生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)課件

第三章

生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)光譜分析技電化學(xué)分析技術(shù)干化學(xué)分析技術(shù)電泳分析技術(shù)基因擴(kuò)增技術(shù)1第三章1第一節(jié)光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)發(fā)射光譜分析技術(shù)散射光譜分析技術(shù)2第一節(jié)光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)2一、吸收光譜分析法3一、吸收光譜分析法30.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示器鎢燈、鹵鎢燈350～1000氫燈、氘燈180～360濾光片棱鏡光柵玻璃比色皿石英比色皿40.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示器鎢燈、鹵鎢燈350～(一)、分光光度技術(shù)的基本原理1、吸光度與透光度

A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I

當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時(shí)可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為I，I和I0之比稱為透光度，即：T=I/I0T×100%為T%稱為百分透光度。透光度的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度即：入射光I0透射光I5(一)、分光光度技術(shù)的基本原理1、吸光度與透光度2、Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。A=KLCA為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時(shí)，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比。L62、Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律77Lambert-Beer定律適用于:可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體以及分散均勻的固態(tài)或氣態(tài)樣品.單色光均勻介質(zhì)吸收物質(zhì)無相互作用3、Lambert-Beer定律的應(yīng)用條件4、Lambert-Beer定律的偏離現(xiàn)象8Lambert-Beer定律適用于:單色光3、Lambert在分光光度法中，為消除顯色劑及樣品中各種共存有色物質(zhì)產(chǎn)生的干擾、抵消比色皿和試劑對(duì)入射光的影響而用來調(diào)節(jié)儀器百分透光率為100%的溶液。5、空白溶液的選擇

蒸餾水

試劑樣品不含待測(cè)元素不顯色1、溶劑空白：不加樣品和任何試劑，用純?nèi)軇ㄈ缯麴s水或其他有機(jī)溶劑）作參比溶液。選擇原則：當(dāng)顯色劑及其它試劑均無色，被測(cè)試樣中又無其他有色離子時(shí)，選用溶劑參比。2、試劑空白：用不加樣品，而顯色劑和其他試劑都相同的溶液作參比溶液。

選擇原則：當(dāng)顯色劑本身有顏色或其它試劑有顏色，被測(cè)試樣中又無其他有色離子時(shí)，選用試劑參比。3、樣品空白：用不加顯色劑的樣品溶液作參比溶液。

選擇原則：當(dāng)試樣溶液有顏色，而試劑、顯色劑均無顏色時(shí)，選用樣品空白。4、平行操作空白：按樣品分析完全相同的操作步驟，用不含待測(cè)元素的樣品進(jìn)行平行操作，以消除操作過程中引入干擾雜質(zhì)所帶來的誤差。

選擇原則：當(dāng)操作過程中由于試劑、器皿、水和氣等因素引入了一定量的被測(cè)試樣組分的干擾離子5、不顯色空白：可將一份試樣加入適當(dāng)?shù)难诒蝿?，將被測(cè)組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑和其它試劑均按照操作手續(xù)加入，以此作為參比溶液，這樣可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。選擇原則：當(dāng)顯色劑和被測(cè)試樣均有顏色時(shí)，可選用此法。9在分光光度法中，為消除顯色劑及樣品中各種共存(二)、分光光度法在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用廣泛1、對(duì)未知化合物進(jìn)行定性分析2、對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定定性依據(jù)：最大吸收波長(zhǎng)λmax和摩爾吸光系數(shù)ε標(biāo)準(zhǔn)曲線法和比較法10(二)、分光光度法在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線法

根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過原點(diǎn)的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)溶液測(cè)定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。方法：11(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線法根據(jù)Lambert-Beer定律5.標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。125.標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。122．比較法CR=(AR×Cs)/As己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：132．比較法CR=(AR×Cs)/As己知濃度的標(biāo)二、發(fā)射光譜分析法處于激發(fā)態(tài)的待測(cè)元素，原子回到基態(tài)時(shí)以輻射的形式釋放出能量，由此而產(chǎn)生的光譜稱為發(fā)射光譜，對(duì)元素進(jìn)行定性與定量分析的方法。發(fā)射光譜是指樣品本身產(chǎn)生的光譜被檢測(cè)器接收；吸收光譜是光源發(fā)射的光譜被樣品吸收了一部分，剩下的那部分光譜被檢測(cè)器接收?；鹧婀舛确晒夤舛确?4二、發(fā)射光譜分析法處于激發(fā)態(tài)的待測(cè)元素，原子火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量被測(cè)元素所發(fā)射的輻射強(qiáng)度來進(jìn)行定量分析的方法。它是一種簡(jiǎn)化的發(fā)射光譜分析法（一）、火焰光度法FP640火焰光度計(jì)火焰光度法分析示意圖15火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量被測(cè)元素所發(fā)火焰光度法的特點(diǎn)⑤應(yīng)用范圍窄③靈敏①快速②準(zhǔn)確④設(shè)備簡(jiǎn)單試樣溶液于數(shù)分鐘內(nèi)可完成測(cè)定火焰光源穩(wěn)定性高，干擾少，誤差為2％~5％，可用于微量分析和常量分析分析堿金屬與堿土金屬，絕對(duì)靈敏度可達(dá)0．1～10×10－6g被測(cè)試樣易被火焰激發(fā)，產(chǎn)生的譜線較簡(jiǎn)單，且均在可見光區(qū)，故使譜線分離和測(cè)量的設(shè)備簡(jiǎn)單主要用于堿金屬和部分堿土金屬的測(cè)定16火焰光度法的特點(diǎn)⑤應(yīng)用范圍窄③靈敏①快速②準(zhǔn)確④設(shè)備簡(jiǎn)單試樣1、激發(fā)條件影響火焰光度分析的因素2、試樣的種類和組成3、試液中共存離子對(duì)測(cè)定有影響4、儀器的質(zhì)量火焰溫度要適當(dāng)，溫度過低靈敏度下降，溫度太高則堿金屬電離嚴(yán)重，影響測(cè)量的線性關(guān)系。171、激發(fā)條件影響火焰光度分析的因素2、試樣的種類和組成3、試（二）、熒光分光光度法化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。利用物質(zhì)吸收較短波長(zhǎng)的光能后發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)特征光譜的性質(zhì)，對(duì)物質(zhì)定性或定量分析的方法。熒光的定義：某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。熒光產(chǎn)生的原理：熒光分光光度法分析測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、維生素等;對(duì)某些激素及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定;當(dāng)化合物含量太少,一般分析方法靈敏度不夠時(shí),使用熒光分析技術(shù)就能解決測(cè)定問題。18（二）、熒光分光光度法化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能三、散射光譜分析法透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見的兩種方法，其反應(yīng)的原理一樣，只是檢測(cè)的光信號(hào)與儀器的檢測(cè)器有區(qū)別。1、透射比濁操作簡(jiǎn)便，適用于普通的自動(dòng)生化分析儀和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測(cè)的周期較長(zhǎng)。2、散射比濁的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測(cè)快速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，試劑價(jià)格高。光的散射用單色光照射透明溶液時(shí)，大部分按原來方向透射，而一小部分則按不同的角度散射開來。散射光譜分析法利用懸浮顆粒混濁液的散射光強(qiáng)度或?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進(jìn)行定量分析的方法。19三、散射光譜分析法透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見的兩種方第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)20第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)20一、電位分析法―ISE利用電極電位與濃度的關(guān)系測(cè)定物質(zhì)含量的電化學(xué)分析方法。電位分析法一類用特殊敏感膜制成，對(duì)溶液中某種特定離子有選擇性響應(yīng)的電化學(xué)傳感器離子選擇電極ISE電解質(zhì)溶液中參與電化學(xué)反應(yīng)的離子的有效濃度21一、電位分析法―ISE利用電極電位與濃度的關(guān)系測(cè)定物質(zhì)含量2222

離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基本結(jié)構(gòu)都包括：對(duì)特定離子有選擇性響應(yīng)的薄膜(敏感膜或傳感膜)、內(nèi)參比溶液與內(nèi)參比電極。敏感膜將內(nèi)側(cè)參比溶液與外側(cè)的待測(cè)離子溶液分開，是電極的關(guān)鍵部位。ISE基本結(jié)構(gòu)內(nèi)參比電極電極殼體內(nèi)參比溶液敏感膜離子選擇性電極結(jié)構(gòu)示意圖23離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基電極電位24電極電位24電極電位測(cè)量在電位分析中，構(gòu)成電池的兩個(gè)電極，其中一個(gè)，其電位值隨待測(cè)離子濃(活)度的變化而變化，能指示待測(cè)離子的濃(活)度，稱為指示電極，或離子選擇性電極。指示電極而另一個(gè)電極，其電位不受試液組成變化的影響，具有較恒定的數(shù)值，只是作為測(cè)量電位的標(biāo)準(zhǔn)，稱為參比電極(參考電極)。

參比電極離子選擇性電極：電位法測(cè)定溶液中某種定離子活度的指示電極；能在多種離子存在的混合液中，選擇性地響應(yīng)該特定離子，指示出這種離子活度變化情況，測(cè)定離子的活度或濃度。25電極電位測(cè)量在電位分析中，構(gòu)成電池的兩個(gè)電極，其中一個(gè)，其電①選擇性好

在多數(shù)情況下，共存的離子干擾小，對(duì)組成復(fù)雜的試樣往往不需要分離處理就可直接測(cè)定。

②靈敏度高

電位法的檢出限為10-5～10-8mol/L，適于微量組分的測(cè)定，電位滴定法適于常量分析。

③快速

儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分析快速、測(cè)定范圍寬、不破壞試液，易于實(shí)現(xiàn)分析自動(dòng)化。

④缺點(diǎn)需要有專用的離子選擇性電極。電位分析法的特點(diǎn)：26①選擇性好在多數(shù)情況下，共存的離3、離子選擇性電極的分類和主要類型根據(jù)國(guó)際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：

根據(jù)國(guó)際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：

常用的離子選擇電極273、離子選擇性電極的分類和主要類型根據(jù)國(guó)際純粹及玻璃膜電極28玻璃膜電極28氣敏電極如，二氧化碳?xì)饷綦姌O：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由醋酸纖維、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。測(cè)定時(shí)，CO2氣體通過微孔滲透膜與中介溶液接觸(中介液是0.001mol/L的NaHCO3)；由于CO2與H2O結(jié)合生成碳酸，從而影響到碳酸氫鈉的電離平衡。氣敏電極通過界面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行工作的，離子電極用來指示中介液中某一離子活度的變化。溶解在水溶液中的氣體，只要能生成可用離子選擇性電極檢出的離子，均可用氣敏電極測(cè)定。用pH玻璃電極間接測(cè)定CO2的含量

氣敏電極是一種氣體傳感器，測(cè)定溶液中的氣體含量。原理：利用待測(cè)氣體對(duì)某一化學(xué)平衡的影響，使平衡中某特定離子的活度發(fā)生變化，來測(cè)定試液中被測(cè)氣體的分壓(含量)。

在氣敏電極的中介溶液中放入玻璃電極。測(cè)量時(shí)，控制試液的酸堿度，使CO2通過氣透膜擴(kuò)散加入氣敏電極；引起中介溶液pH的改變。測(cè)定中介溶液的pH值，即可計(jì)算出試液中CO2的濃度。29氣敏電極如，二氧化碳?xì)饷綦姌O：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由3030

CO2+H2O===HCO3-+H+NH3+H2O===NH4++OH-SO2+H2O===HSO3-+H+2NO2+H2O===NO3-+NO2-+H+H2S+H2O===HS-+H3O+HCN+H2O===H3O++CN-HF+H2O===H3O++F-

凡是溶于水釋放H+的反應(yīng)，都可以用pH玻璃電極檢出；而后三種分別可以用S2-、CN-、F-等離子選擇性電極來檢測(cè)?？捎秒姌O測(cè)定的氣體31CO2+H2O===HCO3-+H酶的催化反應(yīng)專一強(qiáng)；酶電極有極高的選擇性。作為一種生物傳感器，酶電極特別適用于生物醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域。酶電極①選擇適合的指示電極②制成具有催化活性的水不溶性酶膜③把酶膜固定在電極的表面(酶的固定化)

酶電極的制作過程將生物酶涂布在離子選擇性電極或其它傳感器的敏感膜上，通過酶催化作用，使待測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生能在該電極上響應(yīng)的離子或化合物，間接測(cè)定該物質(zhì)。脲酶催化分解尿素產(chǎn)生NH3、CO2，溶于水可得到不同產(chǎn)物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用相應(yīng)的離子選擇性電極來檢測(cè)它們，間接得到尿素的含量。常用的固定化技術(shù)有：吸附、試劑交聯(lián)、共價(jià)鍵合、包埋法(酶與載體聚丙酰胺混合后直接包在電極敏感部分形成酶凝膠層)。32酶的催化反應(yīng)專一強(qiáng)；酶電極有極高的選擇性。作為一種生物傳感幾種酶電極的品種與性能測(cè)定物質(zhì)酶檢測(cè)物測(cè)定范圍(mol/L)葡萄糖葡萄糖氧化酶O210-4～2*10-2尿素(脲)脲酶NH310-5～10-2膽固醇膽固醇氧化酶H2O210-5～10-2L－谷氨酸谷氨酸脫氫酶NH4+10-4～10-1L－賴氨酸賴氨酸脫羧酶CO210-4～10-133幾種酶電極的品種與性能測(cè)定物質(zhì)酶檢測(cè)物測(cè)定范圍(mol/L)①標(biāo)準(zhǔn)曲線法

②標(biāo)準(zhǔn)比較法

③標(biāo)準(zhǔn)加入法

離子選擇性電極的分析方法1、直接法：2、間接法：樣品不經(jīng)稀釋，直接由電極測(cè)量離子活度。樣品經(jīng)緩沖溶液稀釋后由電極測(cè)量離子活度。用測(cè)定離子的純物質(zhì)配制一系列已知活度或濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用離子計(jì)測(cè)定，繪制電極電位與活度對(duì)數(shù)的關(guān)系曲線；然后在相同條件下測(cè)定樣品，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得濃度。將已知的小體積標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入已知較大體積的待測(cè)液中，根據(jù)加入前后電位值變化，求得待測(cè)液中被測(cè)離子得濃度。34①標(biāo)準(zhǔn)曲線法離子選擇性電極的分析方法1、直接法：2二、電導(dǎo)分析法電導(dǎo)分析法在外電場(chǎng)作用下，以電解質(zhì)溶液中正負(fù)離子遷移為基礎(chǔ)的電化學(xué)分析法。什麼是電導(dǎo)？●衡量電解液導(dǎo)電能力的量度值●這里所說的電導(dǎo)是指電解質(zhì)溶液中正、負(fù)離子在外電場(chǎng)作用下的遷移而產(chǎn)生的電流傳導(dǎo)●導(dǎo)電能力與溶液中正負(fù)離子的數(shù)目、離子所帶的電荷量、離子在溶液中遷移的速率等因素有關(guān)利用電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)值來確定物質(zhì)含量的分析方法利用溶液的電導(dǎo)與溶液中離子數(shù)目的相關(guān)性建立分析方法35二、電導(dǎo)分析法電導(dǎo)分析法在外電場(chǎng)作用下，以電解質(zhì)溶液中正負(fù)離第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)將液體檢測(cè)樣品直接加到含有試劑的固相載體上發(fā)生反應(yīng)，依照反應(yīng)結(jié)果定量測(cè)定樣品中特定成分的濃度或活動(dòng)的一項(xiàng)技術(shù)。干化學(xué)分析技術(shù)是以酶法為基礎(chǔ)的一類分析方法，又有干試劑化學(xué)或固相化學(xué)之稱。干化學(xué)分析36第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)將液體檢測(cè)樣品直接加一、干化學(xué)分析技術(shù)的基本原理根據(jù)多層膜測(cè)定方法不同，可將多層膜分為3種類型：反射光度法差示電位法熒光反射光度法熒光技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)免疫技術(shù)37一、干化學(xué)分析技術(shù)的基本原理根據(jù)多層膜測(cè)定方法不同，可將多層反射光度法38反射光度法38

漫反射光是指從光源發(fā)出的光進(jìn)入樣品內(nèi)部，經(jīng)過多次反射、折射、散射及吸收后返回樣品表面的光．朗伯定律描述入射光和吸收光之間的關(guān)系Kubelka—Munk理論描述一束單色光入射到一種既能吸收光，又能反射光的物體上的光學(xué)關(guān)系。39漫反射光是指從光源發(fā)出的光進(jìn)入樣品內(nèi)部，經(jīng)過多次反射、折差示電位法40差示電位法40二、干化學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用反射光度法系統(tǒng)膠片涂層技術(shù)袋式分析儀41二、干化學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用反射光度法系統(tǒng)膠片涂層技4242儀器檢測(cè):

三、干化學(xué)分析技術(shù)的影響因素反射光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)灰色試劑條離子選擇電極干式化學(xué)分析儀標(biāo)準(zhǔn)條校準(zhǔn)頻度:

質(zhì)控物:

干片試劑的儲(chǔ)存與使用:

溫度和濕度:43儀器檢測(cè):三、干化學(xué)分析技術(shù)的第三節(jié)電泳分析技術(shù)正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象

電泳：電泳技術(shù):利用電泳現(xiàn)象將多組分樣品分離、分析的技術(shù)電泳儀:可以實(shí)現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器44第三節(jié)電泳分析技術(shù)正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子帶電荷的溶一、電泳分析技術(shù)的基本原理溶液中粒子的帶電狀態(tài)兩性電離及兩性電解質(zhì):等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中不會(huì)移動(dòng)。溶液的pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶的電荷越多，電泳速度也越快。等電點(diǎn)pI:某一溶液中粒子所帶的正、負(fù)電荷相等，即凈電荷為零時(shí)溶液的pH值。45一、電泳分析技術(shù)的基本原理溶液中粒子的帶電狀態(tài)兩性電離及兩性電泳遷移率影響電泳的因素1、分子的形狀和性質(zhì)2、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度大，速度快，產(chǎn)熱多，變性；電場(chǎng)強(qiáng)度小，速度慢，產(chǎn)熱少，區(qū)帶模糊46電泳遷移率影響電泳的因素1、分子的形狀和性質(zhì)2、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)3、電泳緩沖溶液維持電泳介質(zhì)pH恒定,并起導(dǎo)電作用473、電泳緩沖溶液維持電泳介質(zhì)pH恒定,并起導(dǎo)電作用47溶液的酸堿度決定被分離物質(zhì)的解離程度和帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。pH與pI差值越大，粒子帶電量越多。緩沖溶液不能過酸過堿，以免使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，pH一般4.5-9.0為宜。48溶液的酸堿度決定被分離物質(zhì)的解離程度和帶電性緩沖溶液的離子強(qiáng)度影響緩沖容量、電泳速度和產(chǎn)熱效應(yīng)兼顧上述效應(yīng)將緩沖溶液離子強(qiáng)度設(shè)置在一個(gè)合適的范圍，一般設(shè)在0.05～0.1mol/L為宜49緩沖溶液的離子強(qiáng)度影響緩沖容量、電泳速度和產(chǎn)熱效應(yīng)兼顧上述效4、支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素膜的吸附作用較小。吸附作用和電滲作用5、蒸發(fā)504、支持介質(zhì)紙的吸附作用最大，醋酸纖維素膜的吸附作用較小。吸二、常用電泳技術(shù)及應(yīng)用按電泳方式分類1.移動(dòng)界面電泳2.區(qū)帶電泳3.穩(wěn)態(tài)電泳帶電分子的移動(dòng)速率通過觀察界面的移動(dòng)來測(cè)定帶電荷的分子在具有滲透能力的介質(zhì)上的遷移分子顆粒的電泳遷移在一定時(shí)間后達(dá)到穩(wěn)態(tài)51二、常用電泳技術(shù)及應(yīng)用按電泳方式分類1.移動(dòng)界面電泳2.按電泳支持物分類52按電泳支持物分類525353(五)等電聚焦電泳(IEF)54(五)等電聚焦電泳(IEF)54第五節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)在體外將微量的目的基因片段大量擴(kuò)增，以得到足量的DNA供研究分析和檢測(cè)鑒定用的技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction（PCR）55第五節(jié)基因擴(kuò)增技術(shù)在體外將微量的目的基因片段大量一、PCR反應(yīng)基本原理56一、PCR反應(yīng)基本原理56含Mg2+的緩沖液dNTPs耐熱DNA聚合酶TagDNA聚合酶特異性引物一對(duì)分別與待擴(kuò)增DNA序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸片段。模板DNAPCR反應(yīng)體系57含Mg2+的緩沖液dNTPs耐熱DNA聚合酶特異性引物模板DPCR基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C循環(huán)25~30次使模板DNA完全變性成單鏈。同時(shí)引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除使引物和模板DNA退火結(jié)合此溫度下DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA鏈的延長(zhǎng)三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進(jìn)入下一輪循環(huán)58PCR基本反應(yīng)步驟變性延伸退火循環(huán)使模板DNA完全變性成單鏈第一輪循環(huán)5/3/3/5/5/5/5/5/引物A引物B變性（95℃）6075859590807065555045403530℃退火（60℃）延伸（72℃）DNA-PolDNA-Pol溫度59第一輪循環(huán)5/3/3/5/5/5/5/5/引物A引物B變性（第二輪循環(huán)5/5/5/3/3/5/5/5/引物A引物B6075859590807065555045403530℃變性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）5/5/5/5/溫度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol60第二輪循環(huán)5/5/5/3/3/5/5/5/引物A引物B607第三次循環(huán)5/5/5/5/5/5/5/6075859590807065555045403530℃5/變性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）溫度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol61第三次循環(huán)5/5/5/5/5/5/5/60758595908基因組DNADNA樣品第一次循環(huán)第二次循環(huán)第三次循環(huán)第四次循環(huán)待擴(kuò)增序列引物A引物B3/5/3/5/5/3/5/3/62基因組DNADNA樣品第一次循環(huán)第二次循環(huán)第三次循環(huán)第四次循一種新的核酸微量分析技術(shù)。尤其在定量RT-PCR中具有重要價(jià)值。實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍。實(shí)時(shí)PCR的基本原理是：引入熒光標(biāo)記分子，使PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物量成正比，對(duì)每一個(gè)反應(yīng)時(shí)刻的熒光信號(hào)實(shí)時(shí)分析可以計(jì)算PCR產(chǎn)物量。根據(jù)動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)可以精確計(jì)算樣品中原有模板含量。熒光定量PCR技術(shù)

63一種新的核酸微量分析技術(shù)。實(shí)時(shí)PCR的基本原理是：熒光定量P實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理示意圖沒有擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)探針保持完整，熒光報(bào)告分子和熒光淬滅分子同時(shí)存在于探針上，無熒光信號(hào)釋放。上游引物下游引物熒光探針引物RQQRQRQ傳統(tǒng)的PCR實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)增加了特殊引物作為探針3’端熒光淬滅分子（Quencher，Q）5’端熒光報(bào)告分子（Reporter，R）QRRQPCR進(jìn)行時(shí)，TaqDNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合著的熒光探針，其5’→3’核酸外切酶逐步切斷熒光探針探針，熒光報(bào)告分子和熒光淬滅分子分離產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光信號(hào)被檢測(cè)系統(tǒng)接收用于數(shù)據(jù)分析。R64實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理示意圖沒有擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)探針保持完整，上游引物熒光定量PCR的臨床應(yīng)用肝炎、禽流感、結(jié)核等傳染病的診斷；性別發(fā)育異常；、珠蛋白生成障礙性貧血、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)記物及癌基因檢測(cè)與診斷。65熒光定量PCR的臨床應(yīng)用肝炎、禽流感、結(jié)核等傳染病的診斷；6謝謝66謝謝66第三章

生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)光譜分析技電化學(xué)分析技術(shù)干化學(xué)分析技術(shù)電泳分析技術(shù)基因擴(kuò)增技術(shù)67第三章1第一節(jié)光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)發(fā)射光譜分析技術(shù)散射光譜分析技術(shù)68第一節(jié)光譜分析技術(shù)吸收光譜分析技術(shù)2一、吸收光譜分析法69一、吸收光譜分析法30.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示器鎢燈、鹵鎢燈350～1000氫燈、氘燈180～360濾光片棱鏡光柵玻璃比色皿石英比色皿700.575光源單色器吸收池檢測(cè)器顯示器鎢燈、鹵鎢燈350～(一)、分光光度技術(shù)的基本原理1、吸光度與透光度

A=-lgT=-lgI/I0=lgI0/I

當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時(shí)可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為I，I和I0之比稱為透光度，即：T=I/I0T×100%為T%稱為百分透光度。透光度的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度即：入射光I0透射光I71(一)、分光光度技術(shù)的基本原理1、吸光度與透光度2、Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。A=KLCA為吸光度；K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時(shí)，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比。L722、Lambert-Beer定律Lambert-Beer定律737Lambert-Beer定律適用于:可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體以及分散均勻的固態(tài)或氣態(tài)樣品.單色光均勻介質(zhì)吸收物質(zhì)無相互作用3、Lambert-Beer定律的應(yīng)用條件4、Lambert-Beer定律的偏離現(xiàn)象74Lambert-Beer定律適用于:單色光3、Lambert在分光光度法中，為消除顯色劑及樣品中各種共存有色物質(zhì)產(chǎn)生的干擾、抵消比色皿和試劑對(duì)入射光的影響而用來調(diào)節(jié)儀器百分透光率為100%的溶液。5、空白溶液的選擇

蒸餾水

試劑樣品不含待測(cè)元素不顯色1、溶劑空白：不加樣品和任何試劑，用純?nèi)軇ㄈ缯麴s水或其他有機(jī)溶劑）作參比溶液。選擇原則：當(dāng)顯色劑及其它試劑均無色，被測(cè)試樣中又無其他有色離子時(shí)，選用溶劑參比。2、試劑空白：用不加樣品，而顯色劑和其他試劑都相同的溶液作參比溶液。

選擇原則：當(dāng)顯色劑本身有顏色或其它試劑有顏色，被測(cè)試樣中又無其他有色離子時(shí)，選用試劑參比。3、樣品空白：用不加顯色劑的樣品溶液作參比溶液。

選擇原則：當(dāng)試樣溶液有顏色，而試劑、顯色劑均無顏色時(shí)，選用樣品空白。4、平行操作空白：按樣品分析完全相同的操作步驟，用不含待測(cè)元素的樣品進(jìn)行平行操作，以消除操作過程中引入干擾雜質(zhì)所帶來的誤差。

選擇原則：當(dāng)操作過程中由于試劑、器皿、水和氣等因素引入了一定量的被測(cè)試樣組分的干擾離子5、不顯色空白：可將一份試樣加入適當(dāng)?shù)难诒蝿?，將被測(cè)組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑和其它試劑均按照操作手續(xù)加入，以此作為參比溶液，這樣可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。選擇原則：當(dāng)顯色劑和被測(cè)試樣均有顏色時(shí)，可選用此法。75在分光光度法中，為消除顯色劑及樣品中各種共存(二)、分光光度法在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用廣泛1、對(duì)未知化合物進(jìn)行定性分析2、對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定定性依據(jù)：最大吸收波長(zhǎng)λmax和摩爾吸光系數(shù)ε標(biāo)準(zhǔn)曲線法和比較法76(二)、分光光度法在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線法

根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條通過原點(diǎn)的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)溶液測(cè)定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。方法：77(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線法根據(jù)Lambert-Beer定律5.標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。785.標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。122．比較法CR=(AR×Cs)/As己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：792．比較法CR=(AR×Cs)/As己知濃度的標(biāo)二、發(fā)射光譜分析法處于激發(fā)態(tài)的待測(cè)元素，原子回到基態(tài)時(shí)以輻射的形式釋放出能量，由此而產(chǎn)生的光譜稱為發(fā)射光譜，對(duì)元素進(jìn)行定性與定量分析的方法。發(fā)射光譜是指樣品本身產(chǎn)生的光譜被檢測(cè)器接收；吸收光譜是光源發(fā)射的光譜被樣品吸收了一部分，剩下的那部分光譜被檢測(cè)器接收。火焰光度法熒光光度法80二、發(fā)射光譜分析法處于激發(fā)態(tài)的待測(cè)元素，原子火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量被測(cè)元素所發(fā)射的輻射強(qiáng)度來進(jìn)行定量分析的方法。它是一種簡(jiǎn)化的發(fā)射光譜分析法（一）、火焰光度法FP640火焰光度計(jì)火焰光度法分析示意圖81火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量被測(cè)元素所發(fā)火焰光度法的特點(diǎn)⑤應(yīng)用范圍窄③靈敏①快速②準(zhǔn)確④設(shè)備簡(jiǎn)單試樣溶液于數(shù)分鐘內(nèi)可完成測(cè)定火焰光源穩(wěn)定性高，干擾少，誤差為2％~5％，可用于微量分析和常量分析分析堿金屬與堿土金屬，絕對(duì)靈敏度可達(dá)0．1～10×10－6g被測(cè)試樣易被火焰激發(fā)，產(chǎn)生的譜線較簡(jiǎn)單，且均在可見光區(qū)，故使譜線分離和測(cè)量的設(shè)備簡(jiǎn)單主要用于堿金屬和部分堿土金屬的測(cè)定82火焰光度法的特點(diǎn)⑤應(yīng)用范圍窄③靈敏①快速②準(zhǔn)確④設(shè)備簡(jiǎn)單試樣1、激發(fā)條件影響火焰光度分析的因素2、試樣的種類和組成3、試液中共存離子對(duì)測(cè)定有影響4、儀器的質(zhì)量火焰溫度要適當(dāng)，溫度過低靈敏度下降，溫度太高則堿金屬電離嚴(yán)重，影響測(cè)量的線性關(guān)系。831、激發(fā)條件影響火焰光度分析的因素2、試樣的種類和組成3、試（二）、熒光分光光度法化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。利用物質(zhì)吸收較短波長(zhǎng)的光能后發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)特征光譜的性質(zhì)，對(duì)物質(zhì)定性或定量分析的方法。熒光的定義：某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。熒光產(chǎn)生的原理：熒光分光光度法分析測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、維生素等;對(duì)某些激素及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定;當(dāng)化合物含量太少,一般分析方法靈敏度不夠時(shí),使用熒光分析技術(shù)就能解決測(cè)定問題。84（二）、熒光分光光度法化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能三、散射光譜分析法透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見的兩種方法，其反應(yīng)的原理一樣，只是檢測(cè)的光信號(hào)與儀器的檢測(cè)器有區(qū)別。1、透射比濁操作簡(jiǎn)便，適用于普通的自動(dòng)生化分析儀和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測(cè)的周期較長(zhǎng)。2、散射比濁的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測(cè)快速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，試劑價(jià)格高。光的散射用單色光照射透明溶液時(shí)，大部分按原來方向透射，而一小部分則按不同的角度散射開來。散射光譜分析法利用懸浮顆?；鞚嵋旱纳⑸涔鈴?qiáng)度或?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進(jìn)行定量分析的方法。85三、散射光譜分析法透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見的兩種方第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)86第二節(jié)電化學(xué)分析技術(shù)20一、電位分析法―ISE利用電極電位與濃度的關(guān)系測(cè)定物質(zhì)含量的電化學(xué)分析方法。電位分析法一類用特殊敏感膜制成，對(duì)溶液中某種特定離子有選擇性響應(yīng)的電化學(xué)傳感器離子選擇電極ISE電解質(zhì)溶液中參與電化學(xué)反應(yīng)的離子的有效濃度87一、電位分析法―ISE利用電極電位與濃度的關(guān)系測(cè)定物質(zhì)含量8822

離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基本結(jié)構(gòu)都包括：對(duì)特定離子有選擇性響應(yīng)的薄膜(敏感膜或傳感膜)、內(nèi)參比溶液與內(nèi)參比電極。敏感膜將內(nèi)側(cè)參比溶液與外側(cè)的待測(cè)離子溶液分開，是電極的關(guān)鍵部位。ISE基本結(jié)構(gòu)內(nèi)參比電極電極殼體內(nèi)參比溶液敏感膜離子選擇性電極結(jié)構(gòu)示意圖89離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基電極電位90電極電位24電極電位測(cè)量在電位分析中，構(gòu)成電池的兩個(gè)電極，其中一個(gè)，其電位值隨待測(cè)離子濃(活)度的變化而變化，能指示待測(cè)離子的濃(活)度，稱為指示電極，或離子選擇性電極。指示電極而另一個(gè)電極，其電位不受試液組成變化的影響，具有較恒定的數(shù)值，只是作為測(cè)量電位的標(biāo)準(zhǔn)，稱為參比電極(參考電極)。

參比電極離子選擇性電極：電位法測(cè)定溶液中某種定離子活度的指示電極；能在多種離子存在的混合液中，選擇性地響應(yīng)該特定離子，指示出這種離子活度變化情況，測(cè)定離子的活度或濃度。91電極電位測(cè)量在電位分析中，構(gòu)成電池的兩個(gè)電極，其中一個(gè)，其電①選擇性好

在多數(shù)情況下，共存的離子干擾小，對(duì)組成復(fù)雜的試樣往往不需要分離處理就可直接測(cè)定。

②靈敏度高

電位法的檢出限為10-5～10-8mol/L，適于微量組分的測(cè)定，電位滴定法適于常量分析。

③快速

儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分析快速、測(cè)定范圍寬、不破壞試液，易于實(shí)現(xiàn)分析自動(dòng)化。

④缺點(diǎn)需要有專用的離子選擇性電極。電位分析法的特點(diǎn)：92①選擇性好在多數(shù)情況下，共存的離3、離子選擇性電極的分類和主要類型根據(jù)國(guó)際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：

根據(jù)國(guó)際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：

常用的離子選擇電極933、離子選擇性電極的分類和主要類型根據(jù)國(guó)際純粹及玻璃膜電極94玻璃膜電極28氣敏電極如，二氧化碳?xì)饷綦姌O：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由醋酸纖維、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。測(cè)定時(shí)，CO2氣體通過微孔滲透膜與中介溶液接觸(中介液是0.001mol/L的NaHCO3)；由于CO2與H2O結(jié)合生成碳酸，從而影響到碳酸氫鈉的電離平衡。氣敏電極通過界面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行工作的，離子電極用來指示中介液中某一離子活度的變化。溶解在水溶液中的氣體，只要能生成可用離子選擇性電極檢出的離子，均可用氣敏電極測(cè)定。用pH玻璃電極間接測(cè)定CO2的含量

氣敏電極是一種氣體傳感器，測(cè)定溶液中的氣體含量。原理：利用待測(cè)氣體對(duì)某一化學(xué)平衡的影響，使平衡中某特定離子的活度發(fā)生變化，來測(cè)定試液中被測(cè)氣體的分壓(含量)。

在氣敏電極的中介溶液中放入玻璃電極。測(cè)量時(shí)，控制試液的酸堿度，使CO2通過氣透膜擴(kuò)散加入氣敏電極；引起中介溶液pH的改變。測(cè)定中介溶液的pH值，即可計(jì)算出試液中CO2的濃度。95氣敏電極如，二氧化碳?xì)饷綦姌O：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由9630

CO2+H2O===HCO3-+H+NH3+H2O===NH4++OH-SO2+H2O===HSO3-+H+2NO2+H2O===NO3-+NO2-+H+H2S+H2O===HS-+H3O+HCN+H2O===H3O++CN-HF+H2O===H3O++F-

凡是溶于水釋放H+的反應(yīng)，都可以用pH玻璃電極檢出；而后三種分別可以用S2-、CN-、F-等離子選擇性電極來檢測(cè)。可用電極測(cè)定的氣體97CO2+H2O===HCO3-+H酶的催化反應(yīng)專一強(qiáng)；酶電極有極高的選擇性。作為一種生物傳感器，酶電極特別適用于生物醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域。酶電極①選擇適合的指示電極②制成具有催化活性的水不溶性酶膜③把酶膜固定在電極的表面(酶的固定化)

酶電極的制作過程將生物酶涂布在離子選擇性電極或其它傳感器的敏感膜上，通過酶催化作用，使待測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生能在該電極上響應(yīng)的離子或化合物，間接測(cè)定該物質(zhì)。脲酶催化分解尿素產(chǎn)生NH3、CO2，溶于水可得到不同產(chǎn)物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用相應(yīng)的離子選擇性電極來檢測(cè)它們，間接得到尿素的含量。常用的固定化技術(shù)有：吸附、試劑交聯(lián)、共價(jià)鍵合、包埋法(酶與載體聚丙酰胺混合后直接包在電極敏感部分形成酶凝膠層)。98酶的催化反應(yīng)專一強(qiáng)；酶電極有極高的選擇性。作為一種生物傳感幾種酶電極的品種與性能測(cè)定物質(zhì)酶檢測(cè)物測(cè)定范圍(mol/L)葡萄糖葡萄糖氧化酶O210-4～2*10-2尿素(脲)脲酶NH310-5～10-2膽固醇膽固醇氧化酶H2O210-5～10-2L－谷氨酸谷氨酸脫氫酶NH4+10-4～10-1L－賴氨酸賴氨酸脫羧酶CO210-4～10-199幾種酶電極的品種與性能測(cè)定物質(zhì)酶檢測(cè)物測(cè)定范圍(mol/L)①標(biāo)準(zhǔn)曲線法

②標(biāo)準(zhǔn)比較法

③標(biāo)準(zhǔn)加入法

離子選擇性電極的分析方法1、直接法：2、間接法：樣品不經(jīng)稀釋，直接由電極測(cè)量離子活度。樣品經(jīng)緩沖溶液稀釋后由電極測(cè)量離子活度。用測(cè)定離子的純物質(zhì)配制一系列已知活度或濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用離子計(jì)測(cè)定，繪制電極電位與活度對(duì)數(shù)的關(guān)系曲線；然后在相同條件下測(cè)定樣品，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得濃度。將已知的小體積標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入已知較大體積的待測(cè)液中，根據(jù)加入前后電位值變化，求得待測(cè)液中被測(cè)離子得濃度。100①標(biāo)準(zhǔn)曲線法離子選擇性電極的分析方法1、直接法：2二、電導(dǎo)分析法電導(dǎo)分析法在外電場(chǎng)作用下，以電解質(zhì)溶液中正負(fù)離子遷移為基礎(chǔ)的電化學(xué)分析法。什麼是電導(dǎo)？●衡量電解液導(dǎo)電能力的量度值●這里所說的電導(dǎo)是指電解質(zhì)溶液中正、負(fù)離子在外電場(chǎng)作用下的遷移而產(chǎn)生的電流傳導(dǎo)●導(dǎo)電能力與溶液中正負(fù)離子的數(shù)目、離子所帶的電荷量、離子在溶液中遷移的速率等因素有關(guān)利用電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)值來確定物質(zhì)含量的分析方法利用溶液的電導(dǎo)與溶液中離子數(shù)目的相關(guān)性建立分析方法101二、電導(dǎo)分析法電導(dǎo)分析法在外電場(chǎng)作用下，以電解質(zhì)溶液中正負(fù)離第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)將液體檢測(cè)樣品直接加到含有試劑的固相載體上發(fā)生反應(yīng)，依照反應(yīng)結(jié)果定量測(cè)定樣品中特定成分的濃度或活動(dòng)的一項(xiàng)技術(shù)。干化學(xué)分析技術(shù)是以酶法為基礎(chǔ)的一類分析方法，又有干試劑化學(xué)或固相化學(xué)之稱。干化學(xué)分析102第三節(jié)干化學(xué)分析技術(shù)將液體檢測(cè)樣品直接加一、干化學(xué)分析技術(shù)的基本原理根據(jù)多層膜測(cè)定方法不同，可將多層膜分為3種類型：反射光度法差示電位法熒光反射光度法熒光技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)免疫技術(shù)103一、干化學(xué)分析技術(shù)的基本原理根據(jù)多層膜測(cè)定方法不同，可將多層反射光度法104反射光度法38

漫反射光是指從光源發(fā)出的光進(jìn)入樣品內(nèi)部，經(jīng)過多次反射、折射、散射及吸收后返回樣品表面的光．朗伯定律描述入射光和吸收光之間的關(guān)系Kubelka—Munk理論描述一束單色光入射到一種既能吸收光，又能反射光的物體上的光學(xué)關(guān)系。105漫反射光是指從光源發(fā)出的光進(jìn)入樣品內(nèi)部，經(jīng)過多次反射、折差示電位法106差示電位法40二、干化學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用反射光度法系統(tǒng)膠片涂層技術(shù)袋式分析儀107二、干化學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用反射光度法系統(tǒng)膠片涂層技10842儀器檢測(cè):

三、干化學(xué)分析技術(shù)的影響因素反射光度計(jì)標(biāo)準(zhǔn)灰色試劑條離子選擇電極干式化學(xué)分析儀標(biāo)準(zhǔn)條校準(zhǔn)頻度:

質(zhì)控物:

干片試劑的儲(chǔ)存與使用:

溫度和濕度:109儀器檢測(cè):三、干化學(xué)分析技術(shù)的第三節(jié)電泳分析技術(shù)正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象

電泳：電泳技術(shù):利用電泳現(xiàn)象將多組分樣品分離、分析的技術(shù)電泳儀:可以實(shí)現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器110第三節(jié)電泳分析技術(shù)正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子帶電荷的溶一、電泳分析技術(shù)的基本原理溶液中粒子的帶電狀態(tài)兩性電離及兩性電解質(zhì):等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中不會(huì)移動(dòng)。溶液的pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶的電荷越多，電泳速度也越快。等電點(diǎn)pI:某一溶液中粒子所帶的正、負(fù)電荷相等，即凈電荷為零時(shí)溶液的pH值。111一、電泳分析技術(shù)的基本原理溶液中粒子的帶電狀態(tài)兩性電離及兩性電泳遷移率影響電泳的因素1、分子的形狀和性質(zhì)2、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度大，速度快，產(chǎn)熱多，變性；電場(chǎng)強(qiáng)度小，速度慢，產(chǎn)熱少，區(qū)帶模糊112電泳遷移率影響電泳的因素1、分子的形狀和性質(zhì)2、電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)3、電泳緩沖溶液維持電泳介質(zhì)pH恒定,并起導(dǎo)電作用1133、電泳緩沖溶液維持電泳介質(zhì)pH恒定,并起導(dǎo)電作用47溶液的酸堿度決定被分離物質(zhì)的解離程度和帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。pH與pI差值越大，粒子帶電量越多。緩沖溶液不能過酸過堿，以免使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，pH一般4.5-9.0為宜。114溶液的酸堿度決定被分離物質(zhì)的解離程度和帶電性緩沖溶液的離子強(qiáng)度影響緩沖容量、電泳速度和產(chǎn)熱效應(yīng)兼顧上述效應(yīng)將緩沖溶液離子強(qiáng)度設(shè)置在一個(gè)合適的范圍，一般設(shè)在0.05～0.1mol/L為宜115緩沖溶液的離子強(qiáng)度影響緩沖容量、電泳速度和產(chǎn)熱效應(yīng)兼顧上述效4、支