藥物的常規(guī)檢驗(yàn)

0631pH值測(cè)定法pH值是水溶液中氫離子活度的方便表示方法。pH值定義為水溶液中氫離子活度（aH+）的負(fù)對(duì)數(shù)，即pH=-lgaH+,但氫離子活度卻難以由實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確測(cè)定。為實(shí)用方便，溶液的pH值規(guī)定為由下式測(cè)定：pH=pHs—E-Es式中E為含有待測(cè)溶液（pH）的原電池電動(dòng)勢(shì)，V；ES為含有標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pHS）的原電池電動(dòng)勢(shì)，V；k為與溫度（t,回）有關(guān)的常數(shù)。k=0.05916+0.000198（t—25）由于待測(cè)物的電離常數(shù)、介質(zhì)的介電常數(shù)和液接界電位等諸多因素均可影響pH值的準(zhǔn)確測(cè)量，所以實(shí)驗(yàn)測(cè)得的數(shù)值只是溶液的表觀pH值，它不能作為溶液氫離子活度的嚴(yán)格表征。盡管如此，只要待測(cè)溶液與標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組成足夠接近，由上式測(cè)得的pH值與溶液的真實(shí)pH還是頗為接近的。溶液的pH值使用酸度計(jì)測(cè)定。水溶液的pH值通常以玻璃電極為指示電極、飽和甘汞電極或銀-氯化銀電極為參比電極進(jìn)行測(cè)定。酸度計(jì)應(yīng)定期進(jìn)行計(jì)量檢定，并符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定。測(cè)定前，應(yīng)采用下列標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正儀器，也可用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理部門發(fā)放的標(biāo)示pH值準(zhǔn)確至0.01pH單位的各種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正儀器。1、儀器校正用的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（1）草酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液精密稱取在54回±3℃干燥4?5小時(shí)的草酸三氫鉀12.71g,加水使溶解并稀釋至1000ml。(2)苯二甲酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液精密稱取在115回±5℃干燥2?3小時(shí)的鄰苯二甲酸氫鉀10.21g,加水使溶解并稀釋至1000ml。(3)磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液精密稱取在115回±5℃干燥2?3小時(shí)的無(wú)水磷酸氫二鈉3.55g與磷酸二氫鉀3.40g,加水使溶解并稀釋至1000ml。(4)硼砂標(biāo)準(zhǔn)緩沖液精密稱取硼砂3.81g(注意避免風(fēng)化)，加水使溶解并稀釋至1000m1,置聚乙烯塑料瓶中，密塞，避免空氣中二氧化碳進(jìn)入。(5)氫氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)緩沖液于25囿用無(wú)二氧化碳的水和過(guò)量氫氧化鈣經(jīng)充分振搖制成飽和溶液，取上清液使用。因本緩沖液是25回時(shí)的氫氧化鈣飽和溶液，所以臨用前需核對(duì)溶液的溫度是否在25囿否則需調(diào)溫至25回再經(jīng)溶解平衡后，方可取上清液使用。存放時(shí)應(yīng)防止空氣中二氧化碳進(jìn)入。一旦出現(xiàn)渾濁，應(yīng)棄去重配。上述標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液必須用pH值基準(zhǔn)試劑配制。不同溫度時(shí)各種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的pH值如下表。溫度/回草酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液苯二甲酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液硼砂標(biāo)準(zhǔn)緩沖液氫氧化鈣標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(25℃飽和溶液)01.674.016.989.4613.4351.674.006.959.4013.21101.674.006.929.3313.00151.674.006.909.2712.81201.684.006.889.2212.63251.684.016.869.1812.45301.684.016.859.1412.30351.694.026.849.1012.14401.694.046.849.0611.98451.704.056.839.0411.84501.714.066.839.0111.71551.724.086.838.9911.5760 |1.72 |4.09 |6.84 |8.96 |11.452、注意事項(xiàng)測(cè)定pH值時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按儀器的使用說(shuō)明書操作，并注意下列事項(xiàng)。（1）測(cè)定前，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，選擇兩種pH值約相差3個(gè)pH單位的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，并使供試品溶液的pH值處于兩者之間。（2）取與供試品溶液pH值較接近的第一種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液對(duì)儀器進(jìn)行校正（定位），使儀器示值與表列數(shù)值一致。（3）儀器定位后，再用第二種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液核對(duì)儀器示值，誤差應(yīng)不大于±0.02pH單位。若大于此偏差，則應(yīng)小心調(diào)節(jié)斜率，使示值與第二種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的表列數(shù)值相符。重復(fù)上述定位與斜率調(diào)節(jié)操作，至儀器示值與標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的規(guī)定數(shù)值相差不大于0.02pH單位。否則，需檢查儀器或更換電極后，再行校正至符合要求。（4）每次更換標(biāo)準(zhǔn)緩沖液或供試品溶液前，應(yīng)用純化水充分洗滌電極，然后將水吸盡，也可用所換的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液或供試品溶液洗滌。（5）在測(cè)定高pH值的供試品和標(biāo)準(zhǔn)緩沖液時(shí)，應(yīng)注意堿誤差的問(wèn)題，必要時(shí)選用適當(dāng)?shù)牟Ａщ姌O測(cè)定。（6）對(duì)弱緩沖液或無(wú)緩沖作用溶液的pH值測(cè)定，除另有規(guī)定外，先用苯二甲酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正儀器后測(cè)定供試品溶液，并重取供試品溶液再測(cè)，直至pH值的讀數(shù)在1分鐘內(nèi)改變不超過(guò)±0.05止；然后再用硼砂標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正儀器，再如上法測(cè)定；兩次pH值的讀數(shù)相差應(yīng)不超過(guò)0.1，取兩次讀數(shù)的平均值為其pH值。（7）配制標(biāo)準(zhǔn)緩沖液與溶解供試品的水，應(yīng)是新沸過(guò)并放冷的純化水，其pH值應(yīng)為5.5?7.0。（8）標(biāo)準(zhǔn)緩沖液一般可保存2?3個(gè)月，但發(fā)現(xiàn)有渾濁、發(fā)霉或沉淀等現(xiàn)象時(shí)，不能繼續(xù)使用。2010藥典水分灰分測(cè)定方法附錄IXH.水分測(cè)定法測(cè)定用的供試品，一般先破碎成直徑不超過(guò)3mm的顆粒或碎片。直徑和長(zhǎng)度在3mm以下的可不破碎。減壓干燥法需通過(guò)二號(hào)篩。第一法（烘干法）本法適用于不含或少含揮發(fā)性成分的藥品。測(cè)定法取供試品2?5g,平鋪于干燥至恒重的扁形稱瓶中，厚度不超過(guò)5mm,疏松供試品不超過(guò)10mm,精密稱定，打開瓶蓋在100?105c干燥5小時(shí)，將瓶蓋蓋好移置干燥器中，冷卻30分鐘，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時(shí)，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過(guò)5mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量（％）。 第二法（甲苯法）本法適用于含揮發(fā)性成分的藥品。 儀器裝置如圖。A為500ml的短頸圓底燒瓶；B為水分測(cè)定管；C為直形冷凝管，外管長(zhǎng)40cm。使用前，全部?jī)x器應(yīng)清潔，并置烘箱中烘干。測(cè)定法取供試品適量（約相當(dāng)于含水量1?4ml）,精密稱定，置A瓶中，加甲苯約200ml,必要時(shí)加入干燥、潔凈的沸石或玻璃珠數(shù)粒，將儀器各部分連接，自冷凝管頂端加入甲苯，至充滿B管的狹細(xì)部分。將A瓶置電熱套中或用其他適宜方法緩緩加熱，待甲苯開始沸騰時(shí)，調(diào)節(jié)溫度，使每秒鐘餾出2滴。待水分完全餾出，即測(cè)定管刻度部分的水量不再增加時(shí)，將冷凝管內(nèi)部先用甲苯?jīng)_洗，再用飽蘸甲苯的長(zhǎng)刷或其他適宜的方法，將管壁上附著的甲苯推下，繼續(xù)蒸餾5分鐘，放冷至室溫，拆卸裝置，如有水黏附曲管的管壁上，可用蘸甲苯的銅絲推下，放置，使水分與甲苯完全分離（可加亞甲藍(lán)粉末少量，使水染成藍(lán)色，以便分離觀察）。檢讀水量，并計(jì)算供試品中的含水量（％）?！靖阶ⅰ坑没瘜W(xué)純甲苯直接測(cè)定，必要時(shí)甲苯可先加水少量，充分振搖后放置，將水層分離棄去，經(jīng)蒸餾后使用。第三法（減壓干燥法）本法適用于含有揮發(fā)性成分的貴重藥品。 減壓干燥器取直徑12cm左右的培養(yǎng)皿，加入五氧化二磷干燥劑適量，使鋪成0.5?1cm的厚度，放入直徑30cm的減壓干燥器中。測(cè)定法取供試品2?4g,混合均勻,分取約0.5?環(huán)，置已在供試品同樣條件下干燥并稱重的稱量瓶中，精密稱定，打開瓶蓋，放入上述減壓干燥器中，減壓電.67kPa（20mmHg）以下持續(xù)半小時(shí)，室溫放置24小時(shí)。在減壓干燥器出口連接無(wú)水氯化鈣干燥管，打開活塞，待內(nèi)外壓一致，關(guān)閉活塞，打開干燥器，蓋上瓶蓋，取出稱量瓶迅速精密稱定重量，計(jì)算供試品中的含水量（％）。五氧化二磷和無(wú)水氯化鈣為干燥劑，干燥劑應(yīng)及時(shí)更換。第四法（氣相色譜法）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用直徑為0.18?0.25mm的二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子多孔小球作為載體，柱溫為140?150℃,熱導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。注入無(wú)水乙醇，照氣相色譜法（附錄WE）測(cè)定，應(yīng)符合下列要求：（1）理論板數(shù)按水峰計(jì)算應(yīng)大于1000;理論板數(shù)按乙醇峰計(jì)算的應(yīng)大于150。 ⑵水和乙醇兩峰的分離度應(yīng)大于2。⑶將無(wú)水乙醇進(jìn)樣5次，水峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得大于3.0%。標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取純化水約0.2g,置25ml量瓶中，精密稱定，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備取供試品適量（含水量約0.2g）,粉碎或研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇50ml,密塞，混勻，超聲處理20分鐘，放置12小時(shí)，再超聲處理20分鐘，密塞放置，待澄清后傾取上清液，即得。測(cè)定法取無(wú)水乙醇、對(duì)照溶液及供試品溶液各1-5u1,注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得?！靖阶ⅰ浚?）對(duì)照溶液與供試品溶液的配制須用新開啟的同一瓶無(wú)水乙醇。 ⑵用外標(biāo)法計(jì)算供試品中的含水量。計(jì)算時(shí)應(yīng)扣除無(wú)水乙醇中的含水量，方法如下：對(duì)照溶液中實(shí)際加入的水的峰面積=對(duì)照溶液中總水峰面積一KX對(duì)照溶液中乙醇峰面積供試品溶液中水峰面積=供試品溶液中總水峰面積一KX供試品溶液中乙醇峰面積無(wú)水乙醇中水峰面積K- 無(wú)水乙醇中乙醇峰面積附錄區(qū)K.灰分測(cè)定法1.總灰分測(cè)定法測(cè)定用的供試品須粉碎，使能通過(guò)二號(hào)篩，混合均勻后，取供試品2?3g（如須測(cè)定酸不溶性灰分，可取供試品3?5g）,置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量（準(zhǔn)確至0.01g）,緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全炭化時(shí)，逐漸升高溫度至500?600℃,使完全灰化并至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓浚?jì)算供試品中總灰分的含量（％）。如供試品不易灰化，可將坩堝放冷，加熱水或10%硝酸銨溶液2ml,使殘?jiān)鼭駶?rùn)，然后置水浴上蒸干，殘?jiān)涨胺胱?，至坩堝?nèi)容物完全灰化。2酸不溶性灰分測(cè)定法取上項(xiàng)所得的灰分，在坩鍋中小心加入稀鹽酸約10ml,用表面皿覆蓋坩鍋,置水浴上加熱10分鐘，表面皿用熱水5ml沖洗，洗液并入土甘堝中，用無(wú)灰濾紙濾過(guò)，甘堝內(nèi)的殘?jiān)盟从跒V紙上，并洗滌至洗液不顯氯化物反應(yīng)為止。濾渣連同濾紙移置同一甘堝中，干燥，熾灼至恒重。根據(jù)殘?jiān)亓?，?jì)算供試品中酸不溶性灰分的含量（％）。通則2201浸出物測(cè)定法中華人民共和國(guó)藥典2015年版四部2201浸出物測(cè)定法1.水溶性浸出物測(cè)定法測(cè)定用的供試品需粉碎，使能通過(guò)二號(hào)篩，并混合均勻。冷浸法取供試品約4g,精密稱定，置250300ml的錐形瓶中，精密加水100ml,密塞，冷浸，前6小時(shí)內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，再靜置18小時(shí)，用干燥濾器迅速濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20ml,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小時(shí)，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量。除另有規(guī)定外，以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量（％）。熱浸法取供試品約2?4g，精密稱定，置100?250ml的錐形瓶中，精密加水50?100ml，密塞，稱定重量，靜置1小時(shí)后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1小時(shí)。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過(guò)，精密量取濾液25ml,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小時(shí)，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量。除另有規(guī)定外，以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量（%）。2.酵溶性浸出物測(cè)定法照水溶性浸出物測(cè)定法測(cè)定。除另有規(guī)定外，以各品種項(xiàng)下規(guī)定濃度的乙醇代替水為溶劑。3.揮發(fā)性醚浸出物測(cè)定法取供試品（過(guò)四號(hào)篩）2?5g,精密稱定，置五氧化二磷干燥器中干燥12小時(shí)，置索氏提取器中，加乙醚適量，除另有規(guī)定外，加熱回流8小時(shí)，取乙醚液，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，放置，揮去乙醚,殘?jiān)梦逖趸赘稍锲髦懈稍?8小時(shí)，精密稱定，緩緩加熱至105℃,并于105℃；干燥至恒重。其減失重量即為揮發(fā)性醚浸出物的重量。中國(guó)藥典2010版關(guān)于制藥用水第二部中的附錄十六-制藥用水（189頁(yè)），對(duì)純水和注射水的規(guī)定原文如下，水是藥物生產(chǎn)中用量大、使用廣的一種輔料，用于生產(chǎn)過(guò)程及藥物制劑的制備。本版藥典中所收載的制藥用水，因其使用的范圍不同而分為飲用水、純化水、注射用水及滅菌注射用水。一般應(yīng)根據(jù)各生產(chǎn)工序或使用目的與要求選用適宜的制藥用水。藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)確保制藥用水的質(zhì)量符合預(yù)期用途的要求。制藥用水的原水通常為飲用水。制藥用水的制備從系統(tǒng)設(shè)計(jì)、材質(zhì)選擇、制備過(guò)程、貯存、分配和使用均應(yīng)符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的要求。制水系統(tǒng)應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，并建立日常監(jiān)控、檢測(cè)和報(bào)告制度，有完善的原始記錄備查。制藥用水系統(tǒng)應(yīng)定期進(jìn)行清洗與消毒，消毒可以采用熱處理或化學(xué)處理等方法。采用的消毒方法以及化學(xué)處理后清毒劑的去除應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證。飲用水為天然水經(jīng)凈化處理所得的水，其質(zhì)量必須符合現(xiàn)行中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》。飲用水可作為藥材凈制時(shí)的漂洗、制藥用具的粗洗用水。除另有規(guī)定外，也可作為飲片的提取溶劑。純化水為飲用水經(jīng)蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制備的制藥用水。不含任何附加劑，其質(zhì)量應(yīng)符合純化水項(xiàng)下的規(guī)定。純化水可作為配制普通藥物制劑用的溶劑或試驗(yàn)用水；可作為中藥注射劑、滴眼劑等滅菌制劑所用飲片的提取溶劑；口服、外用制劑配制用溶劑或稀釋劑；非滅菌制劑用器具的精洗用水。也用作非滅菌制劑所用飲片的提取溶劑。純化水不得用于注射劑的配制與稀釋。純化水有多種制備方法，應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)測(cè)各生產(chǎn)環(huán)節(jié)，防止微生物污染，確保使用點(diǎn)的水質(zhì)。注射用水為純化水經(jīng)蒸餾所得的水，應(yīng)符合細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)要求。注射用水必須在防止細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生的設(shè)計(jì)條件下生產(chǎn)、貯藏與分裝。其質(zhì)量應(yīng)符合注射用水項(xiàng)下的規(guī)定。注射用水可作為配制注射劑、滴眼劑等的溶劑或稀釋劑及容器的精洗。為保證注射用水的質(zhì)量，應(yīng)減少原水中的細(xì)菌內(nèi)毒素，監(jiān)控蒸餾法制備注射用水的各生產(chǎn)環(huán)節(jié)，并防止微生物的污染。應(yīng)定期清洗與消毒注射用水系統(tǒng)。注射用水的儲(chǔ)存方式和靜態(tài)儲(chǔ)存期限應(yīng)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證確保水質(zhì)符合質(zhì)量要求，例如可以在80℃以上保溫或70℃以上保溫循環(huán)或4℃以下的狀態(tài)下存放。滅菌注射用水為注射用水按照注射劑生產(chǎn)工藝制備所得。不含任何添加劑。主要用于注射用滅菌粉末的溶劑或注射劑的稀釋劑。其質(zhì)量應(yīng)符合滅菌注射用水項(xiàng)下的規(guī)定。滅菌注射用水灌裝規(guī)格應(yīng)適應(yīng)臨床需要，避免大規(guī)格、多次使用造成的污染。表1溫度和電導(dǎo)率的限制（純化水表空吉林省華通制藥設(shè)備有限公司純水的電導(dǎo)率符合上表的要求，性狀:無(wú)色的澄清液體;無(wú)臭，無(wú)味?？傆袡C(jī)碳不得過(guò)0.50mg/L，易氧化物和總有機(jī)碳兩項(xiàng)可選做一項(xiàng)。注射用水的電導(dǎo)率符合上表的要求，性狀：無(wú)色的澄明液體；無(wú)臭，無(wú)味。PH值為5~7，總有機(jī)碳不得過(guò)0.50mg/L，細(xì)菌內(nèi)毒素小于0.25EU/ml，菌落數(shù)每100ml小于10個(gè)。2015版中國(guó)藥典純化水標(biāo)準(zhǔn)純化水ChunhuashuiPurifiedWaterH2O18.02本品為飲用水經(jīng)蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的制藥用水，不含任何添加劑?！拘誀睢勘酒窞闊o(wú)色的澄清液體；無(wú)臭。【檢查】酸堿度取本品10ml,加甲基紅指示液2滴，不得顯紅色；另取10ml,加澳麝香草酚藍(lán)指示液5滴，不得顯藍(lán)色。硝酸鹽取本品5ml置試管中，于冰浴中冷卻，加10%氯化鉀溶液0.4ml與0.1%二苯胺硫酸溶液0.1ml,搖勻，緩緩滴加硫酸5ml,搖勻，將試管于50°C水浴中放置15分鐘，溶液產(chǎn)生的藍(lán)色與標(biāo)準(zhǔn)硝酸鹽溶液［取硝酸鉀0.163g,加水溶解并稀釋至100ml,搖勻，精密量取1ml,加水稀釋成100ml,再精密量取10ml,加水稀釋成100ml,搖勻，即得（每lml相當(dāng)于1噸NO3）］0.3ml,加無(wú)硝酸鹽的水4.7ml,用同一方法處理后純化水的顏色比較，不得更深（0.000006%）o亞硝酸鹽取本品10ml,置納氏管中，加對(duì)氨基苯磺酰胺的稀鹽酸溶液（1-100）1ml與鹽酸萘乙二胺溶液（0.1—100）ml,產(chǎn)生的粉紅色，與標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽溶液［取亞硝酸鈉0.750g（按干燥品計(jì)算），加水溶解，稀釋至100ml,搖勻，精密量取1ml,加水稀釋成100ml,搖勻，再精密量取1ml,加水稀釋成50ml,搖勻，即得（每1ml相當(dāng)于1叫NO2）］0.2ml,加無(wú)亞硝酸鹽的水9.8ml,用同一方法處理后的顏色比較，不得更深（0.000002%）。氨取本品50ml,加堿性碘化汞鉀試液2ml,放置15分鐘；如顯色，與氯化銨溶液（取氯化銨31.5mg,加無(wú)氨水適量使溶解并稀釋成1000ml）1.5ml,加無(wú)氨水48ml與堿性碘化汞鉀試液2ml制成的對(duì)照液比較，不得更深（0.00003%）。電導(dǎo)率應(yīng)符合規(guī)定（通則0681）?？傆袡C(jī)碳不得過(guò)0.50mg/L（通則0682）。易氧化物取本品100ml,加稀硫酸10ml,煮沸后，加高鎰酸鉀滴定液（0.02mol/L）0.1ml,再煮沸10分鐘，粉紅色不得完全消失。以上總有機(jī)碳和易氧化物兩項(xiàng)可選做一項(xiàng)。不揮發(fā)物取本品100ml，置105℃恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，并在105°C干燥至恒重，遺留殘?jiān)坏眠^(guò)1mg。重金屬取本品100ml加水19ml，蒸發(fā)至20ml，放冷，加醋酸鹽緩沖液（pH3.5）2ml與水適量使成25ml,加硫代乙酰胺試液2ml，搖勻，放置2分鐘，與標(biāo)準(zhǔn)鉛溶液1.0ml加水19ml用同一方法處理后的顏色比較，不得更深（0.00001%）。微生物限度取本品不少于1ml，經(jīng)薄膜過(guò)濾法處理，采用R2A瓊脂培養(yǎng)基，30?35°C培養(yǎng)不少于5天，依法檢查（通則1105），1ml供試品中需氧菌總數(shù)不得過(guò)lOOcfu。R2A瓊脂培養(yǎng)基處方及制備酵母浸出粉0.5g蛋白胨0.5g酪蛋白水解物0.5g葡萄糖0.5g可溶性淀粉0.5g磷酸氫二鉀0.3g無(wú)水硫酸鎂0.024g丙酮酸鈉0.3g瓊脂15g純化水1000ml除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使加熱后在25°C的pH值為7.2±0.2,加人瓊脂，加熱溶化后，再加人葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。R2A瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn)照非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）中“計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查”的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基的適用性檢查方法進(jìn)行，試驗(yàn)菌株為銅綠假單胞菌和枯草芽抱桿菌。應(yīng)符合規(guī)定。注射用水ZhusheyongShuiWaterforInjection本品為純化水經(jīng)蒸餾所得的水.【性狀】本品為無(wú)色的澄明液體；無(wú)臭，無(wú)味?！緳z查】pH值取本品100ml，加飽和氯化鉀溶液0.3ml，依法測(cè)定（附錄WH），pH值應(yīng)為5.0~7.0o氨取本品50ml，照純化水項(xiàng)下的方法檢查，但對(duì)照用氯化銨溶液改為1.0ml，應(yīng)符合規(guī)定（0.00002%）o硝酸鹽與亞硝酸鹽、電導(dǎo)率、總有機(jī)碳、不揮發(fā)物與重金屬照純化水項(xiàng)下的方法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。細(xì)菌內(nèi)毒素取本品，依法檢查（附錄XIE），每1ml中含內(nèi)毒素量應(yīng)小于0.25EU。微生物限度取本品至少200ml，采用薄膜過(guò)濾法處理后，依法檢查（附錄XJ），細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)每100ml不得超過(guò)10個(gè)?！绢悇e】溶劑。【貯藏】密閉保存。擇自《中華人民共和國(guó)藥典2010年版二部》滅菌注射用水MiejunZhusheyongShuiSteruleWaterforInjection本品為注射用水照注射劑生產(chǎn)工藝制備所得。【性狀】本品為無(wú)色的澄明液體；無(wú)臭，無(wú)味?！緳z查】pH值取本品100ml，加飽和氯化鉀溶液0.3ml，依法測(cè)定（附錄WH），pH值應(yīng)為5.0~7.0。氯化物、硫酸鹽與鈣鹽取本品，分置三支試管中，每管各50ml，第一管中加硝酸5滴與硝酸銀試液1ml，第二管中加氯化鋇試液5ml，第三管中加草酸銨試液2ml，均不得發(fā)生渾濁。二氯化碳取本品25ml，置50ml具塞量筒中，加氫氧化鈣試液25ml，密塞振搖，放置，1小時(shí)內(nèi)不得發(fā)生渾濁。易氧化物取本品100ml，加稀硫酸10ml，煮沸后，加高鎰酸鉀滴定液（0.02mol/L）0.10ml，再煮沸10分鐘，粉紅色不得完全消失。硝酸鹽與亞硝酸鹽、氨、電導(dǎo)率、不揮發(fā)物、重金屬與細(xì)菌內(nèi)毒素照注射用水項(xiàng)下的方法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。其他應(yīng)符合注射劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定(附錄IB)?！绢悇e】溶劑、沖洗劑?！疽?guī)格】(1)1ml(2)2ml(3)3ml(4)5ml(5)10ml(6)20ml(7)50ml(8)500ml(9)1000ml(10)3000ml(沖洗用)【貯藏】密閉保存。擇自《中華人民共和國(guó)藥典2010年版二部》微生物限度檢查操作規(guī)程(中國(guó)藥典2015版四部通則)一、范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物限度的檢查方法和操作要求；適用于檢品需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、控制菌的檢查。二、引用標(biāo)準(zhǔn):《中國(guó)藥典》2015年版(通則1105-1106)三、目錄1.微生物限度標(biāo)準(zhǔn)2.設(shè)備、儀器及用具3.消毒液、稀釋劑、試液及培養(yǎng)基4.檢查總則(通則1105：非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法，通則1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法)5.微生物計(jì)數(shù)法檢查6.控制菌檢查法7.實(shí)驗(yàn)技術(shù) 8.附件1.微生物限度標(biāo)準(zhǔn)非無(wú)菌藥用原料及輔料的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)需氧菌總數(shù)(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)(cfu/g或cfu/ml)控制菌藥用原料及輔料103102**未做統(tǒng)一規(guī)定。1.1成品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)品名法定標(biāo)有內(nèi)控標(biāo)造需氧菌總數(shù)(cfll/E或cfu/nl)亮菌和酵母菌總數(shù)匕fWg或cfu/ml)控制菌需氧菌總數(shù)(cfu/g或cfu/nLj霉菌和酵母菌總數(shù)仁如也或cfu/mlj控制菌大腸埃希菌沙門菌大腸埃二rC-H-而閨沙門菌乳糖1000■-100無(wú)^100/50水糖無(wú)乳■■.■'10010—/10g/--00&W100.10一.110g/100g蔗糖無(wú)無(wú)上上-.100--<50⑴「一”為不得檢出。(2).門測(cè)零變者以不合格論，0).?無(wú)”為標(biāo)推依據(jù)或無(wú)相應(yīng)規(guī)定標(biāo)題微生物限度檢查操作規(guī)程編瑪；KF-SOP-0713-2共19頁(yè) 第2頁(yè)1.2工藝用水微生物限度標(biāo)準(zhǔn)口口 名法定標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)需氧菌思數(shù)（cfd'mD控制菌C.^'/lOOmLmcCFU/100mL)需氧菌忌數(shù)（cfivnil）控制菌(AIPX/100mL^,CFJ.100mL)?；畛烙盟甒100不得檢出；1001不得檢出純化水4100不得檢出二3。不*導(dǎo)檢出13內(nèi)三裝材料微生物限度標(biāo)準(zhǔn)品 名（單位）需氧菌總數(shù)毒菌和酵母菌總數(shù)控制菌需氫菌總數(shù)母菌忌數(shù)控制菌藥用聚乙烯燃塑料袋（100cm2）^lOOOcfiiLOOcfu—<lOOctiiW.lOcfii—說(shuō)明：1.為每1005rl中不得檢出.2.目測(cè)霉變者以不合格論。3「無(wú)”為標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)或無(wú)相應(yīng)規(guī)定口2.設(shè)施、儀器及用具設(shè)施：微生物限度檢查室及相關(guān)設(shè)施：微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)環(huán)境應(yīng)符合微生物限度檢查的要求。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。2.1.2.其他設(shè)備：高壓蒸汽滅菌器；細(xì)菌培養(yǎng)箱（30~35℃）；霉菌培養(yǎng)箱（25~28℃）；電爐（或其他適宜的加熱裝置）；恒溫水??；電熱干燥箱（250~300℃）；電冰箱。生化試劑儲(chǔ)存箱。2.2儀器及器皿菌落計(jì)數(shù)器；顯微鏡（1500X）；電子天平或藥物天平（感量0.1g）；pH系列比色計(jì)。玻璃器皿：錐形瓶（250~300ml,內(nèi)裝玻璃珠若干）、研缽（玻璃或陶瓷制，010~12cm）、培養(yǎng)皿（09cm）、量筒（100ml）、試管（18X180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01,10ml分度0.1）、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）。購(gòu)的玻璃器皿的清潔：先用流水沖洗，浸泡于1%~2%鹽酸（工業(yè)用）液中約2~6小時(shí)，除去游離堿質(zhì)，再用流水沖洗。用于化學(xué)分析的玻璃儀器，需用重銘酸鉀清潔液浸泡數(shù)分鐘后，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗2~3次，晾干備用。2.3用過(guò)的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可隨時(shí)洗滌。用清水沖洗（或浸泡）除容量?jī)x器外，可用毛刷和肥皂粉，內(nèi)外刷洗，再用清水涮洗干凈，晾干備用。容量?jī)x器宜用清潔液浸泡或涮洗，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗2~3次。.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先經(jīng)過(guò)滅菌處理后再按常法洗滌。試管及培養(yǎng)皿：先正放或直立于高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，經(jīng)121c滅菌30分鐘。趁熱傾出培養(yǎng)物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮凈。吸管：全部直立浸沒(méi)于清潔液的長(zhǎng)筒形容器中，筒底應(yīng)襯有棉或橡皮墊，以防管尖損壞。24小時(shí)后，逐支用流水反復(fù)沖洗潔凈，晾干后包扎滅菌備用。載、蓋玻片：應(yīng)分別浸泡于清潔液12~24小時(shí)后，取出用流水沖洗，再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸鈉液內(nèi)煮沸10~15分鐘，待自然冷卻后，再用流水沖洗。瀝干后置95%乙醇中浸泡，晾干備用。2,3,3玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)，尚需用玻璃紙包裹瓶塞（以免振蕩時(shí)供試液污染瓶塞），再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160c干熱滅菌2小時(shí)或高壓蒸汽121c滅菌30分鐘，烘干備用。2.4用具2.4.1大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。2.4.2無(wú)菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可用一次性無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。2.4.3接種環(huán)（白銥金或銀銘合金，環(huán)徑4~5mm、長(zhǎng)度6~10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋12cm）、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。3消毒液、稀釋劑、試液及培養(yǎng)基3.1消毒液、稀釋劑及試液。0.1%苯扎澳銨溶液：供洗手、擦拭操作臺(tái)面用。5%石碳酸溶液：配制后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用，抑或選用其他適宜消毒液。75%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液：取氯化鈉9.0g,加水使溶解成1000ml,121℃滅菌20分鐘。司盤-80、單硬脂酸甘油酯、吐溫80：供非水溶性供試品供試液制備用。3.1.6.無(wú)菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g,加水使溶解成10ml。甲基紅指示液:取甲基紅0.1g,加入95%乙醇300ml,水適量，使溶解，再加水至500ml。V-P試液：①氫氧化鉀試液：取氫氧化鉀40.0g,加水使溶解成100ml；②a-萘酚乙醇試液：取a-萘酚6.0g,加無(wú)水乙醇使溶解成100ml。革蘭染色液：①沙黃染液：取沙黃0.25g,加95%的乙醇10ml,使完全溶解后，加水至100ml；②結(jié)晶紫染液：取結(jié)晶紫1.0g,加95%的乙醇20ml,使溶解，加1%的草酸銨溶液80ml,混勻。靜置48小時(shí)使用，置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存；③碘試液：取碘化鉀2.0g,加水3~5ml使溶解，加入碘片1.0g,使全部溶解后，加水稀釋至300ml,置密閉棕色瓶中儲(chǔ)存。3.1.10.中性紅指示液：取中性紅1.0g,研細(xì)，力口95%乙醇60ml,使溶解，再加水到100ml。變色范圍pH6.8~8.0（紅f黃）。亞甲藍(lán)指示液：取亞甲藍(lán)0.5g,加水使溶解成100ml。澳麝香草酚藍(lán)指示液：取澳麝香草酚藍(lán)0.4g,加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.0~7.6（黃f藍(lán)）。酸性品紅指示液：以酸性品紅0.5g,加水100ml使溶解，再逐漸加1mol/L氫氧化鈉溶液16ml,每加1滴均應(yīng)將溶液充分搖勻后再加第二滴，直至溶液呈草黃色；于沸水內(nèi)保持15分鐘，再靜置2小時(shí)，濾過(guò)，即得。優(yōu)點(diǎn)：無(wú)色，在倒管內(nèi)早期發(fā)酵易觀察，不易被還原。變色范圍pH6.0~7.4（紅f黃）。曙紅鈉指示液：取曙紅鈉2.0g,加水使溶解成100ml。靛基質(zhì)試液：取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.08，加入95%乙醇95ml,充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，置冰箱保存，備用。3.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備及儲(chǔ)存溶化：一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷器內(nèi)。加入純化水，隔水加熱以促其溶解，加熱時(shí)應(yīng)經(jīng)常攪拌，防止焦結(jié)，待其溶解后補(bǔ)足水分。在使用干燥培養(yǎng)基時(shí)，先將純化水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中，靜置10~15分鐘，攪拌，振蕩，或延長(zhǎng)時(shí)間以促進(jìn)溶解，一般不要加熱，必要時(shí)加熱，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，溫度不宜過(guò)高，避免某些營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。校正酸堿度：培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H值。測(cè)定pH值是培養(yǎng)基配制過(guò)程中的重要步驟之一，干燥培養(yǎng)基一般已校正過(guò)pH值，用時(shí)也必須再驗(yàn)證。pH值測(cè)定時(shí)，一般用指示劑滴入培養(yǎng)基中觀察其顏色的變化，或用pH計(jì)校正，如與所需pH值不符，可用酸或堿液加以校正。一般用氫氧化鈉校正的弱堿性培養(yǎng)基，高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH值高0.2左右，滅菌后基本合適。調(diào)整pH值后要加熱過(guò)濾，使培養(yǎng)基澄清。3.2.2培養(yǎng)基的分裝：.1液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅菌前分裝，約裝試管容積的1/3,在滅菌后還要加入成分的液體、半固體培養(yǎng)基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。.2固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。平皿:如傾注平皿，應(yīng)在無(wú)菌室中放置3?4小時(shí)，如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱中倒置30?60分鐘。水蒸氣會(huì)自然蒸發(fā)。斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積的1/5,滅菌后趁熱斜放于細(xì)玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝時(shí)注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基，避免污染。制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3,滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應(yīng)用。3.2.3培養(yǎng)基的滅菌：培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和壓力，按其成分不同而定。普通培養(yǎng)基多采用121℃、103.42kPa滅菌15分鐘，但容器和裝量較大時(shí)，可延長(zhǎng)至20分鐘。高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內(nèi)的冷空氣，再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時(shí)間，達(dá)到全殺滅微生物的目的。培養(yǎng)基的儲(chǔ)存：保存培養(yǎng)基的時(shí)間需視培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)的程度及有無(wú)污染而定，已制備好培養(yǎng)基要保存于冷暗處或冰箱中，但由于各種培養(yǎng)基的性質(zhì)不同，不可能固定一個(gè)保存期限。制備好的平板或試管培養(yǎng)基，為防止水分蒸發(fā)，應(yīng)置于塑料袋內(nèi)，4c保存，可延長(zhǎng)使用期限。微量生化反應(yīng)管熔封于細(xì)玻管內(nèi)，室溫下可保存1年左右。3.3注意事項(xiàng)：3.3.1采用干燥培養(yǎng)基時(shí)，按說(shuō)明配制，應(yīng)對(duì)滅菌后的培養(yǎng)基pH值進(jìn)行校驗(yàn)。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測(cè)定，以確定配制時(shí)瓊脂的用量。試劑規(guī)格要求應(yīng)為化學(xué)純(CP)以上規(guī)格，其中不能含有對(duì)細(xì)菌、霉菌、大腸桿菌生長(zhǎng)有害的抑制物。3.3.2配制的培養(yǎng)基不應(yīng)該有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過(guò)濾，并應(yīng)于2小時(shí)內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。培養(yǎng)基的分裝量不得超過(guò)容器的2/3,以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落造成染菌。配制培養(yǎng)基的pH值測(cè)定時(shí)，其波動(dòng)范圍應(yīng)在規(guī)定的pH±0.2之內(nèi)，還需注意高壓滅菌后的pH值變化。每批培養(yǎng)基均應(yīng)有配制記錄，包括名稱、配制量(各種成分用量)、配制者、校對(duì)者、配制日期以及性能和無(wú)菌試驗(yàn)。每批培養(yǎng)基在用于樣品的分離鑒定之前均應(yīng)作性能試驗(yàn)，以保證微生物檢驗(yàn)的質(zhì)量。性能試驗(yàn)須用已知標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行預(yù)試，符合要求方可應(yīng)用。棉塞以普通棉花制作，棉塞松緊應(yīng)適宜，過(guò)松易污染雜菌，過(guò)緊影響透氣性；每次用后需高壓滅菌并隨即烘干，要防塵、防霉；變硬無(wú)彈力時(shí)需更換。各種試管應(yīng)先配上合適的棉塞，待高壓滅菌后再分裝培養(yǎng)基，可防止污染。培養(yǎng)基配制時(shí)，應(yīng)先將有沉淀物的原料如蛋白胨、牛肉膏、鹽類和瓊脂配好，經(jīng)調(diào)節(jié)pH值、加熱并煮沸溶化后再濾清；濾清時(shí)注意趁熱過(guò)濾，濾除異物、沉淀后，應(yīng)將蒸發(fā)失去的溶液量按原溶液量加純化水補(bǔ)足。應(yīng)嚴(yán)格遵守各種培養(yǎng)基規(guī)定的滅菌溫度和時(shí)間，滅菌后培養(yǎng)基不得有混濁現(xiàn)象，每瓶配制并滅菌后的培養(yǎng)基、稀釋劑均應(yīng)在外表清楚標(biāo)明滅菌日期。3.3.11每批稀釋劑、培養(yǎng)基均應(yīng)有空白試驗(yàn)，合格后方能使用。滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存，放置時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，一般在兩周內(nèi)用完。久存培養(yǎng)基失水過(guò)多、固體干涸變形、液體出現(xiàn)沉淀、棉塞松弛或脫落者均不得使用。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，開啟后不宜再用。勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營(yíng)養(yǎng)成份過(guò)度受熱而破壞，應(yīng)用水浴或微波爐加熱。4.檢查總則（1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法）微生物計(jì)數(shù)法適用范圍：系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不適用于活菌制劑的檢查。如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。微生物計(jì)數(shù)法適用性試驗(yàn)用菌株（表1）試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌液的制備計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母度總數(shù)計(jì)數(shù)菌總數(shù)計(jì)數(shù)霉菌和酵母菌苞數(shù)計(jì)數(shù)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaiireus)CCMCC(B)26003)凄酹大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或胰酷大二腺液體培養(yǎng)基培介i—反30-35C,二二券E間18-24小時(shí)胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基和胰酷大豆睞液體培養(yǎng)基■培養(yǎng)溫度30-35r培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3氤接種量不大tlOOcfu胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或犢酪大二陳液體培養(yǎng)基（MPN法L培養(yǎng)溫度30-35培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3天，接種量不7ZTlOOcfu七色念珠沙氏葡荽精胰酪大豆膝浣沙氐匍含糖胰酷大片陳瓊沙氏葡萄精菌瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基，培瓊齊培?帛脂土日寸"基''xM-N瓊脂培帛(Candids或沙氏前意養(yǎng)溫度基,培養(yǎng)血法不適用）培基，不"imalbic&ns糖液體培養(yǎng)30-35七培養(yǎng)度2025℃養(yǎng)溫度30-3度20-25℃)基.培養(yǎng)溫度時(shí)間不超過(guò)5培養(yǎng)時(shí)間不匚口「 ?。ぁ?LjImr4尸培養(yǎng)時(shí)間不CCMCC(F)20-25匕培養(yǎng)天,接種量不超.i'15時(shí)間不超過(guò)3超過(guò)j大,98001時(shí)間2-3天大于lOOcfu接種量不大于lOOcfil天，接種量不大于lOOcfu接種量不大干100c-u

銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaCCMCC(B)10104胰酪大豆陳瓊脂培技基或胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基?培養(yǎng)溫度30-35V,培養(yǎng)時(shí)間is-24小時(shí)摸酷大豆陳瓊脂培養(yǎng)基和膜酪大豆陳液體培養(yǎng)基.培養(yǎng)溫度30.35C士口養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3天，接種量不大于1OOcfu胰酪大巳陳瓊脂培養(yǎng)基或腹酪大豆陳液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度30-35℃,培養(yǎng)酎間不超-3接種量不大于1OOcfu枯草芽抱桿菌Bad11us<ubtil16(CMCCtB)63501胰酪大豆族瓊脂培養(yǎng)共或胰酪7；五陳液體培養(yǎng)基.培養(yǎng)溫度30-35V培養(yǎng)時(shí)間12-24小時(shí)胰酷大豆陳瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆陳液體培養(yǎng)甚，培養(yǎng)溫度3,35七培養(yǎng)燈1日」小超過(guò)3天,接種量不大于1OOcfu胰酪大巳陳加脂培養(yǎng)甚或胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基PN法），培養(yǎng)溫度30-35匕.培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)3天，接種量不大于1OOcfu黑曲霉沙氏葡萄糖胰酪大豆陳瓊沙氏匍曲骷胰酷大豆陳瓊沙氏前曲糖(Asper君瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基，培瓊脂培養(yǎng)脂培養(yǎng)基無(wú)脂培養(yǎng)山WK或馬鈴署葡養(yǎng)遢度耳粒豐汨t，口才卜UEL法不適用）培甘母羊；日-?！觥觥?Jp寸|"-.n"i閑gerjCC萄糖瓊脂培30-35七培養(yǎng)度20-25r養(yǎng)溫度度20-25℃MCC(F)養(yǎng)甚,培養(yǎng)溫時(shí)間不超過(guò)5培養(yǎng)時(shí)間不3Oa5C培養(yǎng)培養(yǎng)歸同不98003)度20-25r天，接種量不超過(guò)5天,時(shí)間.不超過(guò)5趣立5天,匚空時(shí)間j一7天，或直到獲得蘭富的抱于大「lOOcfu接種量不大J-lOOcfu天,，接種量不大于ICKkFu接種遠(yuǎn)不大JlOOcfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，檢查方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。計(jì)數(shù)方法：包括平皿法、薄膜過(guò)濾法和最可能數(shù)法（Most-Probable-NumberMethod,簡(jiǎn)稱MPN法）。MPN法用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法可能是更適合的方法。供試品檢查時(shí)，應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，檢測(cè)的樣品量應(yīng)能保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。菌種及菌液制備菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。4.2.3.2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見(jiàn)（表1）。菌液制備按（表1）規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加人3?5ml含0.05%（ml/m1）聚山梨酯80的pH7_0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出抱子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%（m1/m1）聚山梨酯80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉抱子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2?8℃，可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉抱子懸液可保存在2?8℃,在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。4.2.4陰性對(duì)照為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。4.2.5培養(yǎng)基適用性檢查微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。按（表1）規(guī)定，接種不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。4.3計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)4.3.1供試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過(guò)45℃。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過(guò)1小時(shí)。常用的供試液制備方法如下（如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立其他適宜的方法）水溶性供試品取供試品，用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。水不溶性非油脂類供試品取供試品，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成1:10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加人表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。4.3.1.3油脂類供試品取供試品，加人無(wú)菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無(wú)菌聚山梨酯80或其他無(wú)抑菌性的無(wú)菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過(guò)40t：（特殊情況下，最多不超過(guò)45℃）,小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加人預(yù)熱的稀釋液使成1:10供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。4.3.1.4需用特殊方法制備供試液的供試品膜劑供試品取供試品，剪碎，加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成1:10的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品，加人PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或PH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置45℃水浴中，振搖，使溶解，制成1:10的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。氣霧劑、噴霧劑供試品取供試品，置一20°C或其他適宜溫度冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。供試品亦可采用其他適宜的方法取出。用無(wú)菌注射器從每一容器中吸出藥液于無(wú)菌容器中混合，然后取樣檢查。貼劑供試品取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無(wú)菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無(wú)菌多孔材料（如無(wú)菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少30分鐘。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。4.3.2.接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。試驗(yàn)組取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每lml供試液或每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含菌量不大于IQQcfUo供試品對(duì)照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作加人試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o(wú)法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加人試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。4.4抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)值的50%,可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表2）可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無(wú)毒性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。表2常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法皮二醛、汞剖劑酚類、乙醇、醛類、醛類季晶化合物、對(duì)羥基苯甲酸，雙麻類化合物益鉉化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸水銀水銀、汞化物、醛類EDTA、唆哈胴類抗生素磺胺類?內(nèi)酰胺類抗生素江硫酸氫鈉吸附物稀釋法甘氨酸卵璘脂聚山梨酯部基醋酸主硫代硫酸赴鎂或鈣離廣對(duì)氨基苯甲酸P內(nèi)酰胺酶采用薄膜過(guò)濾法人上述幾種方法的聯(lián)合使用。若沒(méi)有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對(duì)該試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對(duì)特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒(méi)有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢查。4.5供試品中微生物的回收表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過(guò)濾法或MPN法。平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。表1中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。傾注法：取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液lml，置直徑90mm的無(wú)菌平皿中，注入15?20ml溫度不超過(guò)45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。涂布法：取15?20ml溫度不超過(guò)45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注人直徑90mm的無(wú)菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45pm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對(duì)微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml。總沖洗量不得超過(guò)1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于lg、lml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過(guò)濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。MPN法MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過(guò)濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒(méi)有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若使用MPN法，按下列步驟進(jìn)行。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取3份lml分別接種至3管裝有9?10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置30?35°C培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長(zhǎng)情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)1?2天，觀察是否有微生物生長(zhǎng)。根據(jù)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)從表3查被測(cè)供試品每lg或每lml中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。表3微生物最可能數(shù)檢索表

生長(zhǎng)管數(shù)需氧菌總數(shù)最可能數(shù)95%置信限每管含樣品的蕓或m數(shù)MP5或m卜限上限0.10.010.001000<309.4001309.701030.110011也11.217Q206.21.2170309.43.5351003.60.21710117.21.2171021143511107.41.320111114351201143512115538130一16-5382QQ9,2LX35201144352022053S210154382112053821227994220215402212S994222359942302999423136994300235943013呂9104302&4161813104391813117517190312120303603131603。38032093183603一1150 -303803口一22103040032329。909903302409099033146090198033211002004000333-1100注：表內(nèi)所列檢驗(yàn)量如改用lg（或ml）、0.lg（或ml）和O.Olg（或ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用O.Olg（或ml）、O.OOlg（或ml）和O.OOOlg（或ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍，其余類推。5.微生物計(jì)數(shù)法檢查5.1計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)；采用MPN法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。5.2供試品檢查檢驗(yàn)量：檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm2）。一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進(jìn)行檢驗(yàn)。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml;膜劑為100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。供試品的檢查按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù);沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)陰性對(duì)照試驗(yàn)以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。5.3平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在30?35°C培養(yǎng)3?5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20?25°C培養(yǎng)5?7天，觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15,則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于lOOcfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，算lg、lml或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位4效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。5.4薄膜過(guò)濾法除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于lg、lml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過(guò)濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過(guò)lOOcfu菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相當(dāng)于lg、lml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以＜1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾lg、lml或10cm2供試品），或＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。5.5MPN法取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有試驗(yàn)管在30?35X：培養(yǎng)3?5天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長(zhǎng)，按方法適用性試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)，從表3查每lg或lml供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。5.6結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素(如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基(如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基)進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用MPN法，測(cè)定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：lOcfu：可接受的最大菌數(shù)為20;102cfu：可接受的最大菌數(shù)為200;103cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000,依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。6.控制菌檢查法(非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度：控制菌檢查法)控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等人供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。6.1.2供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求同“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度6.1.3檢查：微生物計(jì)數(shù)法(通則1105)”。如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí)，若使用了中和劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。6.2培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法6.2.1適用性試驗(yàn)供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的控制菌檢查方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，控制菌檢查方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試驗(yàn)。菌種及菌液制備菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代(從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代)，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CCMCC(B)26003 〕 銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)￡CMCC(B)10104 〕大腸埃希菌(EsdieWchacoa)CCMCC(B)44102〕乙型副傷寒沙門菌(SalmonellaparatyphiB)CCMCC(B)50094〕白色念珠菌(canidiaAlbicans)CCMCC(F)98001〕生抱梭菌(Clostridiumsporogenes)CCMCC(B)64941〕菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30?35°C培養(yǎng)18?24小時(shí)；將白色念珠