甲型流感病毒H1N1病例標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南（暫行）學(xué)習(xí)培訓(xùn)課件

甲型流感病毒H1N1病例標(biāo)本采集和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南（暫行）流感病毒有甲、乙、丙三種至今甲型流感病毒已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個(gè)亞型（H1-H16），神經(jīng)氨酸酶9個(gè)亞型（N1-N9）

豬流感是一種因甲型流感病毒引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病

目前，已從豬身上分離到四種主要的亞型：H1N1、H1N2、H3N2和H3N1

甲型流感病毒H1N1亞型是目前疫情的主要病原體臨床標(biāo)本的采集采集對(duì)象：所有甲型流感（H1N1）疑似病例應(yīng)該采集上呼吸道標(biāo)本來檢測(cè)豬進(jìn)行H1N1病毒的相關(guān)檢測(cè)

采集種類：鼻咽拭子/吸取物或者鼻腔沖洗液/吸取物。如果不能收集這些標(biāo)本，可合并鼻拭子與口咽拭子。氣管插管的病人也應(yīng)收集氣管吸取物。標(biāo)本應(yīng)置于無菌病毒運(yùn)輸液（VTM），并立即用冰塊或冰排保存或置于4℃（冰箱），并馬上運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室

采樣器材要求拭子：應(yīng)使用頭部為合成纖維的拭子（例如，聚酯纖維），用鋁或塑料做桿。不推薦棉拭子和木桿。不能用海藻酸鈣做的拭子收集標(biāo)本。標(biāo)本采集管應(yīng)包含3毫升病毒運(yùn)輸液

采樣管：外螺旋口、耐－70℃凍存采樣液：含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，阻止細(xì)菌和真菌生長的抗生素，緩沖液（可使用Hank's或Eagle's等培養(yǎng)液加入抗菌素和0.5%BSA）標(biāo)本的儲(chǔ)存和運(yùn)送臨床標(biāo)本儲(chǔ)存所有呼吸道標(biāo)本應(yīng)保存在4℃，并盡快放置在-70℃。如果沒有-70℃度冰箱，標(biāo)本應(yīng)保存在4℃，但不應(yīng)超過4天

臨床標(biāo)本運(yùn)輸

應(yīng)按照A類包裝要求進(jìn)行樣品的包裝，所有標(biāo)本應(yīng)標(biāo)示清楚。疑似病例標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)包含的信息請(qǐng)參照禽流感標(biāo)本運(yùn)輸

標(biāo)本運(yùn)送方式省內(nèi)運(yùn)送：公路運(yùn)輸，專人（2人）、專車跨省運(yùn)送：公路或航空標(biāo)本運(yùn)送程序批準(zhǔn)開具接受回執(zhí)向原批準(zhǔn)部門書面報(bào)告法人資質(zhì)證明運(yùn)輸申請(qǐng)表包裝材料報(bào)告及承諾書法人資質(zhì)證明有資格實(shí)驗(yàn)室相關(guān)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)批準(zhǔn)文件同意接受證明接受單位申請(qǐng)單位獲得準(zhǔn)運(yùn)證書分類包裝、標(biāo)識(shí)聯(lián)系接受單位接受人2人專車運(yùn)送省級(jí)以上衛(wèi)生主管部門實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法：

1、首選Real-timeRT-PCR方法檢測(cè)

2、快速流感抗原檢測(cè)

3、免疫熒光法

4、病毒分離目前檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)l

A型流感病毒的快速抗原檢測(cè)可以用于檢測(cè)該豬流感病毒，但由于和其它檢測(cè)方法相比靈敏度較低，因此可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。l

由于免疫熒光和其他免疫檢測(cè)方法中使用的抗體可能不會(huì)和該病毒的靶位點(diǎn)結(jié)合，因此會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。目前檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)l

雖然在PCR方法中檢測(cè)流感基因的高度保守片段和確診A型流感的引物也許還可以使用，但目前PCR診斷試驗(yàn)中用于A型流感病毒分型的引物可能不能檢測(cè)非人類病毒。l

確診豬流感病毒A/H1N1的唯一可靠的方法是進(jìn)行病毒分離（病毒分離應(yīng)在BSL-3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行），并且至少進(jìn)行部分基因測(cè)序。但陰性結(jié)果不能排除豬源流感病毒（A/H1N1）感染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)程序1、流感快診檢測(cè)

區(qū)別甲、乙型流感病毒，乙型陽性排除，全部陰性結(jié)果不能排除2、RT-PCR檢測(cè)

針對(duì)豬源甲型流感病毒的特異性引物，人源甲型流感病毒引物不能有效地診斷豬源病毒感染3、病毒分離

使用MDCK細(xì)胞、雞胚可有效分離豬源病毒，對(duì)目前不能鑒定的甲型流感病毒株必須上送鑒定，在進(jìn)行基因測(cè)序后可確定豬源病毒感染甲型流感病毒（H1N1）PCR引物SWInfA:目標(biāo)片段大小164bp5`-GCACGGTCAGCACTTATYCTRAG-3`5`-GTGRGCTGGGTTTTCATTTGGTC-3`SWH1:目標(biāo)片段大小115bp5`-GTGCTATAAACACCAGCCTYCCA-3`5`-CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC-3`檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)要求

生物安全防護(hù)原則標(biāo)本的檢測(cè)、儲(chǔ)存、包裝和運(yùn)送應(yīng)按照《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》（國務(wù)院424號(hào)令）和《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運(yùn)輸管理規(guī)定》（中華人民共和國衛(wèi)生部第45號(hào)令）等有關(guān)規(guī)定執(zhí)行

檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)要求采集疑似感染A（H1N1）型豬流感病毒的患者臨床標(biāo)本、進(jìn)行標(biāo)本處理、包裝、診斷性檢測(cè)及進(jìn)行病毒分離的工作人員必須進(jìn)行嚴(yán)格的安全防護(hù)

所有的涉及病例標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)操作（包括樣本的處理、包裝及包裝拆除）必須在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)要求臨床標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)（病毒分離除外）必須在BSL-2實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行病毒分離、鑒定必須在BSL-3或更高一級(jí)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)要求推薦的個(gè)人防護(hù)裝備（基于特定場(chǎng)所的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估）·呼吸防護(hù)裝備—檢測(cè)合格的N95呼吸器或更高級(jí)別的防護(hù)裝備?！ば住で胺馐绞中g(shù)服·雙層手套·眼部防護(hù)裝備（護(hù)目鏡或面罩）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)要求實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理原則應(yīng)遵循所在機(jī)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程內(nèi)的所有廢棄物處置程序進(jìn)行。

121℃、30分鐘高壓滅菌處理（注意：外排式高壓滅菌器存在生物安全隱患）化學(xué)消毒劑浸泡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)要求有效的實(shí)驗(yàn)室使用的化學(xué)消毒劑·70%酒精·5%來蘇爾10%漂白液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)要求所有人員在工作期間均應(yīng)進(jìn)行自我癥狀