生物制藥-人源化單克隆抗體課件

HAMA效應HAMA效應1抗體人源化分為（1）嵌合抗體：用人源抗體恒定區(qū)替換鼠源抗體恒定區(qū)，保留抗體可變區(qū)。（2）人源化抗體:可變區(qū)中僅CDR（互補決定區(qū)）為鼠源，其FR(框架區(qū))及恒定區(qū)均來自人源?？贵w人源化分為2治療性單抗人源化發(fā)展歷程治療性單抗人源化發(fā)展歷程3人源化單克隆抗體的

研究進展和應用組員：洪武平王松振王雁慶曾亞威09生物技術(shù)人源化單克隆抗體的

研究進展和應用組員：洪武平4

單克隆抗體在理論和實踐上的應用成為解決生物學和醫(yī)學等許多重大問題的重要手段。但是，上述應用的單抗屬于鼠源性，鼠源性單抗應用于人類的臨床應用結(jié)果反映出了單克隆抗體藥物存在的一些問題:(1)鼠源性單抗容易容易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA),在體內(nèi)作為異源蛋白被清除掉，從而削弱其治療的有效性。(2)鼠源性單抗在人體內(nèi)生物活性降低，不能有效地激活人體的生物效應。研究背景因此，人們一直致力于人源性抗體的研究。單克隆抗體在理論和實踐上的應用成為解決生物學和醫(yī)5人源化治療性單克隆抗體的研究進展構(gòu)建的基本思路鼠抗體人源化就是通過基因改造，使其和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別，避免誘導HAMA（人抗鼠抗體）反應。遵守兩個原則首先，要保持抗體的親和力和特異性；其次，要降低或消除抗體的免疫原性。人源化治療性單克隆抗體的研究進展構(gòu)建的基本思路鼠抗體6生物制藥--人源化單克隆抗體課件7生物制藥--人源化單克隆抗體課件8人源化程度人源化程度91.嵌合抗體（Chimericantibody)用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū)，即該單抗由鼠的可變區(qū)和人的恒定區(qū)組成的嵌合抗體。由于嵌合抗體可變區(qū)（V）約占整個抗體的30%，鼠源性抗體V區(qū)中的框架區(qū)（FR)仍殘留一定的免疫原性，可誘導HAMA反應。靈長目源抗體也是一類嵌合抗體，通過免疫短尾猿猴產(chǎn)生。由于其抗體的可變區(qū)與人可變區(qū)無差異，不至于發(fā)生抗體反應。缺點解決方案鼠源抗體嵌合抗體1.嵌合抗體（Chimericantibody)用人源基因102022/12/202022/12/18112.CDR移植抗體（CDRgraftedantibody)真正意義上的抗體人源化。抗體中除了3個互補決定區(qū)（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，人源化程度可達到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。不足有時異基因的CDR人源化抗體可能引起抗個體基因型反應。改良方案——進行SDR移植改良嵌合抗體人源化抗體3個CDR2.CDR移植抗體（CDRgraftedantibody123.SDR移植抗體(SDRgraftedantibody)在CDR移植抗體的基礎(chǔ)上，將異源抗體中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體相應位置上，進一步降低了抗體的異源性。通過這種方法，使人源化的抗體潛在的免疫原性降至最低。3.SDR移植抗體(SDRgraftedantibody134.全人單克隆抗體（Fullyhumaneantibody)它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。

在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性。

4.1.抗體庫篩選技術(shù)4.1.1.噬菌體表面展示技術(shù)鼠源抗體完全人源化抗體4.全人單克隆抗體（Fullyhumaneantibody14基本原理和程序

噬菌體抗體庫人免疫細胞基因組PCR技術(shù)擴增整套的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因噬菌體DNA中有抗體基因外殼表面有抗體分子的表達克隆并以融合蛋白的形式表達基因重組噬菌體重組DNA構(gòu)建利用抗原-抗體特異性篩選所需抗體并進行克隆擴增獲得可溶性抗體片段表達基本原理和程序

噬菌體抗體庫人免疫細胞基因組PCR技術(shù)擴增整152022/12/20局限性1.在噬菌體展示過程中涉及細菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝、展示跨膜分泌，這就大大限制了所建庫的容量和分子的多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫容量在109。2.不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運、膜插入和絡合，導致在體內(nèi)篩選時需要外加選擇壓力。3.噬菌體展示文庫無法進行有效的體外突變和重組進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。4.因為噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細胞內(nèi)基因的表達，所以一些對細胞有毒性的分子（如生物毒素分子)很難得到有效表達和展示。

2022/12/18局限性1.在噬菌體展示過程中涉及164.1.2.核糖體展示技術(shù)基本原理和程序

人免疫細胞基因組EDTA體外轉(zhuǎn)錄、翻譯、偶聯(lián)mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體核糖體展示的蛋白文庫構(gòu)建基因型和表型聯(lián)系利用抗原-抗體特異性篩選所需抗體復合體EDTA解離獲得特異mRNART-PCRRT-PCR特異抗體DNA子文庫獲得特異性的、高親和力的抗體表達4.1.2.核糖體展示技術(shù)基本原理和程序

人免疫細胞基因組E172022/12/20

傳統(tǒng)的篩選技術(shù)具有本身難以克服的缺陷，主要表現(xiàn)在構(gòu)建文庫和篩選時都涉及細胞轉(zhuǎn)染、噬菌體包裝、跨膜分泌和蛋白質(zhì)降解等諸多方面的問題，文庫容量及其分子多樣性在某種程度上受到很大的限制，降低了文庫篩選效率。核糖體展示技術(shù)由于在體外無細胞翻譯體系中進行，用mRNA的可復制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受細胞轉(zhuǎn)化效率的限制。它大大的提高了文庫容量和篩選通量（1012-1014）而且能夠增加表達的蛋白質(zhì)的溶解度。優(yōu)勢2022/12/18傳統(tǒng)的篩選技術(shù)具有本身難以184.2.轉(zhuǎn)基因小鼠通過基因敲除技術(shù)，使小鼠自身的基因失活，并導入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體重輕基因簇的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種人抗體基因小鼠所攜帶的人DNA片段具有完善的功能，可以有效地進行同型轉(zhuǎn)換和親和力成熟。任何靶抗原均可被用來免疫該小鼠，使其產(chǎn)生高親和力的人抗體。案例：日本麒麟公司用基因工程技術(shù)，使小鼠攜帶完整的人14號染色體，該染色體包含全部人抗體產(chǎn)生基因。但迄今尚無該技術(shù)生產(chǎn)的制品問世。4.2.轉(zhuǎn)基因小鼠通過基因敲除技術(shù)，使小鼠自身的基因失194.3.微胞雜交干細胞技術(shù)——日本學者Ishida等首先提出技術(shù)要點：

首先將抗G418的人成纖維細胞與小鼠的A9細胞融合，通過篩選，得到抗G418的小鼠A9細胞，再運用PCR或原位熒光雜交方法篩選，先篩選出的細胞用秋水仙素處理48h，然后用細胞松弛素B處理并高速離心，分離出含2號、14號、22號染色體的小鼠。人源抗體在這種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)量還比較低。4.3.微胞雜交干細胞技術(shù)——日本學者Ishida等首先提出204.4.其他方法XTL生物制藥公司使用一種類似于人骨髓移植的方法，用放射線破壞動物骨髓，然后注入人抗體生成細胞。該公司已用此法生產(chǎn)出一種全人單抗。4.4.其他方法XTL生物制藥公司使用一種類似于人骨212022/12/20近年來,人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為臨床應用帶來了新的希望,當前正處于臨床研究的多種抗體中,嵌合抗體和人源化抗體所占比例大于70%。目前的人源化抗體,主要用于腫瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病的治療以及抗移植排斥反應和抗病毒感染等方面。人源化抗體的臨床應用2022/12/18近年來,人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為臨床222022/12/201.在腫瘤治療方面的應用:單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應。如2005年我國開發(fā)出癌癥治療藥——重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體(商品名：泰欣生)。泰欣生聯(lián)合放療治療鼻咽癌的完全緩解率比單純放療的患者提高30%以上。2.在器官移植中的應用:近年來,利用抗體藥物作為實體器官移植的誘導治療逐漸增加。如1986年批準進入美國市場的治療性抗體類藥物抗CD3單抗即被用于腎、心臟、肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn)。3.在心血管疾病方面的應用：美國FDA于1994年批準了第一個人-鼠嵌合Fab抗體的上市，該抗體現(xiàn)已被廣泛應用于多種心血管疾病治療,主要用于預防冠狀動脈成形術(shù)后的再狹窄。2022/12/181.在腫瘤治療方面的應用:232022/12/204.在自身免疫性疾病方面的應用:現(xiàn)有的研究表明,抗體對類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、硬皮病、潰瘍性結(jié)腸炎等療效較好。5.在抗病毒感染方面的應用：近年來研究表明,在HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病中,人源化抗體顯示了較好的應用前景。如：商品名為SynagisTM的抗呼吸道病毒感染的抗體在美國已經(jīng)上市,為人源化的基因工程抗體。2022/12/184.在自身免疫性疾病方面的應用:24生物制藥--人源化單克隆抗體課件25應用單克隆抗體后的患者癥狀改善率應用單克隆抗體后的患者癥狀改善率26總結(jié)到目前為止，至少有35個完全人類的單抗已經(jīng)進入臨床的治療實驗階段。這些單抗的靶抗原都是臨床癌癥、自身免疫疾病或炎癥疾病和傳染病中的主要抗原。例如EGFR、CTLA-4和CD4等。在治療一些異種移植、骨質(zhì)疏松癥等疾病已有顯著的效果。

抗體人源化以及完全人源化抗體的制備已經(jīng)成為當今治療性抗體的發(fā)展趨勢，同時，各種抗體衍生物免疫原性低、更易通過血管壁到達病源，通過PEG化等方法可以延長其半衰期；人抗體是否可以解決鼠抗體運用中出現(xiàn)的所有問題，還有待大量臨床試驗的檢驗。所以可行的方法就是在完善人抗體技術(shù)的同時，推進治療性小分子抗體衍生物的研究，根據(jù)臨床的實際設計靈活有效的治療方案，使人源化抗體和小分子抗體互為補充?？偨Y(jié)到目前為止，至少有35個完全人類的單抗已經(jīng)進入臨27Thanks!Thanks!28HAMA效應HAMA效應29抗體人源化分為（1）嵌合抗體：用人源抗體恒定區(qū)替換鼠源抗體恒定區(qū)，保留抗體可變區(qū)。（2）人源化抗體:可變區(qū)中僅CDR（互補決定區(qū)）為鼠源，其FR(框架區(qū))及恒定區(qū)均來自人源?？贵w人源化分為30治療性單抗人源化發(fā)展歷程治療性單抗人源化發(fā)展歷程31人源化單克隆抗體的

研究進展和應用組員：洪武平王松振王雁慶曾亞威09生物技術(shù)人源化單克隆抗體的

研究進展和應用組員：洪武平32

單克隆抗體在理論和實踐上的應用成為解決生物學和醫(yī)學等許多重大問題的重要手段。但是，上述應用的單抗屬于鼠源性，鼠源性單抗應用于人類的臨床應用結(jié)果反映出了單克隆抗體藥物存在的一些問題:(1)鼠源性單抗容易容易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA),在體內(nèi)作為異源蛋白被清除掉，從而削弱其治療的有效性。(2)鼠源性單抗在人體內(nèi)生物活性降低，不能有效地激活人體的生物效應。研究背景因此，人們一直致力于人源性抗體的研究。單克隆抗體在理論和實踐上的應用成為解決生物學和醫(yī)33人源化治療性單克隆抗體的研究進展構(gòu)建的基本思路鼠抗體人源化就是通過基因改造，使其和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別，避免誘導HAMA（人抗鼠抗體）反應。遵守兩個原則首先，要保持抗體的親和力和特異性；其次，要降低或消除抗體的免疫原性。人源化治療性單克隆抗體的研究進展構(gòu)建的基本思路鼠抗體34生物制藥--人源化單克隆抗體課件35生物制藥--人源化單克隆抗體課件36人源化程度人源化程度371.嵌合抗體（Chimericantibody)用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū)，即該單抗由鼠的可變區(qū)和人的恒定區(qū)組成的嵌合抗體。由于嵌合抗體可變區(qū)（V）約占整個抗體的30%，鼠源性抗體V區(qū)中的框架區(qū)（FR)仍殘留一定的免疫原性，可誘導HAMA反應。靈長目源抗體也是一類嵌合抗體，通過免疫短尾猿猴產(chǎn)生。由于其抗體的可變區(qū)與人可變區(qū)無差異，不至于發(fā)生抗體反應。缺點解決方案鼠源抗體嵌合抗體1.嵌合抗體（Chimericantibody)用人源基因382022/12/202022/12/18392.CDR移植抗體（CDRgraftedantibody)真正意義上的抗體人源化?？贵w中除了3個互補決定區(qū)（CDR）是鼠源的外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，人源化程度可達到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。不足有時異基因的CDR人源化抗體可能引起抗個體基因型反應。改良方案——進行SDR移植改良嵌合抗體人源化抗體3個CDR2.CDR移植抗體（CDRgraftedantibody403.SDR移植抗體(SDRgraftedantibody)在CDR移植抗體的基礎(chǔ)上，將異源抗體中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體相應位置上，進一步降低了抗體的異源性。通過這種方法，使人源化的抗體潛在的免疫原性降至最低。3.SDR移植抗體(SDRgraftedantibody414.全人單克隆抗體（Fullyhumaneantibody)它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。

在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性。

4.1.抗體庫篩選技術(shù)4.1.1.噬菌體表面展示技術(shù)鼠源抗體完全人源化抗體4.全人單克隆抗體（Fullyhumaneantibody42基本原理和程序

噬菌體抗體庫人免疫細胞基因組PCR技術(shù)擴增整套的抗體重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因噬菌體DNA中有抗體基因外殼表面有抗體分子的表達克隆并以融合蛋白的形式表達基因重組噬菌體重組DNA構(gòu)建利用抗原-抗體特異性篩選所需抗體并進行克隆擴增獲得可溶性抗體片段表達基本原理和程序

噬菌體抗體庫人免疫細胞基因組PCR技術(shù)擴增整432022/12/20局限性1.在噬菌體展示過程中涉及細菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝、展示跨膜分泌，這就大大限制了所建庫的容量和分子的多樣性。目前，常用的噬菌體展示文庫容量在109。2.不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達，因為有些蛋白質(zhì)功能的實現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運、膜插入和絡合，導致在體內(nèi)篩選時需要外加選擇壓力。3.噬菌體展示文庫無法進行有效的體外突變和重組進而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。4.因為噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細胞內(nèi)基因的表達，所以一些對細胞有毒性的分子（如生物毒素分子)很難得到有效表達和展示。

2022/12/18局限性1.在噬菌體展示過程中涉及444.1.2.核糖體展示技術(shù)基本原理和程序

人免疫細胞基因組EDTA體外轉(zhuǎn)錄、翻譯、偶聯(lián)mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體核糖體展示的蛋白文庫構(gòu)建基因型和表型聯(lián)系利用抗原-抗體特異性篩選所需抗體復合體EDTA解離獲得特異mRNART-PCRRT-PCR特異抗體DNA子文庫獲得特異性的、高親和力的抗體表達4.1.2.核糖體展示技術(shù)基本原理和程序

人免疫細胞基因組E452022/12/20

傳統(tǒng)的篩選技術(shù)具有本身難以克服的缺陷，主要表現(xiàn)在構(gòu)建文庫和篩選時都涉及細胞轉(zhuǎn)染、噬菌體包裝、跨膜分泌和蛋白質(zhì)降解等諸多方面的問題，文庫容量及其分子多樣性在某種程度上受到很大的限制，降低了文庫篩選效率。核糖體展示技術(shù)由于在體外無細胞翻譯體系中進行，用mRNA的可復制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受細胞轉(zhuǎn)化效率的限制。它大大的提高了文庫容量和篩選通量（1012-1014）而且能夠增加表達的蛋白質(zhì)的溶解度。優(yōu)勢2022/12/18傳統(tǒng)的篩選技術(shù)具有本身難以464.2.轉(zhuǎn)基因小鼠通過基因敲除技術(shù)，使小鼠自身的基因失活，并導入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體重輕基因簇的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種人抗體基因小鼠所攜帶的人DNA片段具有完善的功能，可以有效地進行同型轉(zhuǎn)換和親和力成熟。任何靶抗原均可被用來免疫該小鼠，使其產(chǎn)生高親和力的人抗體。案例：日本麒麟公司用基因工程技術(shù)，使小鼠攜帶完整的人14號染色體，該染色體包含全部人抗體產(chǎn)生基因。但迄今尚無該技術(shù)生產(chǎn)的制品問世。4.2.轉(zhuǎn)基因小鼠通過基因敲除技術(shù)，使小鼠自身的基因失474.3.微胞雜交干細胞技術(shù)——日本學者Ishida等首先提出技術(shù)要點：

首先將抗G418的人成纖維細胞與小鼠的A9細胞融合，通過篩選，得到抗G418的小鼠A9細胞，再運用PCR或原位熒光雜交方法篩選，先篩選出的細胞用秋水仙素處理48h，然后用細胞松弛素B處理并高速離心，分離出含2號、14號、22號染色體的小鼠。人源抗體在這種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)量還比較低。4.3.微胞雜交干細胞技術(shù)——日本學者Ishida等首先提出484.4.其他方法XTL生物制藥公司使用一種類似于人骨髓移植的方法，用放射線破壞動物骨髓，然后注入人抗體生成細胞。該公司已用此法生產(chǎn)出一種全人單抗。4.4.其他方法XTL生物制藥公司使用一種類似于人骨492022/12/20近年來,人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為臨床應用帶來了新的希望,當前正處于臨床研究的多種抗體中,嵌合抗體和人源化抗體所占比例大于70%。目前的人源化抗體,主要用于腫瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病的治療以及抗移植排斥反應和抗病毒感染等方面。人源化抗體的臨床應用2022/12/18近年來,人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為臨床502022/12/201.在腫瘤治療方面的應用:單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應。如2005年我國開發(fā)出癌癥治療藥——重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體(商品名：泰欣生)。泰欣生聯(lián)合放療治療鼻咽癌的完全緩解率比單純放療的患者提高30%以上。2.在器官移植中的應用:近年來,利用抗體藥物作為實體器官移植的誘