絲狀真菌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化及染色技術(shù)-source

絲狀真菌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化及染色技術(shù)商艷芳2015年7月23日農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化第一部分農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化原理農(nóng)桿菌介導真菌遺傳轉(zhuǎn)化主要使用根癌農(nóng)桿菌。根癌農(nóng)桿菌細胞中含有Ti(Tumourinducing)質(zhì)粒，其上有一段T-DNA(TransferringDNA)，農(nóng)桿菌通過侵染受體真菌后，可將T-DNA插入到真菌基因組中，并且可以穩(wěn)定的遺傳給后代，這一特性成為農(nóng)桿菌介導真菌遺傳轉(zhuǎn)化的理論基礎(chǔ)。T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合過程依賴于Ti質(zhì)粒上一系列Vir基因（Virulencegenes）的激活表達協(xié)助完成。Vir基因的表達受到乙酰丁香酮（AS）等酚類物質(zhì)的誘導。VirA識別AS發(fā)生自身磷酸化，然后將磷酸基團轉(zhuǎn)移給VirG使其活化，活化的VirG作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控與T-DNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的操縱子如VirB/C/D/E/F/H等的表達。另外，酸性pH更利于AS對Vir基因的誘導。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)分為一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)，兩者區(qū)別在于T-DNA和Vir基因區(qū)是否在同一Ti質(zhì)粒上。目前應用較多的是雙元載體，其構(gòu)建方法較簡單，對外源基因的轉(zhuǎn)化效率也要高于一元載體。農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化原理農(nóng)桿菌介導真菌遺傳轉(zhuǎn)化步驟目的基因克隆與載體構(gòu)建真菌轉(zhuǎn)化菌株確立目的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌真菌培養(yǎng)農(nóng)桿菌誘導培養(yǎng)新鮮受體材料收集（真菌分生孢子等）農(nóng)桿菌與真菌共培養(yǎng)目的基因在受體真菌中的整合和表達真菌轉(zhuǎn)化子篩選與驗證具體轉(zhuǎn)化步驟（以羅伯茨綠僵菌為例）根癌農(nóng)桿菌菌株AGL-1感受態(tài)的制備1.從YEB平板上挑取菌株AGL-1的單菌落到5mLYEB液體培養(yǎng)基中（含50μg/mLCarb），28℃，220rpm培養(yǎng)過夜。2.取2mL上述菌液到50mLYEB（含50μg/mLCarb）中，28℃，220rpm搖床培養(yǎng)至菌液在600nm處的吸收值為0.5左右，約8h。3.將菌液倒入干凈的50mL聚丙烯管中，冰上冰浴30min后，4℃，8000rpm離心5min收集菌體。4.用10ml20mMCaCl2洗一次，4℃，8000rpm離心5min再次收集菌體。5.棄上清，用2mL20mMCaCl2懸浮菌體，加入無菌甘油至終濃度為15%～20%。每份100μL分裝，液氮速凍后于-80℃保存。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL-11.將保存于-80℃的農(nóng)桿菌感受態(tài)取出，置于冰上融化10min。2.加0.5～1μg目的質(zhì)粒，移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min。3.液氮速凍5min，37℃溫育5min，立即冰浴2min。4.加入1mL液體YEB，28℃，150rpm培養(yǎng)3h。5.8000rpm離心2min，棄上清，收集菌體。6.用100μL液體YEB重懸菌體并均勻涂布在YEB平板上(含50μg/mLCarb和50μg/mLKan)，28℃靜置培養(yǎng)2天。7.挑取轉(zhuǎn)化子用5mL液體YEB(含50μg/mLCarb和50μg/mLKan)，28℃，220rpm培養(yǎng)過夜。PCR驗證轉(zhuǎn)化子是否為陽性，最后將陽性菌液保存于-80℃（含15%的甘油）。真菌分生孢子孢懸液的制備1.從培養(yǎng)10天左右的PDA平板上刮取適量的真菌分生孢子到1mL無菌的含0.05%Tween-20水液中，渦旋2～3min。2.用玻璃絲棉過濾除去菌絲，濾液用1.5mLEpendorf管收集。3.12000rpm離心3min收集孢子。4.去上清，用1mL無菌生理鹽水（0.85%，w/v）重懸孢子，12000rpm離心3min再次收集孢子。重復本步驟一次。5.用適量的生理鹽水（或無菌水）重懸孢子，血球計數(shù)板計算孢子數(shù)目，將孢子懸液稀釋至106conidia/mL濃度，水懸液一般現(xiàn)配現(xiàn)用，生理鹽水懸液可于4℃保存，一周內(nèi)使用。真菌轉(zhuǎn)化1.接種成功轉(zhuǎn)入目的基因載體的AGL-1農(nóng)桿菌單菌落到4ml液體YEB中（含50g/mlCarb和50g/mlKan），28℃，220rpm培養(yǎng)過夜。2.8000rpm離心3min收集菌體，去上清用適量的IM液體（200μMAS，40mM嗎啉乙磺酸）培養(yǎng)基重懸菌體，并將菌液濃度調(diào)到在OD600為0.15。3.28℃，220rpm培養(yǎng)6h左右，菌液OD600達到0.5～0.8。4.取農(nóng)桿菌菌液及制備好的孢懸液各100μL，充分混和均勻后涂布于IM（200μMAS，40mMMES）平板（10mL），25℃靜置培養(yǎng)48h。5.取與共培養(yǎng)的IM平板等體積（10mL）的M-100培養(yǎng)基（1%Agar，600μg/ml噻孢霉素和400μg/ml草胺膦）覆蓋于IM平板上。6.25℃培養(yǎng)5～10天至抗性菌落出現(xiàn)。7.挑取抗性菌落并轉(zhuǎn)移到同樣的抗性培養(yǎng)基平板上，進行第二次篩選。8.從二篩平板上挑出抗性菌落（轉(zhuǎn)化子），抽提基因組并進行PCR驗證。影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素1.受體類型：新鮮萌發(fā)的分生孢子效果較其他組織好；2.農(nóng)桿菌菌株：AGL1>LBA4404，LBA1100，EHA105等3.AS濃度：20-200M為宜；4.共培養(yǎng)時間和溫度：球孢白僵菌72h，羅伯茨綠僵菌48h等；農(nóng)桿菌最適28℃，羅伯茨綠僵菌25℃等；5.農(nóng)桿菌與受體菌株濃度；6.篩選標記的選擇（潮霉素、草胺磷、苯菌靈等）。農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化的優(yōu)點1.受體材料范圍廣：除原生質(zhì)體外還可以是孢子、菌絲體和子實體等；2.轉(zhuǎn)化效率高：研究表明農(nóng)桿菌介導真菌轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化效率為傳統(tǒng)遺傳轉(zhuǎn)化方法的100~1000倍；3.轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定遺傳：選擇單核的分生孢子作為初始材料可以獲得后代不分離的轉(zhuǎn)化子，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定遺傳性；4.T-DNA多為單拷貝插入：對于缺少有性生殖階段的真菌，單拷貝插入有利于目的基因的分離和克?。?.農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設備簡單，易于推廣。真菌染色技術(shù)NucleusstainingCellwallstainingLipiddropletsstainingMitochondriastaining第二部分NucleusstainingDAPI即4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡下細胞核觀察。染色原理DAPI可以穿透完整的細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合，從而發(fā)揮標記作用，其產(chǎn)生的熒光強度是自身的20多倍。DAPI是利用紫外光波長的光線激發(fā)。當DAPI與雙股DNA結(jié)合時，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm，其發(fā)散光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果，其發(fā)散光的波長范圍約在400nm左右。DAPI的發(fā)散光為藍色，且DAPI和綠色熒光蛋白或紅色熒光染劑的發(fā)散波長僅有少部分重疊，因此可以在單一的樣品上進行多重熒光染色觀察。染色步驟（以羅伯茨綠僵菌為例）1.收集生長14天的綠僵菌孢子或SDB液體培養(yǎng)4天的綠僵菌菌絲，并用PBS洗滌1-2次；2.用3.7％的甲醛（PBS配制）固定30min后，PBS洗滌2-3次；（此步驟亦可省去）3.將樣品轉(zhuǎn)移到棕色1.5mL離心管中，加入1mLPBS；

4.在暗室中加入細胞核染料DAPI（使用濃度為0.5-10μg/mL），置于脫色搖床上反應30min；5.12000rpm離心2min，棄上清，用PBS清洗樣品2-3次；6.熒光顯微鏡下觀察。染色圖片展示細胞核常用熒光染料有還有：吖啶橙（AcridineOrange，AO）、溴化乙錠（EthidiumBromide，EB）、Hoechst染料、碘化丙啶（PropidiumIodide，PI）、EthDIII等。AO：具有膜通透性，能透過細胞膜，將核DNA和RNA分別染成綠色和紅色，因此使細胞核呈綠色或黃綠色熒光。EB：一種高度靈敏的熒光染色劑，在標準302nm處激發(fā)出橙紅色信號。Hoechst染料：最常見的兩種是Hoechst33342和Hoechst33258。這兩種染料都在紫外350nm處被激發(fā)，在461nm處最大發(fā)射光附近發(fā)射青/藍色熒光。與DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更強的親脂性，因此能更好的透過完整的細胞膜，并且細胞毒性更小。PI：不能穿過活細胞膜，但卻能穿過凋亡中晚期的細胞和死細胞的膜而對核染色。PI作為紅色熒光復染劑首選，PI經(jīng)常與Calcein-AM或者FDA等熒光探針合用，區(qū)分死/活細胞。EthDIII：不能透過細胞膜，但能將壞死細胞區(qū)分開來，更適合凋亡壞死實驗的檢測；

Cellwallstaining真菌細胞壁主要由多糖和糖蛋白組成，多糖主要包括幾丁質(zhì)，β-1,6-葡聚糖和β-1,3-葡聚糖等組成。CalcofluorWhite(CFW)對幾丁質(zhì)中β-1,4-糖苷鍵具有高度親和性，因而可以作為絲狀真菌細胞壁的標記染料。在一定的長波紫外光下,被CFW染色的真菌會發(fā)出很強的亮藍色熒光。染色步驟將待染樣品置于載玻片上，滴入一滴細胞壁染料Calcofluorwhite(4μg/mL)，并滴入一滴30%的KOH，靜止兩分鐘，即可在熒光顯微鏡下進行觀察。染色圖片展示另外，常用的真菌細胞壁染料還有ConA、GSII、GNL等。其中ConA（刀豆素A）主要標記葡萄糖苷和甘露糖苷，GSII（加納籽素）主要標記幾丁質(zhì)，GNL（雪花蓮凝集素）主要標記甘露糖。脂滴是細胞內(nèi)中性脂（neutrallipids）的主要貯存場所，廣泛存在于細菌、酵母、植物、昆蟲以及動物細胞中。脂滴的大小差別很大，直徑從40nm至100um不等。BODIPY是一類親脂性的染料，其中D-3922(4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene(BODIPY?493/503))可特異結(jié)合中性脂，從而可以標記脂滴發(fā)出綠色熒光。Lipiddropletsstaining1.收集真菌孢子或菌絲，并用PBS洗滌一次。2.用3.7％的甲醛（PBS配制）固定30min后，PBS洗滌2-3次。（此步驟亦可省去）3.將樣品轉(zhuǎn)入到棕色1.5ml離心管中，加入1mlPBS。4.在暗室中加入終濃度為10μg/ml的熒光染料BODIPY（1mg/mlinethanol母液），置于脫色搖床上染色30min-1hour。5.12000rpm離心2分鐘，棄去上清，加入500μlPBS懸浮樣品。同樣方法清洗2-3次。6.熒光顯微鏡觀察。染色步驟（以羅伯茨綠僵菌為例）染色圖片展示另外，尼羅紅染色劑（9-diethylamino-5H-benzo[alpha]-phenoxazine-5-one，Nile

red）也是一種親脂性的惡嗪類熒光染料。與脂類物質(zhì)包括臘酯（wax

ester）和三酰甘油（triacylglycerol）以及各種脂肪酸結(jié)合后，在激發(fā)波長543nm的激發(fā)下，顯示強烈桔紅色熒光（散發(fā)波長598nm），在紫外光的照射下顯示紅色。與尼羅紅相比，BODIPY染料更加特異地標記脂滴，且操作簡單，圖像更清晰。MitochondriastainingMitoTracker是專門標記活體細胞線粒體的一類熒光探針。此類熒光探針與傳統(tǒng)線粒體標記探針如tetramethylrosamine和rhodamine123相比