時間分辨熒光免疫技術(shù)培訓(xùn)課件整理

主要內(nèi)容時間分辨熒光免疫技術(shù)（TRF）定義。TRF的標(biāo)記物及特點。為什么叫“時間分辨”?TRF在免疫分析方法學(xué)中的地位。各種免疫方法學(xué)的比較。臨床應(yīng)用主要內(nèi)容時間分辨熒光免疫技術(shù)（TRF）定義。1回顧標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展放射免疫 （精度：10-12mol/L）酶聯(lián)免疫 （精度：10-9mol/L）膠體金標(biāo)記 （金標(biāo)：10-15mol/L）化學(xué)發(fā)光 （精度：10-15mol/L）電化學(xué)發(fā)光 （精度：10-17mol/L）時間分辨熒光（精度：10-18mol/L）生物芯片回顧標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展放射免疫 （精度：10-12mol/L）2時間分辨熒光技術(shù)

（Time-ResolvedFluorescence）時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）時間分辨免疫熒光分析（TRIFMA）時間分辨熒光核酸探針分析時間分辨熒光細(xì)胞活性分析時間分辨熒光探針分析時間分辨熒光技術(shù)

（Time-ResolvedFluo3時間分辨熒光技術(shù)原理（TRF）用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì)；當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的特點（特異性強、熒光光譜的Stokes位移、壽命長），用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應(yīng)最后產(chǎn)物的熒光強度。根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。時間分辨熒光技術(shù)原理（TRF）4時間分辨熒光免疫原理圖（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）時間分辨熒光免疫原理圖（Time-resolvedFluo5時間分辨熒光免疫試劑

工作原理示意圖時間分辨熒光免疫試劑

工作原理示意圖6微量反應(yīng)孔包被好的表面抗體微量反應(yīng)孔包被好的表面抗體7表面抗原表面抗原8V標(biāo)記物輕鏈螯合劑Eu重鏈V標(biāo)輕鏈螯合劑Eu重鏈9VV10VV11HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH12HH13時間分辨熒光免疫技術(shù)培訓(xùn)課件整理14標(biāo)記物為具有獨特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有15種，應(yīng)用在時間分辨熒光免疫技術(shù)中有四種：銪(Eu)、釤（Sm)、鏑(Dy)、锝(Te)鑭系元素?zé)晒馓攸c：熒光壽命極長鑭系元素螯合物（60~900us)<銪：714us>普通熒光免疫中熒光團(tuán)：1~100us樣本中蛋白質(zhì)熒光：1~10us，易猝滅。Stokes位移大（大約290nm）銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，熒光素的Stokes位移為28nm熒光特異性強。（發(fā)射光譜帶很窄：615±5nm）解離-增強技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍標(biāo)記物為具有獨特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有15利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦裕瑹晒饧ぐl(fā)后在固定時間段檢測特異性熒光而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0時間分辨熒光免疫原理圖利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦裕瑹晒饧ぐl(fā)后在固定時間段檢測特異性熒16利用鑭系元素光譜特點，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的又一保障發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移?？梢酝ㄟ^干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。利用鑭系元素光譜特點，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的17DELFIA技術(shù)為臨床檢測帶來的先進(jìn)性技術(shù)特點檢驗先進(jìn)性時間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零背景、高特異性解離-增強熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍更寬重復(fù)性更好原子標(biāo)記標(biāo)記位點多，可達(dá)20個對標(biāo)記物結(jié)構(gòu)及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性，高精確度試劑保質(zhì)期至少一年標(biāo)準(zhǔn)曲線保留時間長同一批次只需兩點定標(biāo)多標(biāo)記單，雙，三，四標(biāo)記同一試劑盒可同時測多個項目DELFIA技術(shù)為臨床檢測帶來的先進(jìn)性技術(shù)特點檢驗先進(jìn)性時間18靈敏度更高，檢測范圍更廣以下數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己的產(chǎn)品說明書試劑 DELFIA ImmuliteACS-180 AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L

TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/mlFSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 無 0.1-40ng/ml

Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml

靈敏度更高，檢測范圍更廣19時間分辨熒光免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)穩(wěn)定，同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲線定標(biāo)0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定，試劑保質(zhì)期時間長時間分辨熒光免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)穩(wěn)定，0.5120放射性免疫分析法（RIA）應(yīng)用放免自60年代問世以來對臨床診斷起了革命性的貢獻(xiàn)，是一項較為成熟的診斷技術(shù)。夾心法、競爭法的標(biāo)記原理為以后的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。缺點放射性（125I），對環(huán)境的污染及對身體的危害，該方法已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費。操作繁瑣，出報告時間長。無法保存?zhèn)溆谩７派湫悦庖叻治龇ǎ≧IA）應(yīng)用缺點21酶免疫分析法（ELISA）應(yīng)用酶免的最大優(yōu)勢在于避免了對環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。衍生技術(shù)：熒光酶免疫分析增強化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)曾經(jīng)一度被認(rèn)為是取代放免的檢測手段。缺點靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽性。因酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性不好。酶免疫分析法（ELISA）應(yīng)用缺點22化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）應(yīng)用單個樣本檢測速度快，適合做急診。靈敏度較高。自動化程度高。分類：以丫啶酯直接標(biāo)記—ACS180系統(tǒng)以HRP標(biāo)記，魯米諾為發(fā)光底物—Amerlite系統(tǒng)以AP為標(biāo)記物，AMPPD為發(fā)光底物—Immulite系統(tǒng)缺點發(fā)光過程短，樣品不能重復(fù)檢測。本底較高，易受環(huán)境物質(zhì)干擾。儀器故障率較高。試劑穩(wěn)定性較差，需多次定標(biāo)。檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑；試劑價格高?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）應(yīng)用缺點23電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECL）應(yīng)用80年代末期問世的新型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法?；驹恚焊鶕?jù)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。缺點非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。試劑價格過高。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECL）應(yīng)用缺點24時間分辨熒光免疫的試劑種類內(nèi)分泌科檢查甲狀腺系列： TSH，UltraTSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TG糖尿病系列： Insulin，C-Peptie生長激素類： hGH其他： Cortisol婦產(chǎn)科檢查FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG腫瘤科檢查AFP，CEA，PSA，hTG，β-2Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSAEQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA-153*，CA-724*，CY-211*遺傳科檢查產(chǎn)前篩查： hAFP/HCG，PAPPA新生兒篩查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU核酸探針及基因雜交檢測，多標(biāo)記定量PCR檢測。肝炎系列甲肝，乙肝，丙肝血液科檢測貧血檢查： Ferritin，VitB12，F(xiàn)olicacid白血?。? 免疫細(xì)胞分型等細(xì)胞學(xué)檢查細(xì)胞毒試驗等多種檢測項目，細(xì)胞質(zhì)及組織化學(xué)分析等多種檢測項目酶類檢測及細(xì)胞受體檢測（包括MHC，HLA等多種檢測）科研工具單標(biāo)記檢測，雙標(biāo)記檢測，三標(biāo)記檢測，四標(biāo)記檢測時間分辨熒光免疫的試劑種類內(nèi)分泌科檢查25時間分辨熒光免疫---突出優(yōu)點零本底、靈敏度高線性范圍寬試劑有效期長標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定性好易于自動化TRFIA作為一項具有廣闊發(fā)展?jié)摿Φ男屡d生物學(xué)技術(shù)，將會給標(biāo)記免疫學(xué)帶來一場革命。時間分辨熒光免疫---突出優(yōu)點零本底、靈敏度高26時間分辨熒光與化學(xué)發(fā)光方法學(xué)比較 時間分辨熒光

化學(xué)發(fā)光發(fā)光效率 95% 1% 重復(fù)檢測 可無數(shù)次 不可重復(fù) 本底噪聲 零本底 干擾大靈敏級數(shù) 10-18 10-15標(biāo)記物 原子 大分子化合物 標(biāo)記位點 可達(dá)20個/抗體 1個/抗體 標(biāo)準(zhǔn)曲線 穩(wěn)定達(dá)一年以上 穩(wěn)定2到4周 多標(biāo)記 有，最多可達(dá)四標(biāo)記 無科研開發(fā) 有 無時間分辨熒光與化學(xué)發(fā)光方法學(xué)比較 時間分辨熒光27時間分辨熒光和電化學(xué)發(fā)光的比較

時間分辨熒光

電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物 四種原子:Eu,Sm,Te,Dy 一種原子:釕多標(biāo)記技術(shù) 有 無做科研 能(1000多種科研項目) 無試劑種類 58種臨床,24種科研,共82種 28種臨床,無科研試劑試劑價格 低 高時間分辨熒光和電化學(xué)發(fā)光的比較 時間分辨熒光 電化學(xué)發(fā)28泰萊—I時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)泰萊—I時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)29泰萊—I時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)高靈敏度 10-17mol/孔(Eu3+)線形范圍寬 10-13mol/孔—10-19mol/孔快速測試 1秒/一個樣品測試靈活 可以測試任意1-96個孔，樣品擺放位置不受限制標(biāo)本量靈活隨機配置泰萊—I全中文測試分析軟件 界面簡明友好，隨意進(jìn)行項目的選擇和參數(shù)篩選泰萊—I時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)高靈敏度30 謝謝各位光臨！

敬請各位指出不足并多提建議 謝謝各位光臨！

敬請各位指出不足并多提建議31謝謝！謝謝！32時間分辨熒光免疫技術(shù)培訓(xùn)課件整理33主要內(nèi)容時間分辨熒光免疫技術(shù)（TRF）定義。TRF的標(biāo)記物及特點。為什么叫“時間分辨”?TRF在免疫分析方法學(xué)中的地位。各種免疫方法學(xué)的比較。臨床應(yīng)用主要內(nèi)容時間分辨熒光免疫技術(shù)（TRF）定義。34回顧標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展放射免疫 （精度：10-12mol/L）酶聯(lián)免疫 （精度：10-9mol/L）膠體金標(biāo)記 （金標(biāo)：10-15mol/L）化學(xué)發(fā)光 （精度：10-15mol/L）電化學(xué)發(fā)光 （精度：10-17mol/L）時間分辨熒光（精度：10-18mol/L）生物芯片回顧標(biāo)記免疫學(xué)發(fā)展放射免疫 （精度：10-12mol/L）35時間分辨熒光技術(shù)

（Time-ResolvedFluorescence）時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）時間分辨免疫熒光分析（TRIFMA）時間分辨熒光核酸探針分析時間分辨熒光細(xì)胞活性分析時間分辨熒光探針分析時間分辨熒光技術(shù)

（Time-ResolvedFluo36時間分辨熒光技術(shù)原理（TRF）用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標(biāo)記抗原、抗體、激素、核酸探針等物質(zhì)；當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后，根據(jù)稀土離子螯合物的熒光光譜的特點（特異性強、熒光光譜的Stokes位移、壽命長），用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應(yīng)最后產(chǎn)物的熒光強度。根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。時間分辨熒光技術(shù)原理（TRF）37時間分辨熒光免疫原理圖（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）時間分辨熒光免疫原理圖（Time-resolvedFluo38時間分辨熒光免疫試劑

工作原理示意圖時間分辨熒光免疫試劑

工作原理示意圖39微量反應(yīng)孔包被好的表面抗體微量反應(yīng)孔包被好的表面抗體40表面抗原表面抗原41V標(biāo)記物輕鏈螯合劑Eu重鏈V標(biāo)輕鏈螯合劑Eu重鏈42VV43VV44HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH45HH46時間分辨熒光免疫技術(shù)培訓(xùn)課件整理47標(biāo)記物為具有獨特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有15種，應(yīng)用在時間分辨熒光免疫技術(shù)中有四種：銪(Eu)、釤（Sm)、鏑(Dy)、锝(Te)鑭系元素?zé)晒馓攸c：熒光壽命極長鑭系元素螯合物（60~900us)<銪：714us>普通熒光免疫中熒光團(tuán)：1~100us樣本中蛋白質(zhì)熒光：1~10us，易猝滅。Stokes位移大（大約290nm）銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，熒光素的Stokes位移為28nm熒光特異性強。（發(fā)射光譜帶很窄：615±5nm）解離-增強技術(shù)可使其熒光性提高100萬倍標(biāo)記物為具有獨特?zé)晒馓匦缘南⊥两饘?--鑭系元素鑭系元素共有48利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦裕瑹晒饧ぐl(fā)后在固定時間段檢測特異性熒光而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0時間分辨熒光免疫原理圖利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖匦?，熒光激發(fā)后在固定時間段檢測特異性熒49利用鑭系元素光譜特點，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的又一保障發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在的巨大Stokes位移。可以通過干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。利用鑭系元素光譜特點，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底的50DELFIA技術(shù)為臨床檢測帶來的先進(jìn)性技術(shù)特點檢驗先進(jìn)性時間分辨光譜分辨特異性熒光與非特異性熒光分離發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分離零背景、高特異性解離-增強熒光性大大提高穩(wěn)定的熒光螯合物線性范圍更寬重復(fù)性更好原子標(biāo)記標(biāo)記位點多，可達(dá)20個對標(biāo)記物結(jié)構(gòu)及活性影響小無衰變受環(huán)境影響小高穩(wěn)定性，高精確度試劑保質(zhì)期至少一年標(biāo)準(zhǔn)曲線保留時間長同一批次只需兩點定標(biāo)多標(biāo)記單，雙，三，四標(biāo)記同一試劑盒可同時測多個項目DELFIA技術(shù)為臨床檢測帶來的先進(jìn)性技術(shù)特點檢驗先進(jìn)性時間51靈敏度更高，檢測范圍更廣以下數(shù)據(jù)均出自于各制造廠家自己的產(chǎn)品說明書試劑 DELFIA ImmuliteACS-180 AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L

TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/mlFSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 無 0.1-40ng/ml

Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml

靈敏度更高，檢測范圍更廣52時間分辨熒光免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)穩(wěn)定，同一批次的試劑盒可用兩點法加批次的參考曲線定標(biāo)0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6標(biāo)準(zhǔn)曲線穩(wěn)定，試劑保質(zhì)期時間長時間分辨熒光免疫檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線相當(dāng)穩(wěn)定，0.5153放射性免疫分析法（RIA）應(yīng)用放免自60年代問世以來對臨床診斷起了革命性的貢獻(xiàn)，是一項較為成熟的診斷技術(shù)。夾心法、競爭法的標(biāo)記原理為以后的檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。缺點放射性（125I），對環(huán)境的污染及對身體的危害，該方法已經(jīng)為重視環(huán)保的國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）125I的半衰期短而導(dǎo)致其試劑有效期短。標(biāo)記物125I的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致試劑盒批間、批內(nèi)的變異較大；標(biāo)準(zhǔn)曲線有效期短，必須每次定標(biāo)，造成浪費。操作繁瑣，出報告時間長。無法保存?zhèn)溆?。放射性免疫分析法（RIA）應(yīng)用缺點54酶免疫分析法（ELISA）應(yīng)用酶免的最大優(yōu)勢在于避免了對環(huán)境和人體危害。試劑有效期較長。衍生技術(shù)：熒光酶免疫分析增強化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)曾經(jīng)一度被認(rèn)為是取代放免的檢測手段。缺點靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽性。因酶的純度和反應(yīng)過程容易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性不好。酶免疫分析法（ELISA）應(yīng)用缺點55化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）應(yīng)用單個樣本檢測速度快，適合做急診。靈敏度較高。自動化程度高。分類：以丫啶酯直接標(biāo)記—ACS180系統(tǒng)以HRP標(biāo)記，魯米諾為發(fā)光底物—Amerlite系統(tǒng)以AP為標(biāo)記物，AMPPD為發(fā)光底物—Immulite系統(tǒng)缺點發(fā)光過程短，樣品不能重復(fù)檢測。本底較高，易受環(huán)境物質(zhì)干擾。儀器故障率較高。試劑穩(wěn)定性較差，需多次定標(biāo)。檢測精度不高，在超微量分析及早期診斷方面能力不足。非開放性試劑；試劑價格高?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）應(yīng)用缺點56電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECL）應(yīng)用80年代末期問世的新型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法?；驹恚焊鶕?jù)三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。缺點非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。試劑價格過高。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法（ECL）應(yīng)用缺點57時間分辨熒光免疫的試劑種類內(nèi)分泌科檢查甲狀腺系列： TSH，UltraTSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TG糖尿病系列： Insulin，C-Peptie生長激素類： hGH其他： Cortisol婦產(chǎn)科檢查FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG腫瘤科檢查AFP，CEA，PSA，hTG，β-2Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSAEQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA-153*，CA-724*，CY-211*遺傳科檢查產(chǎn)前篩查： hAFP/HCG，PAPPA新生兒篩查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU核酸探針及基因雜交檢測，多標(biāo)記定量PCR檢測。肝炎系列甲肝，乙肝，丙肝血液科檢測貧血檢查： Ferritin，VitB12，F(xiàn)olicacid白血?。? 免疫細(xì)胞分型等細(xì)胞學(xué)檢查細(xì)胞毒試驗等多種檢測項目，細(xì)胞質(zhì)及組織化學(xué)分析等多種檢測項目酶類檢測