DNA重組技術(shù)的工具

DNA重組技術(shù)的基本工具專(zhuān)題1-1怪物1怪物2怪物3怪物4思考：以上這些構(gòu)想，傳統(tǒng)的育種方法能否實(shí)現(xiàn)？這就要用到定向改造生物的新技術(shù)

——基因工程基因工程：又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說(shuō)，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來(lái)，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳性狀。操作對(duì)象：操作水平：結(jié)果：DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)分子水平基因重組操作環(huán)境：主要技術(shù)：原理（變異類(lèi)型）人類(lèi)需要的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品基因生物體外蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲(chóng)害的抗蟲(chóng)棉。

蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉為什么能把蘇云金芽孢桿菌的基因“嫁接”到棉花上并成功表達(dá)？1、所有生物的的DNA都是以4種脫氧核苷酸為基本單位，構(gòu)成獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這為不同生物DNA拼接提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。2、地球上的所有生物共用一套遺傳密碼。基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因棉花細(xì)胞(含抗蟲(chóng)基因)棉花植株(有抗蟲(chóng)特性)重組DNA導(dǎo)入形成基因工工程培培育抗抗蟲(chóng)棉棉的關(guān)關(guān)鍵步步驟：：關(guān)鍵步步驟一一：抗蟲(chóng)基基因從從蘇云云金芽芽孢桿桿菌細(xì)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)提取出出來(lái)關(guān)鍵步步驟二二：抗蟲(chóng)基基因與運(yùn)載載體DNA“縫合””關(guān)鍵步步驟三三：抗蟲(chóng)基基因進(jìn)入棉棉花細(xì)細(xì)胞解決培培育抗抗蟲(chóng)棉棉的關(guān)關(guān)鍵步步驟需需要哪哪些工工具？？“分子手手術(shù)刀刀”——限制性性核酸酸內(nèi)切切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫縫合針針”——DNA連接酶酶“分子運(yùn)運(yùn)輸車(chē)車(chē)”——基因進(jìn)進(jìn)入受受體細(xì)細(xì)胞的的載體1.1、DNA重組技技術(shù)的的基本本工具具一、““分子子手術(shù)術(shù)刀””———限制制性核核酸內(nèi)內(nèi)切酶酶（簡(jiǎn)稱(chēng)稱(chēng)限制酶酶）原核生生物這類(lèi)酶酶存在在于原原核生生物中中有什什么作作用呢呢？1、主要要來(lái)源源：原核生生物容容易受受到自自然界界外源源DNA的入侵侵，限限制酶酶是一一種防防御工工具，，當(dāng)外外源DNA侵入時(shí)時(shí)，會(huì)會(huì)利用用限制制酶將將外源源DNA切割掉掉，使使之失失效，，保證證自身身的安安全。。為什么么細(xì)菌菌中限限制酶酶不剪剪切細(xì)細(xì)菌本本身的的DNA？即一種種限制制酶只只能識(shí)識(shí)別一一種特特定的的核苷苷酸序序列，，并且且能在在特定定的切切點(diǎn)上上切割割DNA分子。。3、作用用機(jī)制制：4000種。2、種類(lèi)類(lèi)：因?yàn)楹心衬撤N限限制酶酶的細(xì)細(xì)胞，，其DNA分子中中或不不具備備這種種限制制酶的的識(shí)別別序列列，或或通過(guò)過(guò)甲基基化酶酶將甲甲基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到到所識(shí)識(shí)別序序列的的堿基基上，，使限限制酶酶不能能將其其切開(kāi)開(kāi)。限制酶酶特點(diǎn)：：專(zhuān)一一性作用部部位：：磷酸酸二酯酯鍵（1））黏性性末端端被限制制酶切切開(kāi)的的DNA兩條單鏈的的切口口，帶有有幾個(gè)個(gè)伸出的的核苷苷酸，他們們之間間正好好互補(bǔ)配配對(duì)，這樣樣的切切口叫叫黏性末末端。4、結(jié)果果：形成兩兩種末末端黏性末端平末端EcoRⅠⅠ黏性末末端黏性末末端EcoRⅠⅠ黏性末末端黏性末末端EcoRⅠⅠ能識(shí)別別GAATTC序列，，并在在G和和A之間間切切開(kāi)開(kāi)SmaⅠⅠ平末末端端（2））平平末末端端平末末端端SmaⅠⅠ能能識(shí)識(shí)別別CCCGGG序列列，，并并在在C和和G之間間切切割割形形成成平平末末端端當(dāng)限限制制酶酶從從識(shí)識(shí)別別序序列列的的中中心心軸軸線(xiàn)線(xiàn)處處切切開(kāi)開(kāi)時(shí)時(shí)，，切切開(kāi)開(kāi)的的DNA兩條條單單鏈鏈的的切切口口，，是是平平整整的的，，這這樣樣的的切切口口叫叫平末末端端。GAATTCCGTAGAATTCGGATT嘗試試寫(xiě)寫(xiě)出出下下列列序序列列受受EcoRI限制制酶酶作作用用后后的的黏黏性性末末端端CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTCTTAAGGCATCTTAAGCCTAACTTCATGAATTCCCTAA

GAAGTACTTAAGGGATT練一一練練:GGCATCTTAAAATTCCGTAG目的的基基因因被同同一一種種限限制制酶酶切切斷斷的的幾幾個(gè)個(gè)DNA是否否具具有有相相同同的的黏黏性性末末端端？？思考考:要想想獲獲得得某某個(gè)個(gè)目的的基基因因必須須要要用用限限制制酶酶切切幾幾個(gè)個(gè)切切口口？？可可產(chǎn)產(chǎn)生生幾幾個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端？？一一個(gè)個(gè)目目的的基基因因有有幾幾個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端？？要切切兩兩個(gè)個(gè)切切口口，，產(chǎn)產(chǎn)生生四四個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端，，兩兩個(gè)個(gè)。。是，，會(huì)會(huì)產(chǎn)產(chǎn)生生相相同同的的黏黏性性末末端端。。DNA被限限制制酶酶切切斷斷后后有有兩兩個(gè)個(gè)反反向向互互補(bǔ)補(bǔ)的的“黏性性末末端端”。被被同同一一種種限限制制酶酶切切斷斷的的幾幾個(gè)個(gè)DNA具有有相相同同的的黏黏性性末末端端，，能能夠夠通通過(guò)過(guò)互互補(bǔ)補(bǔ)進(jìn)進(jìn)行行配配對(duì)對(duì)。。分子子縫縫合合針針：：DNA連連接接酶酶G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

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GGC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

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AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割二、、分分子子縫縫合合針針────DNA連連接接酶酶1、作作用用：：將將互互補(bǔ)補(bǔ)配配對(duì)對(duì)的的兩兩個(gè)個(gè)黏黏性性末末端端連連接接起起來(lái)來(lái)，，使使之之成成為為一一個(gè)個(gè)完完整整的的DNA分分子子。。AATTGCCTTAAG連接接磷磷酸酸二二酯酯鍵鍵可把把黏性性末末端端之間的縫隙“縫合””起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶酶切開(kāi)的兩個(gè)個(gè)核苷酸之間間的磷酸二酯酯鍵2、類(lèi)型T4DNA連接酶還可把平末端之間的的縫隙“縫合合”起來(lái)，但效率率較低T4DNA連接酶類(lèi)型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的的核酸片段上上，形成磷酸酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯酯鍵連接成一條互互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)時(shí)連接起來(lái)，不需要模板三、基因的運(yùn)運(yùn)輸工具——運(yùn)載體3.種類(lèi)：質(zhì)粒、λ噬菌體的衍衍生物和動(dòng)植物病毒毒。1.作用：將外源源基因送入受受體細(xì)胞。能在宿主細(xì)胞胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)穩(wěn)定地保存。。具有一個(gè)至多多個(gè)限制酶切切點(diǎn)，使外源源基因插入其其中。具有某些標(biāo)記記基因，以便便進(jìn)行篩選。。如抗菌素抗性性基因、產(chǎn)物物具有顏色反反應(yīng)的基因等等。對(duì)受體細(xì)胞無(wú)無(wú)害，不影響響其正?；顒?dòng)動(dòng)。2.條件：質(zhì)粒病毒(噬菌體和動(dòng)植植物病毒)最常用的運(yùn)載載體——質(zhì)粒分布：存在于于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中。最常用的質(zhì)粒粒是大腸桿菌的質(zhì)質(zhì)粒。本質(zhì)：細(xì)胞染染色體(或擬核)外能自主復(fù)制的小型型環(huán)環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒的存在與與否對(duì)宿主細(xì)細(xì)胞生存沒(méi)有有決定性作用用，但復(fù)制只只能在宿主細(xì)細(xì)胞內(nèi)完成。。注意：真正用用作運(yùn)載體的的質(zhì)粒都是人人工改造過(guò)的的?；虻倪\(yùn)輸工工具——質(zhì)粒能復(fù)制并帶著著插入的目的的基因一起復(fù)復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的的存在，將來(lái)來(lái)可用含青霉霉素的培養(yǎng)基基鑒別。小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專(zhuān)一性(識(shí)別序列)切開(kāi)DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類(lèi)E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運(yùn)載工具具備的條件結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,大小適中能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒1、質(zhì)粒是基基因工程中最最常用的運(yùn)載載體，它的主主要特點(diǎn)是①能自主復(fù)制制②不能能自主復(fù)制③