基因芯片技術(shù)及其應(yīng)用

基因芯片技術(shù)及其應(yīng)用摘要進(jìn)入21世紀(jì)以來，生命科學(xué)發(fā)展日益迅速，基因芯片作為生命科學(xué)研究的一種新的技術(shù)平臺日益受到人們的關(guān)注，并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、食品衛(wèi)生領(lǐng)域以及其它相關(guān)的各個學(xué)科領(lǐng)域。隨著技術(shù)的不斷完善，基因芯片必將在越來越多的領(lǐng)域里面發(fā)揮作用。本文闡述了基因芯片的基本概念及技術(shù)流程，簡述了其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用，并對其發(fā)展前景作了展望。關(guān)鍵詞：基因芯片技術(shù)流程應(yīng)用展望GeneChipTechnologyanditsApplicationShuMian(CollegeofHorticulture,SouthChinaAgriculturalUniversityGuangzhou510642,China)Abstract:Lifesciencehasdevelopedrapidlysincethe21thcentury,genechip,asanewtechnicalplatforminthereaseachofLifescience,hasgotincreasinglyattention,andhasbeenusedwidelyinlifescienceresearch>medicalresearch、foodhygienefieldandotherrelateddisciplines.Withthecontinuousimprovementofthetechnology,genechipwillbehelpfulinmorefields.Thisarticleexpoundsthebasicconceptsandtechnologicalprocessofgenechip,givesanintroductionofitsapplicationindifferentfields,andaprospectionofitsdevelopmentprospect.Keywords:genechiptechnologicalprocessapplicationprospection基因芯片(genechip)，又稱DNA芯片(DNAchip)或DNA微陣列(DNAmicroarray)，是生物芯片的一種類型，它是將DNA分子固定于支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，通過自動化儀器檢測雜交信號的強(qiáng)度來判斷樣品中靶分子的數(shù)量，進(jìn)而得知樣品中mRNA的表達(dá)量，也可進(jìn)行基因突變體的檢測和基因序列的測定，為進(jìn)一步了解基因間的相互關(guān)系及基因克隆提供有用的工具。作為一項(xiàng)基于基因表達(dá)和基因功能研究的革命性技術(shù)，基因芯片綜合了分子生物學(xué)、半導(dǎo)體學(xué)、激光、化學(xué)染料等領(lǐng)域的最新科學(xué)技術(shù)，將生物科學(xué)與生物信息學(xué)很好的聯(lián)系起來。目前，基因芯片已在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。1基因芯片技術(shù)原理基因芯片工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法是一致的，將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律的排列固定于玻片、硅片、陶瓷等固相支持介質(zhì)上，然后與待測的標(biāo)記的核酸樣品按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再經(jīng)過一定的檢測系統(tǒng)對雜交信號進(jìn)行檢測，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一雜交信號進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，從而迅速得出所要的信息。基因芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的雜交技術(shù)相比，具有高通量、微型化、自動化、高靈敏性和高速性的顯著特點(diǎn)，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交(SouthernBlotting和NorthernBlotting等)技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目標(biāo)分子數(shù)量少、成本高、效率低等不足。2基因芯片技術(shù)的技術(shù)流程2.1基因芯片的制作在制作基因芯片之前首先要對目標(biāo)芯片進(jìn)行設(shè)計(jì)，基因芯片的設(shè)計(jì)實(shí)際上是指芯片上核酸探針序列的選擇以及排布，設(shè)計(jì)方法取決于其應(yīng)用目的，如表達(dá)型芯片的目的是在雜交試驗(yàn)中對多個不同狀態(tài)樣品(不同組織、不同發(fā)育階段、不同藥物刺激)中數(shù)千基因的表達(dá)差異進(jìn)行定量檢測，探針序列一般來自于已知基因的cDNA或EST庫，設(shè)計(jì)時序列的特異性應(yīng)放在首要位置，以保證與待測目的基因的特異結(jié)合。對于同一目的基因可設(shè)計(jì)多個序列不重復(fù)的探針，使最終的數(shù)據(jù)更為可靠。基因芯片的制作方法主要有原位合成與合成后點(diǎn)樣兩種。2.1.1原位合成法利用光導(dǎo)合成的方法在載體表面逐個合成寡核苷酸，包括光導(dǎo)原位合成法、電壓打印法、流體通道合成法、分子印章法、機(jī)械點(diǎn)涂法等。目前應(yīng)用的主要有光導(dǎo)原位合成法、電壓打印法等，其關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和高合成產(chǎn)率的DNA化學(xué)合成技術(shù)，適合制作大規(guī)模DNA探針芯片，實(shí)現(xiàn)高密度芯片的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)。2.1.2合成后點(diǎn)樣法合成后點(diǎn)樣法是將合成好的十幾至幾十個堿基的寡核苷酸或幾百個堿基的cDNA片段固定到載體上制成寡核苷酸芯片或cDNA微陣列。如何將寡核苷酸或cDNA穩(wěn)定地固定在玻片表面是合成后點(diǎn)樣法制備基因芯片過程中的一個關(guān)鍵問題，國內(nèi)外關(guān)于芯片制備的方法很多，包括玻璃基片表面的修飾和寡核苷酸、cDNA的末端修飾等。2.2樣品的標(biāo)記從血液或組織中得到的生物樣品（DNA或mRNA）一般不能與芯片反應(yīng)，需進(jìn)行一定程度的擴(kuò)增，而且對樣品中的靶序列（靶分子）需進(jìn)行高效而特異的擴(kuò)增，以獲取樣品中的靶分子，如cDNA片段、PCR產(chǎn)物、mRNA、寡核苷酸等。靶分子的標(biāo)記主要采用熒光標(biāo)記法，也可用生物素、放射性同位素等標(biāo)記。樣品的標(biāo)記在其PCR、RT-PCR擴(kuò)增或逆轉(zhuǎn)錄過程中進(jìn)行。常用熒光色素Cy-3、Cy-5或生物素標(biāo)記dNTP。DNA聚合酶選擇熒光標(biāo)記的dNTP為底物，參與引物延伸，這樣新合成的DNA片段中就摻入了熒光分子。對于cDNA,一般是在反轉(zhuǎn)錄過程中摻入熒光基因。2.3芯片雜交與雜交信號檢測基因芯片與靶基因的雜交過程與一般的分子雜交過程基本相同，雜交反應(yīng)的條件要根據(jù)探針的長度、GC堿基含量及芯片的類型來優(yōu)化。因?yàn)榛蛐酒系碾s交屬于固相-液相反應(yīng)，許多因素會影響異源雙鏈的形成，如探針的濃度、長度、雜交的溫度、時間、離子強(qiáng)度等，因此，要根據(jù)探針的類型和長度以及芯片的應(yīng)用來選擇、優(yōu)化雜交反應(yīng)條件。待測樣品與基因芯片上探針陣列雜交后，漂洗以除去未雜交分子。攜帶熒光標(biāo)記的分子結(jié)合在芯片特定的位置上，在激光的激發(fā)下，含熒光標(biāo)記的DNA片段發(fā)射熒光。樣品與探針嚴(yán)格配對的雜交分子，所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)；不完全雜交的（含單個或2個錯配堿基）雙鏈分子熒光信號弱（不及前者的1/35?1/5）；不能雜交的則檢測不到熒光信號或只檢測到芯片上原有的熒光信號。熒光強(qiáng)度與樣品中的靶分子含量有一定的線性關(guān)系。芯片上不同位點(diǎn)的熒光信號被熒光共聚焦顯微鏡、激光掃描儀或落射顯微鏡等檢測到，由計(jì)算機(jī)記錄下來，然后通過特制的軟件對每個熒光信號的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析、處理，并與探針陣列的位點(diǎn)進(jìn)行比較，就可得到待測樣品的遺傳信息。3基因芯片的應(yīng)用3.1基因芯片在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用3.1.1基因表達(dá)分析同一組織細(xì)胞在不同的發(fā)育階段、不同外界環(huán)境因素影響下，其基因的表達(dá)模式不同。同一個體的不同組織器官的基因表達(dá)模式也不相同。如何研究眾多基因表達(dá)與否及其表達(dá)豐度是人們關(guān)注的一個焦點(diǎn)問題。用傳統(tǒng)的方法一次只能研究某個基因的表達(dá)情況，遠(yuǎn)不能滿足這一要求，而基因芯片技術(shù)由于具有高度并行性和高通量的特點(diǎn)正適合于此項(xiàng)研究。在早期的研究中，Schena等（1995）采用擬南芥基因組內(nèi)共45個基因的cDNA微陣列（其中14個為完全序列，31個為EST），檢測該植物的根、葉組織內(nèi)這些基因的表達(dá)水平，用不同顏色的熒光素標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后分別與該微陣列雜交，經(jīng)激光共聚焦顯微掃描，發(fā)現(xiàn)該植物根和葉組織中存在26個基因的表達(dá)差異，而參與葉綠素合成的CAB1基因在葉組織較根組織表達(dá)高500倍。Song等（2005）在小鼠體內(nèi)建立肝癌模型，用基因芯片證實(shí)了大量基因參與淋巴轉(zhuǎn)移過程。3.1.2基因突變和多態(tài)性分析在進(jìn)化過程中同一物種不同種群和個體之間存在著不同的基因型，這些不同的基因型與生物個體間不同的性狀有著密切的關(guān)系。利用基因芯片可以對基因型與性狀之間的關(guān)系進(jìn)行研究。Affymetrix公司推出的p53基因芯片可以檢測該基因的400多個突變型，而這些突變型又與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系，通過對該基因的檢測就可以預(yù)測個體腫瘤發(fā)生的概率。Claire等（2005）也在研究等位基因的過程中應(yīng)用了Affymetrix公司的基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)中的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，充分證明了基因芯片是種可以快速高效檢測基因多態(tài)性的良好工具。在植物抗逆機(jī)理的相關(guān)研究中，Mantfi等（2007）利用微陣列芯片分別對鷹嘴豆進(jìn)行抗逆基因篩選，通過寒凍敏感型及耐受型鷹嘴豆分別進(jìn)行寒凍脅迫試驗(yàn)，最后芯片分析結(jié)果成功篩選出15個寒凍脅迫相關(guān)基因，進(jìn)而推斷出這些基因可能在植物抗寒過程中起到關(guān)鍵作用。3.1.3基因組DNA序列分析由A、T、C、G4種核苷酸單體組合所形成的所有可能把具體寡核苷酸探針共有65536種。將這些種類的探針全部固定于活化的載體表面，形成寡核苷酸陣列。然后芯片與樣品進(jìn)行雜交，通過計(jì)算機(jī)對雜交模式進(jìn)行分析，就可以得出樣品的核苷酸序列信息。Riki等(2005)利用基因芯片技術(shù)測定了蕓苔植物基因中mRNA的序列，為揭示其轉(zhuǎn)錄規(guī)則作出了貢獻(xiàn)。3.1.4核酸和蛋白質(zhì)相互作用的研究蛋白質(zhì)與特定的核酸片段結(jié)合對基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，通過對蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究，人們可以更深入地了解生命活動的內(nèi)在機(jī)制。對這些DNA片段的研究一般是通過測定DNA發(fā)生突變后核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)合情況來推測的。這些測定包括硝化纖維素結(jié)合反應(yīng)和凝膠轉(zhuǎn)換分析，但應(yīng)用這些方法工作量大，操作繁瑣。將單鏈DNA陣列轉(zhuǎn)換成雙鏈DNA陣列，并對這些雙鏈DNA進(jìn)行修飾(如甲基化)的雙鏈DNA陣列可較好地應(yīng)用于大規(guī)模的核酸和蛋白質(zhì)相互作用的研究，并且在研究基因組中特異的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)方面發(fā)揮了重要作用。3.2基因芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用3.2.1疾病的診斷和治療目前臨床檢驗(yàn)需要很長時間，往往結(jié)果出來時已經(jīng)沒有參考價值，而且檢測結(jié)果的特異性差，醫(yī)生只能根據(jù)經(jīng)驗(yàn)用藥。如果在檢驗(yàn)中應(yīng)用基因芯片技術(shù)，就可以在短時間內(nèi)判定是哪一種微生物導(dǎo)致的感染，及時地指導(dǎo)醫(yī)生的治療。利用芯片技術(shù)還可以對易患某些疾病的高危人群進(jìn)行普查。此外它還可用于內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等疾病的早期診斷。目前，基因芯片技術(shù)對血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、地中海貧血、異常血紅蛋白病、苯酮尿癥等的檢測均已取得了較大的成功。現(xiàn)在DNA芯片可用于檢測遺傳性乳腺和卵巢癌基因BRCAI的點(diǎn)突變，插入及缺失等，以及篩查囊性纖維變性基因CFTR和，珠蛋白基因的突變。3.2.2藥物的研究和開發(fā)在傳統(tǒng)的藥物篩選方法中，需要從其對應(yīng)的生化途徑起，一步步的在其代謝途徑中尋找相關(guān)的蛋白或其他物質(zhì)，之后再去用藥物試驗(yàn)。不僅效率難以保證，由于人體內(nèi)的途徑相當(dāng)復(fù)雜，這種方法的局限性也非常大。基因芯片的應(yīng)用則很好的解決了這個問題，高通量的數(shù)據(jù)讓研究者可以從一個比較全面的角度對藥物及疾病的多種參數(shù)進(jìn)行研究，從而對疾病產(chǎn)生的機(jī)制和藥物相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行確定。Wilcox等（2007）將黃體酮作用于卵巢癌上皮細(xì)胞，以包含有22000種人腫瘤相關(guān)基因的基因芯片檢測細(xì)胞基因表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEM97和編碼14種膽固醇生物合成酶的基因上調(diào)，揭示了黃體酮治療卵巢癌的分子機(jī)制。3.3基因芯片在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用基因芯片在食品領(lǐng)域中也有著廣泛的應(yīng)用，包括在食源性治病微生物檢測方面的應(yīng)用、在轉(zhuǎn)基因食品檢測方面的應(yīng)用、在獸藥殘留檢測方面的應(yīng)用、在研究食品毒理學(xué)中的應(yīng)用、在抗生素耐藥檢測中的應(yīng)用，以及在研究食品營養(yǎng)機(jī)理中的應(yīng)用等等。3.4基因芯片在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用近年來，基因芯片技術(shù)也被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)，一方面可以快速檢測污染微生物或有機(jī)化合物對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，同時也能夠通過大規(guī)模的篩選尋找保護(hù)基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。3.5基因芯片在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)中的應(yīng)用對高產(chǎn)品種的選育和保持、用生物技術(shù)改良畜群的生產(chǎn)性能及應(yīng)用轉(zhuǎn)基因、克隆技術(shù)生產(chǎn)生物工程產(chǎn)品等，都可以用基因芯片技術(shù)取得大量重要信息。將之應(yīng)用于基因再測序，將大大加快DNA多態(tài)型的鑒定，這將有利于推動分子水平的育種工作。同時，通過平行監(jiān)測基因表達(dá)譜，有助于更好地了解動植物生長和發(fā)育的機(jī)理，以及基因間的相互作用。利用基因芯片技術(shù)，對有重要經(jīng)濟(jì)價值的農(nóng)作物、蔬菜和水果等的基因組進(jìn)行大規(guī)模、高通量的研究，篩選農(nóng)作物的基因突變，并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關(guān)基因，以開發(fā)高技術(shù)含量、高附加值的新產(chǎn)品，也可利用基因芯片技術(shù)篩選、開發(fā)高效低毒的生物農(nóng)藥。3.6基因芯片在體育科學(xué)研究中的應(yīng)用基因芯片在體育科學(xué)研究中的應(yīng)用主要體現(xiàn)于其在運(yùn)動心臟研究中的應(yīng)用、利用基因芯片技術(shù)可以進(jìn)行運(yùn)動員科學(xué)選材以及利用基因芯片進(jìn)行抗疲勞中藥復(fù)方成分的篩選研究?；蛐酒瑢⒂兄谔街壳耙阎倪\(yùn)動能力相關(guān)基因與運(yùn)動能力的具體關(guān)系，并且有可能發(fā)現(xiàn)新的與運(yùn)動能力相關(guān)的基因，為運(yùn)動員選材帶來不可估量的好處。并有可能對運(yùn)動處方領(lǐng)域帶來重大的影響和促進(jìn)。應(yīng)用生物芯片技術(shù)開展消除運(yùn)動性疲勞的復(fù)方中藥篩選方法研究，將對促進(jìn)中藥消除運(yùn)動性疲勞，提高機(jī)體運(yùn)動能力具有重大的意義。3.7在軍事和司法中的應(yīng)用在軍事、司法方面，基因芯片可用于開發(fā)生物戰(zhàn)病原體檢測系統(tǒng)，研制生物戰(zhàn)保護(hù)劑，進(jìn)行血型、親子鑒定及DNA指紋圖譜分析。國外的公司正在開發(fā)便攜式基因芯片檢測裝置，它可以直接在犯罪現(xiàn)場對嫌疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進(jìn)行分析，并立刻與DNA罪犯指紋庫系統(tǒng)存儲的DNA“指紋”進(jìn)行比較，以盡快、準(zhǔn)確地破案。4基因芯片技術(shù)存在的問題與展望4.1基因芯片技術(shù)存在的問題基因芯片技術(shù)充分利用了生物學(xué)、信息學(xué)等當(dāng)今前沿科技成果，發(fā)展至今，在諸多領(lǐng)域已呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，但是仍存在一定的問題，例如DNA芯片上原位合成探針難免有錯誤核酸摻入及混入雜質(zhì)，這將增高雜交背景，降低特異性;復(fù)雜的寡核苷酸存在的高級結(jié)構(gòu)和自身配對會影響其與靶DNA雜交或形成不穩(wěn)定的雜交二聚體；由于各實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和處理方法等因素的不同，眾多數(shù)據(jù)間常常缺乏可比性，不利于芯片數(shù)據(jù)的共享；芯片價格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本高等。但相信隨著芯片制作及雜交條件的不斷升級換代，這些問題最終將會得到很好的解決。4.2展望盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)在一些科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐中得到了一些應(yīng)用，但是在一些領(lǐng)域中基因芯片技術(shù)還尚處于初步的探索發(fā)展階段，在基因治療和基因疫苗的研制等方面基因芯片技術(shù)還沒有得到廣泛的應(yīng)用，但隨著生物信息學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，基因芯片技術(shù)一定會進(jìn)一步成熟，必將給人類提供越來越多的方便，發(fā)揮越來越大的重要作用，它將使科研人員從繁重的常規(guī)操作中解脫出來，可以預(yù)見在不久的將來它將成為實(shí)驗(yàn)室中不可缺少的技術(shù)平臺和各個領(lǐng)域研究中的重要工具。參考文獻(xiàn)于鳳池.基因芯片技術(shù)及其在植物研究中的應(yīng)用.中國農(nóng)業(yè)通報(bào)，2009,25(06)：64—65于婷婷，韓飛，周孟良.基因芯片在食品研究及檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009,14:318-321王洪水，侯相山.基因芯片技術(shù)研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(8):2241-2243,2245付建，黃勝斌，陳磊.基因芯片技術(shù)在細(xì)菌學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,48(7):1765-1768孫明.基因工程.北京：高等教育出版社，2006.118-132孫兵，閆彩霞，張廷婷.基因芯片技術(shù)在植物基因克隆中的應(yīng)用研究進(jìn)展.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(1):153—158江禾，王友群.基因芯片技術(shù)與藥物的研究和開發(fā).世界臨床藥物，2008,29(2):104-107劉旭偉，焦惠賢.基因芯片技術(shù)在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用研究.新疆醫(yī)學(xué)，2008,38:47-49李謹(jǐn).基因芯片技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用.中國獸醫(yī)雜志，2007，43(8)：87-89李松泰.基因芯片技術(shù)在體育科學(xué)研究中的應(yīng)用新進(jìn)展.西安體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2009,26(1):81-85朱玉賢李毅鄭曉峰.現(xiàn)代分子生物學(xué).第三版.北京：高等教育出版社，2007.214-218吳玲，聶根新，鄭新添.基因芯片技術(shù)在現(xiàn)代畜牧業(yè)中的應(yīng)用.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007,2:171-176張騫，盛軍.基因芯片技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2008,30(3)：34-37楊東英.基因芯片的技術(shù)原理及在動植物研究上的應(yīng)用.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,12(9):53-54楊義強(qiáng)，王春艷.基因芯片技術(shù)在藥學(xué)研究中的應(yīng)用.齊魯藥事，2009,28(5):293-295房愛華，尹彥濤.基因芯片技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望.中國畜牧獸醫(yī)，2009,3