞中，有磷酸酵素的反應，尤其是在糊粉層表現(xiàn)最為強烈。因為糊粉層是α-Amylase表現(xiàn)的重要位置，因此，此結果符合預期。2.最外層的退化細胞也有深藍色反應，表示這個地方也有一些磷酸酵素，種皮（或果皮）也有反應，內部含大量澱粉的胚乳細胞也許是靠擴散作用將磷酸酵素擴散進去的。3.ck是表示未轉殖磷酸酵素進去的水稻，發(fā)現(xiàn)也有一些反應，但比轉殖過的水稻反應弱，而反應的地方也大都類似轉殖過水稻的反應位置，可能是水稻本身也有一些磷酸酵素。4.在不加PAb的切片中，完全沒有反應，顯示免疫過程中沒有背景污染。(2)胚芽(embryo)簡稱Em反應大部分在外層的退化細胞，種皮細胞，糊粉層，內部的澱粉細胞已經很弱了，從400倍的照片可看出糊粉層的位置及染色程度，邊緣的紅色部分為胚芽中胚盤組織，可依據(jù)其大小判斷切片切到水稻的位置。未轉殖的種子在胚芽中也有一些反應，只在糊粉層及外層細胞有些微的反應，也可能是因為未轉殖的水稻本身含有一些磷酸酵素。有些切片的種皮細胞已經退化萎縮成很小的組織，糊粉層變得很明顯。在不加PAb的切片中，完全沒有反應，顯示免疫過程中沒有背景污染。在P.的照片中有一恰好切到新生嫩葉的切片，圖片中央的構造顯示出多層葉片內包著未展開的幼嫩葉片，其內部也有少許反應，這個現(xiàn)象可能是磷酸酵素利用植物的維管束傳送到其他地方所造成的。水稻種子中的胚芽部分safranin染色的反應較其餘的地方強烈許多，可能是因為其細胞質較濃密，safranin較易累積在細胞中。（二）茶葉(1)不同溫度下，茶葉細胞的ABA反應的差別經過免疫染色，臺茶12號及青心烏龍的葉部細胞在上下表皮及柵狀細胞、海綿細胞皆產生深藍色反應，表示其細胞內含有ABA，尤以上下表皮的反應較為強烈。觀察不同溫度下，ABA在葉內細胞含量的差別，生長於日間溫度15℃、夜間溫度13℃的臺茶12號及青心烏龍的葉部組織反應最弱，只有在少數(shù)的海綿組織及上下表皮細胞產生少許藍紫色反應，生長在日間溫度20℃、夜間溫度15℃的茶葉細胞，ABA的反應次弱，生長於日間溫度25℃、夜間溫度20℃的茶葉細胞，ABA的反應較前兩者強，ABA反應最強烈的是生長於日間溫度30℃，夜間溫度25℃的茶葉細胞。初步推測，可能由於茶葉在低溫條件下生長的情形較佳，因此相對的高溫環(huán)境成為茶葉的逆境，能夠產生較多的ABA，生長情形也較不好。根據(jù)觀察結果，大致上，溫度愈高，葉部細胞愈小。尤其是柵狀細胞第三層明顯變小，排列也愈不規(guī)則。觀察海綿細胞，則發(fā)現(xiàn)溫度愈高，細胞排列愈緊密，氣室愈小。之前曾經有一個關於茶葉葉部厚度的試驗指出：生長於溫度愈高的環(huán)境，茶葉厚度愈薄，其研究結果之數(shù)據(jù)如下頁：溫度（日/夜）臺茶12號青心烏龍35/30℃0.276cm0.299cm25/20℃0.296cm0.311cm15/13℃0.305cm0.335cm依據(jù)此數(shù)據(jù)與之前觀察之結果推測：溫度較高時，茶樹葉片產生較多ABA限制葉片細胞之生長與擴大，此種現(xiàn)象有可能即為高山生長於低溫的茶葉品質較好，生長情形較佳的原因。觀察茶葉葉部ABA之分布，靠近兩端（即取樣時切割處）有非常明顯的反應，較切片中段之反應強烈，且溫度越高兩端與中段之藍色相差愈大，25/20℃、30/25℃兩端包括上下表皮，柵狀細胞，海綿細胞皆有強烈反應，但較接近中段部分，則幾乎只剩下表皮細胞有ABA產生，柵狀細胞，海綿細胞只有少數(shù)有ABA反應，但溫度較低。如：20/15℃、15/13℃之切片兩端與中段相差不甚大，此種現(xiàn)象很可能是當初切口在取樣時受到外力施壓，使細胞發(fā)生某些變化而產生ABA，因為取樣至固定時間非常短暫，而可推知ABA產生的速度非?？?，且溫度越高，ABA產生的速度就越快，且也觀察到溫度越高，兩端深藍色範圍越寬，更顯示此