蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析-課件

第二章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析第二章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析1第一節(jié)蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備

進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)樣品，一般要求純度>95％。這樣的樣品，通常是用色譜和電泳精制過(guò)的。一、SDS—PAGE純化的樣品從SDS上分離的蛋白質(zhì)必需經(jīng)過(guò)特殊處理，使SDS濃度低于0.0005％，否則SDS會(huì)影響到胰蛋白酶的酶解，也會(huì)大大降低HPLC分肽時(shí)的分辨率。有報(bào)道指出，在2mol／L尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)時(shí)，如果SDS濃度>0.05％，則完全阻止了胰蛋白酶和內(nèi)肽酶Lys-C的作用。雖然有報(bào)道用HPLC或用鹽酸胍沉淀除去SDS，但不易掌握，尤其是共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的SDS分子更難除去。在SDS后，采用電印跡(blotting)到PVDF膜上，也是常用的方法，因?yàn)镻VDF膜結(jié)合蛋白質(zhì)能力的專一性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其結(jié)合鹽、氨基酸和去垢劑，因此，蛋白質(zhì)能和這些“污染物”分開(kāi)。經(jīng)過(guò)這樣處理后，能用于BrCN化學(xué)裂解或酶解。第一節(jié)蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)樣品2二、HPLC純化的樣品如果樣品是用反相HPLC純化的，因?yàn)榱鲃?dòng)相是揮發(fā)性溶劑，它們?cè)谡婵针x心干燥或凍干樣品時(shí)除去；如果蛋白質(zhì)是用離子交換HPLC或疏水HPLC或凝膠過(guò)濾HPLC精制的，則樣品要進(jìn)行脫鹽。脫鹽或稀蛋白溶液的濃縮可用0.1％三氟乙酸(TFA)—乙腈(ACN)系統(tǒng)的短柱反相HPLC；也可采用一次性的Sek-Pak，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是水溶性的，所以先用能與水互溶的甲醇或乙腈(2ml)潤(rùn)之，再用5ml純水洗滌；然后樣品液體通過(guò)Sep-Pak柱時(shí)，蛋白質(zhì)保留在柱上，小分子的鹽類流過(guò)柱體，用水溶液充分洗滌后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白質(zhì)。小的超濾裝置對(duì)濃縮蛋白質(zhì)也是有效的。此外，有機(jī)溶劑或TCA沉淀也可以考慮。三、蛋白質(zhì)樣品中的二硫鍵和巰基(一SH)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品純度達(dá)到要求，鹽和小分子也除得比較“干凈”，在進(jìn)行酶解前，還要轉(zhuǎn)變半胱氨酸殘基成其他的穩(wěn)定的衍生物。因?yàn)榘腚装彼岬膸€基在分肽過(guò)程中易自動(dòng)氧化成各種產(chǎn)物，包括形成無(wú)序的二硫鍵，因此需要將半胱氨酸殘基先轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的衍生物。常用有碘代乙酸烷化，因?yàn)檫@個(gè)反應(yīng)是快速和專一的；同時(shí)這類試劑保存在暗處是很穩(wěn)定的。而且，這類試劑的矯作物(artifact)容易得到放射性標(biāo)記物。蛋白質(zhì)或肽在導(dǎo)入帶電荷基團(tuán)后也增加了其在水溶液中的溶解度。胱氨酸也可在還原后再修飾。二、HPLC純化的樣品31．還原和羧甲基化將1～20mg蛋白質(zhì)溶解在含6mol/L鹽酸胍的0.1mol/LTris-1mmol/LEDTA的緩沖液中，pH8.3，加DTT至2mmol/L或再多一些(過(guò)量于存在于蛋白質(zhì)中的二硫鍵)，通氮?dú)猓缓笱杆俜忾]，37℃反應(yīng)1h，再加入50mmol/L的碘代乙酸(已用NaOH中和)，其量為1.1倍(分子比)過(guò)量于溶液中的巰基數(shù)(蛋白質(zhì)中的一SH和DTT中的一SH總和),典型為4.5～5mmol/L，再次充氮?dú)猓诎堤?7℃保溫1h。加2—巰基乙醇至最后濃度1％(V/V)結(jié)束反應(yīng)，然后對(duì)50mmol/LNH4HC03，含0.01％硫二甘醇(thiodiglyc01)充分透析，凍干。注意：碘代乙酸必須是無(wú)色的，如果有碘存在，呈淡黃色，會(huì)引起巰基迅速氧化，阻礙了烷化反應(yīng)，而且可能有副反應(yīng)，使色氨酸修飾。碘代乙酰胺(iodoacetamide)也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸殘基的烷化。這常用于避免牛胱氨酸被導(dǎo)入負(fù)電荷，而用中性的碘代乙酰胺。另一種情況是變性劑不用鹽酸胍，而用SDS，這時(shí)如果用碘代乙酸，反應(yīng)往往進(jìn)行得很慢，而且不完全，這是因?yàn)榈獯宜岬呢?fù)電荷和蛋白質(zhì)—SDS膠束(微團(tuán))上的負(fù)電荷相互排斥。2．還原和吡啶乙烯化用4—乙烯吡啶(4-vinylpyridine)處理同上，通氮?dú)獗剡^(guò)夜。1．還原和羧甲基化4第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解裂解于甲硫氨酸(Met)

溴化氰(BrCN)是首選的化學(xué)試劑，專一裂解在甲硫氨酸的羧基端，對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)裂解效率為90％以上。BrCN在酸性條件下，裂解在甲硫氨酸的C端肽鍵上，將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成高絲氨酸(Ⅱ)(homoserine)和高絲氨酸內(nèi)酯(I)(homoserinelactone)的混合物，它們之間也能相互轉(zhuǎn)化，如圖2.1所示。第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解5對(duì)Met-Thr、Met-Ser鍵，則常常是低產(chǎn)率的，可能是β羥基產(chǎn)生下面的一系列反應(yīng)(Ⅲ和Ⅳ)，最后形成高絲氨酸殘基(V)，而未裂解此肽鍵，如圖2.2所示。Met-Cys鍵也不易裂解。對(duì)Met-Thr、Met-Ser鍵，則常常是低產(chǎn)率6典型的反應(yīng)常常在20℃、70％甲酸(V/V)中進(jìn)行24h，副反應(yīng)是部分Asp-Pro鍵會(huì)斷裂，一些酰胺基團(tuán)會(huì)部分丟失，部分Asn-Gly會(huì)產(chǎn)生重排或環(huán)化，有時(shí)Trp會(huì)氧化。操作：蛋白質(zhì)先用5％巰基乙醇在pH8.0室溫下處理24h，加色胺(tryptamine)或色氨酸(以每分子甲硫氨酸加5分子色胺或色氨酸計(jì)算)以防止色氨酸氧化。蛋白質(zhì)以1～5mg/ml濃度溶解在70％甲酸中，加入50倍過(guò)量，小體積的BrCN/70％甲酸，通氮并置于暗處，室溫放置16～24h，結(jié)束后加15倍體積的水，凍干，重復(fù)加水凍干。典型的反應(yīng)常常在20℃、70％甲酸(V/V)中進(jìn)行27蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析-課件8第三節(jié)蛋白水解酶酶解一、常用蛋白水解酶(1)胰蛋白酶(trypsin)專一作用在Arg和Lys(堿性氨基酸)的羧基端，但對(duì)Arg-Pro和Lys-Pro鍵沒(méi)作用。我們常將胰蛋白酶配成1mg/ml，貯存在1mmol/LHCl中，-20℃保存數(shù)月，而未觀察到酶的活性損失。如果樣品溶解度差，可適量加入尿素增加溶解度，因?yàn)橐鹊鞍酌冈?mol/L尿素中，仍具有充分的活性。(2)胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin)專一作用在芳香族氨基酸的羧基端。(3)內(nèi)肽酶Lys-C(endoproteinaseLys-c)專一作用在Lys的羧基端。(4)V8蛋白酶(staphylococcalprotease)專一作用在Asp和Glu(酸性氨基酸)的羧基端。pH8.0的磷酸緩沖液時(shí)，作用在Glu-X和Asp-X；pH4.0的乙酸緩沖液時(shí)，僅作用于Glu-x鍵。第三節(jié)蛋白水解酶酶解9(5)梭菌蛋白酶(clostripain)專一作用在Arg的羧基端。(6)凝血酶(thrombin)專一裂解在Arg-Gly鍵上，在纖維蛋白原工作中，很大程度上還依賴于鄰近氨基酸序列。近來(lái)還常用作融合蛋白的裂解點(diǎn)。(7)其他還有專一性較廣的胃蛋白酶(pepsin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、木瓜蛋白酶(papain)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)等。應(yīng)該指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均從胰臟制備，常常不易完全分開(kāi)，而是你中有我，我中有你，專一性不佳，易造成混亂。應(yīng)采購(gòu)TPCK—胰蛋白酶(抑制了胰凝乳蛋白酶活性)和TLCK—胰凝乳蛋白酶(抑制了胰蛋白-酶活性，才能保證酶的專一性。(5)梭菌蛋白酶(clostripain)10二、酶解操作條件將30μl(100μg)蛋白質(zhì)，100mmol/LNH4HCO3，pH8.5，5mmol/LDTT，50℃作用15min，在冷至室溫后，加5μl100mmol/L碘代乙酸，室溫15min，加60μl水，最后加酶5μl[蛋白樣品:酶=25:1(質(zhì)量比)]，37℃保溫20-24h，凍干樣品或直接注射樣品(用稀TFA酸化至約pH2.5)到反相HPLC柱中分析。二、酶解操作條件11三、討論(1)蛋白質(zhì)的量和濃度酶解不能正常進(jìn)行的主要原因之一是蛋白質(zhì)的量不足。精確定量蛋白質(zhì)是必需的，一般用氨基酸分析來(lái)定量微量的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度通常要求500μg/ml，最少不得低于100μg/ml，否則酶的消化難以進(jìn)行，體積在50～100μl。(2)緩沖液、鹽和去垢劑酶作用可以被緩沖液中的各種因子所抑制或完全阻止。在標(biāo)準(zhǔn)的2mol/L尿素，0.1mol/LNH4HCO3系統(tǒng)中，SDS含量為0.0005％時(shí)，就會(huì)影響酶的消化。0.005％SDS會(huì)減少許多酶解肽段的產(chǎn)量。類似的，染料考馬斯蘭和兩性電介質(zhì)也會(huì)阻止酶的消化。高濃度的鹽(1mol/LNaCl)也會(huì)影響蛋白水解酶的活性；2mol/L以上濃度的尿素會(huì)影響羧甲基化和蛋白酶的消化。(3)羧甲基化Stone等報(bào)道，轉(zhuǎn)鐵蛋白用酶解時(shí)，羧甲基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解很好，而沒(méi)有羧甲基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白，酶解程度很差。三、討論12(4)蛋白酶的量酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1:25，如果分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)(>6萬(wàn)Da)，則比例要減低至1:50。胰蛋白酶要用序列級(jí)的商品。(5)原位酶解將SDS上的蛋白質(zhì)樣品從凝膠上解析下來(lái)是很困難的，文獻(xiàn)報(bào)道有很多方法，但實(shí)用性差。目前流行的方法是將蛋白質(zhì)電印跡(blotting)至PVDF類的膜上，直接進(jìn)行序列分析或直接在膜上進(jìn)行酶解，后者稱為原位分析(insitu)。

(4)蛋白酶的量13原位酶解操作如下：膜片剪成lmm細(xì)條，放在Eppendrof管中,加1.2ml0.5％(m/V)PVP-40/0.1mol/LHAc，37℃保溫30min，PVP-40的作用是阻止在酶解時(shí)蛋白酶吸附到硝酸纖維素膜上，除去PVP-40后，用水充分洗滌膜至少5次以洗凈殘留的PVP-40(因?yàn)镻VP-40有很強(qiáng)的紫外吸收，在RP-HPLC中，PVP-40于30％一40％有機(jī)溶劑濃度時(shí)洗下來(lái)，它在215～220nm有很高的吸收，在260～289nm吸收很小)，所以在HPLC前需完全除去。膜片再用酶解時(shí)的緩沖液漂洗，然后進(jìn)行酶解，一般蛋白酶在100mmol/LNH4HCO3:CAN=95:5，pH8.2，37℃酶解過(guò)夜，對(duì)V8蛋白酶則在100mmol/L磷酸鈉:ACN=95:5，pH7.8，室溫過(guò)夜。酶與底物之比為1:10至1:20(質(zhì)量比)；對(duì)亞微克級(jí)樣品，酶與底物之比高達(dá)2:1。酶解后-20℃保存或立刻用數(shù)微升10％TFA酸化，上樣到HPLC柱上分析。原位酶解操作如下：膜片剪成lmm細(xì)條，放在Epp14(6)限制性酶解限制性酶解有助于蛋白質(zhì)測(cè)序時(shí)的序列演繹。最著名的例子是核糖核酸酶(RNase)，它被枯草桿菌蛋白水解酶在pH8.0下作用，活性沒(méi)有變化，但出現(xiàn)一個(gè)新的N端絲氨酸。用AmberliteIRC-50離子交換柱，0.2mol/LpH6.25的磷酸鈉緩沖液可分離到一個(gè)大片段(S蛋白)和一個(gè)小片段(S肽)。也可用三氯乙酸(TCA)沉淀法，沉淀部分是S蛋白，上層液部分是S肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。(6)限制性酶解15第四節(jié)蛋白質(zhì)中存在著封閉的N端有些蛋白質(zhì)的N端是封閉的，尤其在腹水細(xì)胞中，80％的蛋白質(zhì)的N端是乙?；模虼擞肊dman法不能直接測(cè)定其序列，要用一系列的化學(xué)或酶處理。如果在蛋白質(zhì)/肽序列儀上測(cè)定不到序列，蛋白質(zhì)的量肯定又是足夠的，則可在儀器上進(jìn)一步用含水TFA(三氟乙酸)處理樣品，使蛋白質(zhì)酸水解成許多肽段后再測(cè)序，這時(shí)會(huì)有很多PTH-氨基酸出現(xiàn)，以此反證此蛋白質(zhì)的N端是封閉著的，再用下述方法除去封閉著的N端。首先，用溫和的酸處理可以除去甲?；募琢虬彼?f-Met)，也可能引起絲氨酸、蘇氨酸的乙?；疦-O重排反應(yīng)。如果酸處理后還是測(cè)不到序列，則進(jìn)一步用焦谷氨酸氨肽酶除去蛋白質(zhì)N端上的焦谷?；?；假設(shè)這一方法仍不見(jiàn)效，再用較強(qiáng)的酸處理或其他酶處理。雖然有乙酰氨基酸釋放酶(acylaminoacid-releasingenzyme，AARE)，但它不能作用長(zhǎng)度在20個(gè)氨基酸殘基以上的蛋白質(zhì)或肽。因此，封閉的蛋白質(zhì)首先裂解成小肽，再用AARE處理除去N端上的乙?；被徂D(zhuǎn)變成n-1肽，然后n-1肽的序列再用Edman法測(cè)定。第四節(jié)蛋白質(zhì)中存在著封閉的N端有些蛋白質(zhì)的N端16一、除去蛋白質(zhì)中封閉的N-乙酰絲氨酸和N-乙酰蘇氨酸樣品置于1.5ml的聚丙烯離心管中，加無(wú)水TFA，密閉，40℃保溫1h，然后打開(kāi)管蓋，讓TFA揮發(fā)，干燥，再進(jìn)行序列分析。二、除去N-甲酰甲硫氨酸樣品置于1.5ml聚丙烯離心管中，加30μl0.6mol/LHCl，密閉，25℃水解24h，打開(kāi)管蓋，真空除去HCl，然后進(jìn)行序列分析。以上兩種溫和酸水解除去甲?；蛞阴０被?，這與時(shí)間、溫度、酶濃度有很大關(guān)系，過(guò)分的酸水解會(huì)引起蛋白質(zhì)中肽鍵的斷裂，如對(duì)酸不穩(wěn)定的Asp-Pro鍵；相反，條件不夠，則封閉的N端基團(tuán)水解不完全，導(dǎo)致測(cè)序的起始點(diǎn)不均一。三、除去N端的焦谷氨酸殘基(pyroglutamate)樣品在序列儀上測(cè)不出N端，則將載有樣品的膜片轉(zhuǎn)移至1.5ml聚丙烯微量離心管中，用0.5％PVP-40洗膜片(見(jiàn)上節(jié)原位酶解部分)，再加100μl焦谷氨酸氨肽酶(5μg于50mmol/L磷酸鈉pH7.0，含10mmol/LDTT)37℃酶解5～10h，用水洗膜，干燥，放回序列儀分析。一、除去蛋白質(zhì)中封閉的N-乙酰絲氨酸和N-乙酰蘇氨酸17五、選擇性純化N端封閉的肽蛋白質(zhì)用胃蛋白酶(pepsin)或嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)作用后(但不能用胰蛋白酶!)，酸化到pH2，上強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換柱(例Dowex50mmX2mm，H+型)。所有含游離氨基或其他堿性基團(tuán)的肽都結(jié)合至柱上，僅缺少堿性基團(tuán)的肽通過(guò)柱泄出。如果N端是封閉著的(沒(méi)有游離的N端氨基)，同時(shí)因用專一性很廣的酶作用，肽較小又不含組氨酸、賴氨酸、精氨酸則可在排出液中發(fā)現(xiàn)N端封閉的肽。此技術(shù)的局限性是：大肽(甚至含有堿性基團(tuán))可能不結(jié)合到樹(shù)脂上，因?yàn)樗鼈儾粷B入樹(shù)脂孔徑內(nèi)；相反，一些疏水的肽，特別含有色氨酸殘基，即是它們?nèi)鄙儆坞x的N端氨基，也可能結(jié)合到柱上。此外，如果存在堿性基團(tuán)非?？拷麼端，胃蛋白酶作用不能除去，則該技術(shù)也不見(jiàn)效。應(yīng)該指出，N端為谷氨酸的肽在極端pH下會(huì)環(huán)化而轉(zhuǎn)變成封閉，需加以小心。近年來(lái)，由于質(zhì)譜(MS)在生物樣品檢測(cè)中有了長(zhǎng)足的發(fā)展，可用MS精確測(cè)定分子質(zhì)量的方法來(lái)判斷封閉的N端為何種基團(tuán)。五、選擇性純化N端封閉的肽18第五節(jié)蛋白質(zhì)中的C端殘基的測(cè)定一、羧肽酶法羧肽酶是最常用的方法，對(duì)一些小肽而言，C端有時(shí)最容易測(cè)定的，如胰蛋白酶酶解肽段時(shí)總是以Lys或Arg為C端；BrCN裂解的肽總是以高絲氨酸(homoserlne)為C端；V8蛋白酶酶解的肽總以Glu或Asp為C端。雖然有非專一的情況，但畢竟出現(xiàn)的概率很少。羧肽酶酶解是從C端開(kāi)始，一個(gè)一個(gè)地從C端釋放出氨基酸殘基，這是個(gè)動(dòng)態(tài)的釋放過(guò)程。有的氨基酸釋放快些，有的氨基酸釋放慢些。對(duì)小肽的C端序列測(cè)定問(wèn)題不大，但對(duì)長(zhǎng)肽的序列測(cè)定，由于對(duì)不同氨基酸殘基釋放的速度不同，對(duì)后面一些氨基酸的序列判斷，可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。在這方面不如化學(xué)降解法。C端序列分析是在酶解的不同時(shí)間間隔，取出一定量的反應(yīng)物停止反應(yīng)后，用氨基酸分析定量氨基酸來(lái)排列出其序列，近來(lái)用質(zhì)譜法測(cè)定C端序列。第五節(jié)蛋白質(zhì)中的C端殘基的測(cè)定一、羧肽酶法19(1)羧肽酶A(CpA)此酶釋放非極性氨基酸速度快，釋放His、Thr、homoserine也很快，釋放Asp、Set、Metsulphone則緩慢，釋放Lys也較慢，但在高pH下則速度加快點(diǎn)；酸性氨基酸的釋放也較慢，對(duì)Pro和Arg基本上不起作用。倒數(shù)第二個(gè)氨基酸殘基影響水解速度，但對(duì)這一現(xiàn)象作一歸納或解釋是很困難的。此外，如何保證CpA不污染有內(nèi)肽酶也是一個(gè)很重要的問(wèn)題，通常用二異丙基磷酰氟(Diisopropylfluorophosphate，DFP)處理以抑制絲氨酸蛋白酶的活性。CpA在低離子強(qiáng)度下是不溶性的，通常以懸液形式存放于4℃。使用前將酶懸浮在水中，離心除去上層液，上層液中可能含有游離的氨基酸，而沉淀部分溶于少量2mol/LNH4HCO3中，此CpA加到變性的底物蛋白質(zhì)中(10-100nmol，pH8.5，0.2mol/LN-ethylnorpholineHAc)，酶和底物的分子比為1:100，如果底物在此緩沖液中不溶解，則可在1％SDS(V/V)或6mol/L尿素中進(jìn)行。有時(shí)加正亮氨酸(norleucine，1mol/mol蛋白質(zhì))為內(nèi)標(biāo)。溶液在25℃保溫，隔0.5，1，4，16h，取一定量反應(yīng)液(1-5nmol)，加等體積1mol/LHAc停止酶作用，離心除去蛋白質(zhì)，上層液真空干燥，然后殘余物溶在氨基酸樣品緩沖液中進(jìn)行氨基酸分析。以正亮氨酸作校正，同時(shí)有相同程序的空白對(duì)照。如果在酶作用短時(shí)間后就釋放出大量的氨基酸，則改用低的CpA濃度和作用短時(shí)間(5，10，20，60min)取樣；相反，如果只有少量氨基酸釋放，則可加大酶/底物的比例，或37℃作用更長(zhǎng)的時(shí)間。(1)羧肽酶A(CpA)20

(2)羧肽酶B(CpB)從蛋白質(zhì)/肽的C端釋放Lys和Arg，CpB存放在－20℃時(shí)，非常穩(wěn)定。(3)羧肽酶Y(CpY)目前CpY有更廣泛的專一性和通用性，一般講它作用底物C端的疏水性氨基酸快些，作用于帶電荷的氨基酸慢些。此酶很穩(wěn)定，某些金屬離子(例如Cu2＋，Hg2＋)抑制酶活性。CpY制劑中可能污染有酵母蛋白酶A，這時(shí)可加胃蛋白酶抑制劑(pepstain)抑制，也可用EDTA抑制。CpY用量一般為底物的1/50～1/100，在25℃作用，于不同時(shí)間取反應(yīng)液酸化后分析游離的氨基酸。(4)羧肽酶P(CpP)CpP是種酸性羧肽酶，它貯存在pH5.5的50mmol/L吡啶醋酸緩沖液中，于-20℃，6個(gè)月內(nèi)非常穩(wěn)定。其作用于pH2.5的100mmol/L吡啶甲酸緩沖液中。(2)羧肽酶B(CpB)21二、化學(xué)降解法早年的化學(xué)降解法只能測(cè)定一個(gè)C端氨基酸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。而羧肽酶法雖能測(cè)到3～5個(gè)序列，但這是一個(gè)動(dòng)態(tài)演繹的方法，有可能錯(cuò)判。十多年前，蛋白質(zhì)化學(xué)家就開(kāi)始用類似Edman降解法從C端逐個(gè)測(cè)定氨基酸序列，每次國(guó)際蛋白質(zhì)會(huì)議都有報(bào)道，直到2019年才有商品儀器供應(yīng)。目前C端序列儀一般只能測(cè)定5個(gè)氨基酸殘基左右(這和蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，有些可測(cè)到10個(gè)左右)，在nmol水平上；這與N端序列還有很大的差距(目前N端序列儀靈敏度在10pmol，可測(cè)到50個(gè)循環(huán))二、化學(xué)降解法22第六節(jié)蛋白質(zhì)中一些特殊肽段的檢出

一、含巰基肽的分離純化和分析巰基在蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能中具有重要作用，因此含巰基肽段的鑒定是蛋白質(zhì)化學(xué)不可缺少的部分。文獻(xiàn)上含Cys的肽常用同位素標(biāo)記的碘代乙酸處理，羧甲基化，然后在HPLC肽譜分析時(shí)跟蹤有標(biāo)記的肽段。鑒于用同位素在國(guó)內(nèi)不很方便，我們用4-乙烯吡啶標(biāo)記蛋白質(zhì)中的半胱氨酸，酶解后的肽譜，除用214nm檢出外，同時(shí)還用254nm檢出，只有被4-乙烯吡啶修飾的肽在254nm才有吸收，所以能方便地檢出。

第六節(jié)蛋白質(zhì)中一些特殊肽段的檢出一、含巰基肽的分離純化23二、含芳香族氨基酸肽的分離純化和鑒定

(一)引言蛋白質(zhì)在280nm有特征性的高吸收，這主要是芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的貢獻(xiàn)。蛋白質(zhì)在酶解后的肽譜中，檢測(cè)波長(zhǎng)不用280nm，而采用214-220nm，這是由于肽鍵的強(qiáng)吸收緣故。肽譜中不含芳香族氨基酸的肽，在280nm下，基本上沒(méi)有吸收峰，但含有色氨酸或酪氨酸的肽，則在280nm下卻表現(xiàn)出強(qiáng)的吸收峰。據(jù)此，我們可以辨別含芳香族氨基酸的肽。此外，含芳香族氨基酸肽的二階微分光譜也和一般肽的二階微分光譜有明顯的差別。在堿性條件下(pH12.5)，Tyr離子化的二階微分光譜與Trp的二階微分光譜完全不同，特別在260nm。但這樣的條件對(duì)酸性的HPLC反相柱顯然是不合適的。二、含芳香族氨基酸肽的分離純化和鑒定24三、含Lys-肽的分離純化和鑒定賴氨酸的ε-氨基可以和磷酸吡哆醛(PLP)形成Schiff堿，該衍生物在325rml有特殊的吸收，利用這一性質(zhì)可找出含有Lys殘基的肽段。(一)引言蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基常常與生物活性密切有關(guān)。例如醛縮酶(ALD)中的Lys-227和同位素標(biāo)記的磷酸二羥丙酮反應(yīng)后，經(jīng)NaBH4還原可以形成Schiff堿。此時(shí)酶分子上可測(cè)定到等克分子數(shù)的放射性，同時(shí)酶的催化活性喪失。用同位素標(biāo)記肽比較麻煩，Shapiro則發(fā)現(xiàn)醛縮酶中Lys-117和磷酸吡哆醛(PLP)反應(yīng)，并經(jīng)NaBH4還原也可以形成Schiff堿，酶活性受抑制，但修飾后的醛縮酶仍可和底物結(jié)合。由此推論Lys-107是一次要活性部位。用PLP作用的優(yōu)點(diǎn)是避免用同位素，PLP修飾在Lys殘基上形成的肽，在325nm有一特殊吸收。因此，這種技術(shù)對(duì)制備和分離Lys-肽具有普遍意義。三、含Lys-肽的分離純化和鑒定25附錄一微量蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室注意事項(xiàng)(1)環(huán)境由于是微克級(jí)的操作，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度、灰塵、纖維、皮膚和頭皮屑都會(huì)影響結(jié)果。(2)吸附玻璃容器的表面吸附，由于量少，會(huì)使大部分物質(zhì)被吸在壁上．在溶液中的量趨于零。用透析袋，少量蛋白質(zhì)(100μg)會(huì)因吸附作用而導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p失。建議用微量透析儀器，或用小的凝膠過(guò)濾柱脫鹽，甚至用揮發(fā)性溶劑，避免脫鹽。推薦儲(chǔ)存少量肽(<10nmol)在小的玻璃管(5mmX50nm)中，避免轉(zhuǎn)移和表面吸附引起的損失。凍干樣品時(shí)，如果用大的器皿，則用硅烷化處理；有時(shí)候，寧可存放樣品在聚丙烯管中。附錄一微量蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)室注意事項(xiàng)26(3)樣品加祥和轉(zhuǎn)移小量樣品采用稱量是不精確的，因?yàn)橛械臉悠泛}易吸濕。蛋白質(zhì)/肽溶在適合的小量溶劑中(例5μl)，用5～10μl進(jìn)行分析，而且建議用玻璃的微量注射針筒，這比用微量可調(diào)加樣器精確得多。吡啶-乙酸-水是相當(dāng)好的蛋白質(zhì)/肽的溶劑，但吡啶在280nm有很高的光吸收，影響到紫外定量和HPLC的檢出。此時(shí)，較大的酸性肽可溶在NH4OH，NH4HCO3，有些蛋白質(zhì)/肽在此溶劑中不溶解，則可用酸(70％甲酸，或TFA)，并盡快在真空干燥后于-20℃保存。為防止在過(guò)程中空氣泡的噴出而使樣品丟失，開(kāi)始可用水泵抽10min，直至溶解在水中的空氣泡逸出后，再用油泵真空干燥。(4)反應(yīng)小體積的溶液，先用微量離心機(jī)使樣品集中在底部，加入試劑后迅速密閉防止小體積溶劑的揮發(fā)，然后渦旋，樣品和轉(zhuǎn)移均用微量注射器。(3)樣品加祥和轉(zhuǎn)移27附錄二常用試劑處理(1)水在我們實(shí)驗(yàn)室采用Mini-Q水。必須指出：即使用MiniQ水也要新鮮，長(zhǎng)期存放的MiniQ水，在HPLC空白時(shí)，也會(huì)有峰出現(xiàn)。(2)溴化氫(cyanogenbromide，BrCN)應(yīng)新鮮配制，完全無(wú)色才能用。平時(shí)密閉保存在－20℃。(3)鹽酸胍(Guanidiumchloride，Gu．HCl)推薦用Schwarz/MannBiotech公司的超純級(jí)產(chǎn)品。純化方法見(jiàn)文獻(xiàn)(4)6mol/L鹽酸濃鹽酸加等體積水，重蒸三次，去除前后餾分。此產(chǎn)品通常認(rèn)為是6mol/L(或5.7mol/L)的HCl。(5)尿素尿素溶液在放置時(shí)，特別在堿性pH下，會(huì)有氰化胺(ammoniumcyanate)積累，故應(yīng)用新鮮配制尿素溶液。氰化胺除去的方法：溶液通過(guò)一混合離子樹(shù)脂的小柱，1Lmol/L尿素溶液需10g樹(shù)脂，開(kāi)始流出柱的兩個(gè)柱體積的尿素丟棄不用。附錄二常用試劑處理28第二章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析第二章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析29第一節(jié)蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備

進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)樣品，一般要求純度>95％。這樣的樣品，通常是用色譜和電泳精制過(guò)的。一、SDS—PAGE純化的樣品從SDS上分離的蛋白質(zhì)必需經(jīng)過(guò)特殊處理，使SDS濃度低于0.0005％，否則SDS會(huì)影響到胰蛋白酶的酶解，也會(huì)大大降低HPLC分肽時(shí)的分辨率。有報(bào)道指出，在2mol／L尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)時(shí)，如果SDS濃度>0.05％，則完全阻止了胰蛋白酶和內(nèi)肽酶Lys-C的作用。雖然有報(bào)道用HPLC或用鹽酸胍沉淀除去SDS，但不易掌握，尤其是共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的SDS分子更難除去。在SDS后，采用電印跡(blotting)到PVDF膜上，也是常用的方法，因?yàn)镻VDF膜結(jié)合蛋白質(zhì)能力的專一性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其結(jié)合鹽、氨基酸和去垢劑，因此，蛋白質(zhì)能和這些“污染物”分開(kāi)。經(jīng)過(guò)這樣處理后，能用于BrCN化學(xué)裂解或酶解。第一節(jié)蛋白質(zhì)樣品的準(zhǔn)備進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的蛋白質(zhì)樣品30二、HPLC純化的樣品如果樣品是用反相HPLC純化的，因?yàn)榱鲃?dòng)相是揮發(fā)性溶劑，它們?cè)谡婵针x心干燥或凍干樣品時(shí)除去；如果蛋白質(zhì)是用離子交換HPLC或疏水HPLC或凝膠過(guò)濾HPLC精制的，則樣品要進(jìn)行脫鹽。脫鹽或稀蛋白溶液的濃縮可用0.1％三氟乙酸(TFA)—乙腈(ACN)系統(tǒng)的短柱反相HPLC；也可采用一次性的Sek-Pak，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是水溶性的，所以先用能與水互溶的甲醇或乙腈(2ml)潤(rùn)之，再用5ml純水洗滌；然后樣品液體通過(guò)Sep-Pak柱時(shí)，蛋白質(zhì)保留在柱上，小分子的鹽類流過(guò)柱體，用水溶液充分洗滌后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白質(zhì)。小的超濾裝置對(duì)濃縮蛋白質(zhì)也是有效的。此外，有機(jī)溶劑或TCA沉淀也可以考慮。三、蛋白質(zhì)樣品中的二硫鍵和巰基(一SH)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品純度達(dá)到要求，鹽和小分子也除得比較“干凈”，在進(jìn)行酶解前，還要轉(zhuǎn)變半胱氨酸殘基成其他的穩(wěn)定的衍生物。因?yàn)榘腚装彼岬膸€基在分肽過(guò)程中易自動(dòng)氧化成各種產(chǎn)物，包括形成無(wú)序的二硫鍵，因此需要將半胱氨酸殘基先轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的衍生物。常用有碘代乙酸烷化，因?yàn)檫@個(gè)反應(yīng)是快速和專一的；同時(shí)這類試劑保存在暗處是很穩(wěn)定的。而且，這類試劑的矯作物(artifact)容易得到放射性標(biāo)記物。蛋白質(zhì)或肽在導(dǎo)入帶電荷基團(tuán)后也增加了其在水溶液中的溶解度。胱氨酸也可在還原后再修飾。二、HPLC純化的樣品311．還原和羧甲基化將1～20mg蛋白質(zhì)溶解在含6mol/L鹽酸胍的0.1mol/LTris-1mmol/LEDTA的緩沖液中，pH8.3，加DTT至2mmol/L或再多一些(過(guò)量于存在于蛋白質(zhì)中的二硫鍵)，通氮?dú)?，然后迅速封閉，37℃反應(yīng)1h，再加入50mmol/L的碘代乙酸(已用NaOH中和)，其量為1.1倍(分子比)過(guò)量于溶液中的巰基數(shù)(蛋白質(zhì)中的一SH和DTT中的一SH總和),典型為4.5～5mmol/L，再次充氮?dú)?，于暗?7℃保溫1h。加2—巰基乙醇至最后濃度1％(V/V)結(jié)束反應(yīng)，然后對(duì)50mmol/LNH4HC03，含0.01％硫二甘醇(thiodiglyc01)充分透析，凍干。注意：碘代乙酸必須是無(wú)色的，如果有碘存在，呈淡黃色，會(huì)引起巰基迅速氧化，阻礙了烷化反應(yīng)，而且可能有副反應(yīng)，使色氨酸修飾。碘代乙酰胺(iodoacetamide)也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸殘基的烷化。這常用于避免牛胱氨酸被導(dǎo)入負(fù)電荷，而用中性的碘代乙酰胺。另一種情況是變性劑不用鹽酸胍，而用SDS，這時(shí)如果用碘代乙酸，反應(yīng)往往進(jìn)行得很慢，而且不完全，這是因?yàn)榈獯宜岬呢?fù)電荷和蛋白質(zhì)—SDS膠束(微團(tuán))上的負(fù)電荷相互排斥。2．還原和吡啶乙烯化用4—乙烯吡啶(4-vinylpyridine)處理同上，通氮?dú)獗剡^(guò)夜。1．還原和羧甲基化32第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解裂解于甲硫氨酸(Met)

溴化氰(BrCN)是首選的化學(xué)試劑，專一裂解在甲硫氨酸的羧基端，對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)裂解效率為90％以上。BrCN在酸性條件下，裂解在甲硫氨酸的C端肽鍵上，將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化成高絲氨酸(Ⅱ)(homoserine)和高絲氨酸內(nèi)酯(I)(homoserinelactone)的混合物，它們之間也能相互轉(zhuǎn)化，如圖2.1所示。第二節(jié)蛋白質(zhì)的化學(xué)裂解33對(duì)Met-Thr、Met-Ser鍵，則常常是低產(chǎn)率的，可能是β羥基產(chǎn)生下面的一系列反應(yīng)(Ⅲ和Ⅳ)，最后形成高絲氨酸殘基(V)，而未裂解此肽鍵，如圖2.2所示。Met-Cys鍵也不易裂解。對(duì)Met-Thr、Met-Ser鍵，則常常是低產(chǎn)率34典型的反應(yīng)常常在20℃、70％甲酸(V/V)中進(jìn)行24h，副反應(yīng)是部分Asp-Pro鍵會(huì)斷裂，一些酰胺基團(tuán)會(huì)部分丟失，部分Asn-Gly會(huì)產(chǎn)生重排或環(huán)化，有時(shí)Trp會(huì)氧化。操作：蛋白質(zhì)先用5％巰基乙醇在pH8.0室溫下處理24h，加色胺(tryptamine)或色氨酸(以每分子甲硫氨酸加5分子色胺或色氨酸計(jì)算)以防止色氨酸氧化。蛋白質(zhì)以1～5mg/ml濃度溶解在70％甲酸中，加入50倍過(guò)量，小體積的BrCN/70％甲酸，通氮并置于暗處，室溫放置16～24h，結(jié)束后加15倍體積的水，凍干，重復(fù)加水凍干。典型的反應(yīng)常常在20℃、70％甲酸(V/V)中進(jìn)行235蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析-課件36第三節(jié)蛋白水解酶酶解一、常用蛋白水解酶(1)胰蛋白酶(trypsin)專一作用在Arg和Lys(堿性氨基酸)的羧基端，但對(duì)Arg-Pro和Lys-Pro鍵沒(méi)作用。我們常將胰蛋白酶配成1mg/ml，貯存在1mmol/LHCl中，-20℃保存數(shù)月，而未觀察到酶的活性損失。如果樣品溶解度差，可適量加入尿素增加溶解度，因?yàn)橐鹊鞍酌冈?mol/L尿素中，仍具有充分的活性。(2)胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin)專一作用在芳香族氨基酸的羧基端。(3)內(nèi)肽酶Lys-C(endoproteinaseLys-c)專一作用在Lys的羧基端。(4)V8蛋白酶(staphylococcalprotease)專一作用在Asp和Glu(酸性氨基酸)的羧基端。pH8.0的磷酸緩沖液時(shí)，作用在Glu-X和Asp-X；pH4.0的乙酸緩沖液時(shí)，僅作用于Glu-x鍵。第三節(jié)蛋白水解酶酶解37(5)梭菌蛋白酶(clostripain)專一作用在Arg的羧基端。(6)凝血酶(thrombin)專一裂解在Arg-Gly鍵上，在纖維蛋白原工作中，很大程度上還依賴于鄰近氨基酸序列。近來(lái)還常用作融合蛋白的裂解點(diǎn)。(7)其他還有專一性較廣的胃蛋白酶(pepsin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、木瓜蛋白酶(papain)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)等。應(yīng)該指出胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均從胰臟制備，常常不易完全分開(kāi)，而是你中有我，我中有你，專一性不佳，易造成混亂。應(yīng)采購(gòu)TPCK—胰蛋白酶(抑制了胰凝乳蛋白酶活性)和TLCK—胰凝乳蛋白酶(抑制了胰蛋白-酶活性，才能保證酶的專一性。(5)梭菌蛋白酶(clostripain)38二、酶解操作條件將30μl(100μg)蛋白質(zhì)，100mmol/LNH4HCO3，pH8.5，5mmol/LDTT，50℃作用15min，在冷至室溫后，加5μl100mmol/L碘代乙酸，室溫15min，加60μl水，最后加酶5μl[蛋白樣品:酶=25:1(質(zhì)量比)]，37℃保溫20-24h，凍干樣品或直接注射樣品(用稀TFA酸化至約pH2.5)到反相HPLC柱中分析。二、酶解操作條件39三、討論(1)蛋白質(zhì)的量和濃度酶解不能正常進(jìn)行的主要原因之一是蛋白質(zhì)的量不足。精確定量蛋白質(zhì)是必需的，一般用氨基酸分析來(lái)定量微量的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度通常要求500μg/ml，最少不得低于100μg/ml，否則酶的消化難以進(jìn)行，體積在50～100μl。(2)緩沖液、鹽和去垢劑酶作用可以被緩沖液中的各種因子所抑制或完全阻止。在標(biāo)準(zhǔn)的2mol/L尿素，0.1mol/LNH4HCO3系統(tǒng)中，SDS含量為0.0005％時(shí)，就會(huì)影響酶的消化。0.005％SDS會(huì)減少許多酶解肽段的產(chǎn)量。類似的，染料考馬斯蘭和兩性電介質(zhì)也會(huì)阻止酶的消化。高濃度的鹽(1mol/LNaCl)也會(huì)影響蛋白水解酶的活性；2mol/L以上濃度的尿素會(huì)影響羧甲基化和蛋白酶的消化。(3)羧甲基化Stone等報(bào)道，轉(zhuǎn)鐵蛋白用酶解時(shí)，羧甲基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解很好，而沒(méi)有羧甲基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白，酶解程度很差。三、討論40(4)蛋白酶的量酶和蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1:25，如果分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)(>6萬(wàn)Da)，則比例要減低至1:50。胰蛋白酶要用序列級(jí)的商品。(5)原位酶解將SDS上的蛋白質(zhì)樣品從凝膠上解析下來(lái)是很困難的，文獻(xiàn)報(bào)道有很多方法，但實(shí)用性差。目前流行的方法是將蛋白質(zhì)電印跡(blotting)至PVDF類的膜上，直接進(jìn)行序列分析或直接在膜上進(jìn)行酶解，后者稱為原位分析(insitu)。

(4)蛋白酶的量41原位酶解操作如下：膜片剪成lmm細(xì)條，放在Eppendrof管中,加1.2ml0.5％(m/V)PVP-40/0.1mol/LHAc，37℃保溫30min，PVP-40的作用是阻止在酶解時(shí)蛋白酶吸附到硝酸纖維素膜上，除去PVP-40后，用水充分洗滌膜至少5次以洗凈殘留的PVP-40(因?yàn)镻VP-40有很強(qiáng)的紫外吸收，在RP-HPLC中，PVP-40于30％一40％有機(jī)溶劑濃度時(shí)洗下來(lái)，它在215～220nm有很高的吸收，在260～289nm吸收很小)，所以在HPLC前需完全除去。膜片再用酶解時(shí)的緩沖液漂洗，然后進(jìn)行酶解，一般蛋白酶在100mmol/LNH4HCO3:CAN=95:5，pH8.2，37℃酶解過(guò)夜，對(duì)V8蛋白酶則在100mmol/L磷酸鈉:ACN=95:5，pH7.8，室溫過(guò)夜。酶與底物之比為1:10至1:20(質(zhì)量比)；對(duì)亞微克級(jí)樣品，酶與底物之比高達(dá)2:1。酶解后-20℃保存或立刻用數(shù)微升10％TFA酸化，上樣到HPLC柱上分析。原位酶解操作如下：膜片剪成lmm細(xì)條，放在Epp42(6)限制性酶解限制性酶解有助于蛋白質(zhì)測(cè)序時(shí)的序列演繹。最著名的例子是核糖核酸酶(RNase)，它被枯草桿菌蛋白水解酶在pH8.0下作用，活性沒(méi)有變化，但出現(xiàn)一個(gè)新的N端絲氨酸。用AmberliteIRC-50離子交換柱，0.2mol/LpH6.25的磷酸鈉緩沖液可分離到一個(gè)大片段(S蛋白)和一個(gè)小片段(S肽)。也可用三氯乙酸(TCA)沉淀法，沉淀部分是S蛋白，上層液部分是S肽。同法亦可用在糖原磷酸化酶等的研究中。(6)限制性酶解43第四節(jié)蛋白質(zhì)中存在著封閉的N端有些蛋白質(zhì)的N端是封閉的，尤其在腹水細(xì)胞中，80％的蛋白質(zhì)的N端是乙?；?，因此用Edman法不能直接測(cè)定其序列，要用一系列的化學(xué)或酶處理。如果在蛋白質(zhì)/肽序列儀上測(cè)定不到序列，蛋白質(zhì)的量肯定又是足夠的，則可在儀器上進(jìn)一步用含水TFA(三氟乙酸)處理樣品，使蛋白質(zhì)酸水解成許多肽段后再測(cè)序，這時(shí)會(huì)有很多PTH-氨基酸出現(xiàn)，以此反證此蛋白質(zhì)的N端是封閉著的，再用下述方法除去封閉著的N端。首先，用溫和的酸處理可以除去甲?；募琢虬彼?f-Met)，也可能引起絲氨酸、蘇氨酸的乙?；疦-O重排反應(yīng)。如果酸處理后還是測(cè)不到序列，則進(jìn)一步用焦谷氨酸氨肽酶除去蛋白質(zhì)N端上的焦谷?；?；假設(shè)這一方法仍不見(jiàn)效，再用較強(qiáng)的酸處理或其他酶處理。雖然有乙酰氨基酸釋放酶(acylaminoacid-releasingenzyme，AARE)，但它不能作用長(zhǎng)度在20個(gè)氨基酸殘基以上的蛋白質(zhì)或肽。因此，封閉的蛋白質(zhì)首先裂解成小肽，再用AARE處理除去N端上的乙酰化氨基酸轉(zhuǎn)變成n-1肽，然后n-1肽的序列再用Edman法測(cè)定。第四節(jié)蛋白質(zhì)中存在著封閉的N端有些蛋白質(zhì)的N端44一、除去蛋白質(zhì)中封閉的N-乙酰絲氨酸和N-乙酰蘇氨酸樣品置于1.5ml的聚丙烯離心管中，加無(wú)水TFA，密閉，40℃保溫1h，然后打開(kāi)管蓋，讓TFA揮發(fā)，干燥，再進(jìn)行序列分析。二、除去N-甲酰甲硫氨酸樣品置于1.5ml聚丙烯離心管中，加30μl0.6mol/LHCl，密閉，25℃水解24h，打開(kāi)管蓋，真空除去HCl，然后進(jìn)行序列分析。以上兩種溫和酸水解除去甲酰或乙酰氨基酸，這與時(shí)間、溫度、酶濃度有很大關(guān)系，過(guò)分的酸水解會(huì)引起蛋白質(zhì)中肽鍵的斷裂，如對(duì)酸不穩(wěn)定的Asp-Pro鍵；相反，條件不夠，則封閉的N端基團(tuán)水解不完全，導(dǎo)致測(cè)序的起始點(diǎn)不均一。三、除去N端的焦谷氨酸殘基(pyroglutamate)樣品在序列儀上測(cè)不出N端，則將載有樣品的膜片轉(zhuǎn)移至1.5ml聚丙烯微量離心管中，用0.5％PVP-40洗膜片(見(jiàn)上節(jié)原位酶解部分)，再加100μl焦谷氨酸氨肽酶(5μg于50mmol/L磷酸鈉pH7.0，含10mmol/LDTT)37℃酶解5～10h，用水洗膜，干燥，放回序列儀分析。一、除去蛋白質(zhì)中封閉的N-乙酰絲氨酸和N-乙酰蘇氨酸45五、選擇性純化N端封閉的肽蛋白質(zhì)用胃蛋白酶(pepsin)或嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)作用后(但不能用胰蛋白酶!)，酸化到pH2，上強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換柱(例Dowex50mmX2mm，H+型)。所有含游離氨基或其他堿性基團(tuán)的肽都結(jié)合至柱上，僅缺少堿性基團(tuán)的肽通過(guò)柱泄出。如果N端是封閉著的(沒(méi)有游離的N端氨基)，同時(shí)因用專一性很廣的酶作用，肽較小又不含組氨酸、賴氨酸、精氨酸則可在排出液中發(fā)現(xiàn)N端封閉的肽。此技術(shù)的局限性是：大肽(甚至含有堿性基團(tuán))可能不結(jié)合到樹(shù)脂上，因?yàn)樗鼈儾粷B入樹(shù)脂孔徑內(nèi)；相反，一些疏水的肽，特別含有色氨酸殘基，即是它們?nèi)鄙儆坞x的N端氨基，也可能結(jié)合到柱上。此外，如果存在堿性基團(tuán)非?？拷麼端，胃蛋白酶作用不能除去，則該技術(shù)也不見(jiàn)效。應(yīng)該指出，N端為谷氨酸的肽在極端pH下會(huì)環(huán)化而轉(zhuǎn)變成封閉，需加以小心。近年來(lái)，由于質(zhì)譜(MS)在生物樣品檢測(cè)中有了長(zhǎng)足的發(fā)展，可用MS精確測(cè)定分子質(zhì)量的方法來(lái)判斷封閉的N端為何種基團(tuán)。五、選擇性純化N端封閉的肽46第五節(jié)蛋白質(zhì)中的C端殘基的測(cè)定一、羧肽酶法羧肽酶是最常用的方法，對(duì)一些小肽而言，C端有時(shí)最容易測(cè)定的，如胰蛋白酶酶解肽段時(shí)總是以Lys或Arg為C端；BrCN裂解的肽總是以高絲氨酸(homoserlne)為C端；V8蛋白酶酶解的肽總以Glu或Asp為C端。雖然有非專一的情況，但畢竟出現(xiàn)的概率很少。羧肽酶酶解是從C端開(kāi)始，一個(gè)一個(gè)地從C端釋放出氨基酸殘基，這是個(gè)動(dòng)態(tài)的釋放過(guò)程。有的氨基酸釋放快些，有的氨基酸釋放慢些。對(duì)小肽的C端序列測(cè)定問(wèn)題不大，但對(duì)長(zhǎng)肽的序列測(cè)定，由于對(duì)不同氨基酸殘基釋放的速度不同，對(duì)后面一些氨基酸的序列判斷，可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。在這方面不如化學(xué)降解法。C端序列分析是在酶解的不同時(shí)間間隔，取出一定量的反應(yīng)物停止反應(yīng)后，用氨基酸分析定量氨基酸來(lái)排列出其序列，近來(lái)用質(zhì)譜法測(cè)定C端序列。第五節(jié)蛋白質(zhì)中的C端殘基的測(cè)定一、羧肽酶法47(1)羧肽酶A(CpA)此酶釋放非極性氨基酸速度快，釋放His、Thr、homoserine也很快，釋放Asp、Set、Metsulphone則緩慢，釋放Lys也較慢，但在高pH下則速度加快點(diǎn)；酸性氨基酸的釋放也較慢，對(duì)Pro和Arg基本上不起作用。倒數(shù)第二個(gè)氨基酸殘基影響水解速度，但對(duì)這一現(xiàn)象作一歸納或解釋是很困難的。此外，如何保證CpA不污染有內(nèi)肽酶也是一個(gè)很重要的問(wèn)題，通常用二異丙基磷酰氟(Diisopropylfluorophosphate，DFP)處理以抑制絲氨酸蛋白酶的活性。CpA在低離子強(qiáng)度下是不溶性的，通常以懸液形式存放于4℃。使用前將酶懸浮在水中，離心除去上層液，上層液中可能含有游離的氨基酸，而沉淀部分溶于少量2mol/LNH4HCO3中，此CpA加到變性的底物蛋白質(zhì)中(10-100nmol，pH8.5，0.2mol/LN-ethylnorpholineHAc)，酶和底物的分子比為1:100，如果底物在此緩沖液中不溶解，則可在1％SDS(V/V)或6mol/L尿素中進(jìn)行。有時(shí)加正亮氨酸(norleucine，1mol/mol蛋白質(zhì))為內(nèi)標(biāo)。溶液在25℃保溫，隔0.5，1，4，16h，取一定量反應(yīng)液(1-5nmol)，加等體積1mol/LHAc停止酶作用，離心除去蛋白質(zhì)，上層液真空干燥，然后殘余物溶在氨基酸樣品緩沖液中進(jìn)行氨基酸分析。以正亮氨酸作校正，同時(shí)有相同程序的空白對(duì)照。如果在酶作用短時(shí)間后就釋放出大量的氨基酸，則改用低的CpA濃度和作用短時(shí)間(5，10，20，60min)取樣；相反，如果只有少量氨基酸釋放，則可加大酶/底物的比例，或37℃作用更長(zhǎng)的時(shí)間。(1)羧肽酶A(CpA)48

(2)羧肽酶B(CpB)從蛋白質(zhì)/肽的C端釋放Lys和Arg，CpB存放在－20℃時(shí)，非常穩(wěn)定。(3)羧肽酶Y(CpY)目前CpY有更廣泛的專一性和通用性，一般講它作用底物C端的疏水性氨基酸快些，作用于帶電荷的氨基酸慢些。此酶很穩(wěn)定，某些金屬離子(例如Cu2＋，Hg2＋)抑制酶活性。CpY制劑中可能污染有酵母蛋白酶A，這時(shí)可加胃蛋白酶抑制劑(pepstain)抑制，也可用EDTA抑制。CpY用量一般為底物的1/50～1/100，在25℃作用，于不同時(shí)間取反應(yīng)液酸化后分析游離的氨基酸。(4)羧肽酶P(CpP)CpP是種酸性羧肽酶，它貯存在pH5.5的50mmol/L吡啶醋酸緩沖液中，于-20℃，6個(gè)月內(nèi)非常穩(wěn)定。其作用于pH2.5的100mmol/L吡啶甲酸緩沖液中。(2)羧肽酶B(CpB)49二、化學(xué)降解法早年的化學(xué)降解法只能測(cè)定一個(gè)C端氨基酸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。而羧肽酶法雖能測(cè)到3～5個(gè)序列，但這是一個(gè)動(dòng)態(tài)演繹的方法，有可能錯(cuò)判。十多年前，蛋白質(zhì)化學(xué)家就開(kāi)始用類似Edman降解法從C端逐個(gè)測(cè)定氨基酸序列，每次國(guó)際蛋白質(zhì)會(huì)議都有報(bào)道，直到2019年才有商品儀器供應(yīng)。目前C端序列儀一般只能測(cè)定5個(gè)氨基酸殘基左右(這和蛋白質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)，有些可測(cè)到10個(gè)左右)，在nmol水平上；這與N端序列還有很大的差距(目前N端序列儀靈敏度在10pmol，可測(cè)到50個(gè)循環(huán))二、化學(xué)降解法50第六節(jié)蛋白質(zhì)中一些特殊肽段的檢出

一、含巰基肽的分離純化和分析巰基在蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能中具有重要作用，因此含巰基肽段的鑒定是蛋白質(zhì)化學(xué)不可缺少的部分。文獻(xiàn)上含Cys的肽常用同位素標(biāo)記的碘代乙酸處理，羧甲基化，然后在HPLC肽譜分析時(shí)跟蹤有標(biāo)記的肽段。鑒于用同位素在國(guó)內(nèi)不很方便，我們用4-乙烯吡啶標(biāo)記蛋白質(zhì)中的半胱氨酸，酶解后的肽譜，除用214nm檢出外，同時(shí)還用254nm檢出