分子生物學基因表達調(diào)控-兼容

基因表達調(diào)控

Geneexpression®ulation2幾個相關(guān)概念3一段特定的DNA序列生物體的基本遺傳單位

(Ageneisamolecularunitofheredityofalivingorganism)GeneisanamegiventosomestretchesofDNAandRNAthatcodeforapolypeptideorforanRNAchainthathasafunctionintheorganism.1.基因(Gene)42.基因表達(Geneexpression)First,theDNAonwhichthegeneresidesmustbetranscribedfromDNAtomessengerRNA(mRNA).Second,itmustbetranslatedfrommRNAtoprotein.將貯存在基因中的遺傳信息變成具有生物學活性蛋白質(zhì)或RNA的過程Inallorganisms,therearetwomajorstepsseparatingaprotein-codinggenefromitsprotein:Thegeneticcodeisthesetofchemicalsymbolsbywhichageneistranslatedintoafunctionalprotein.53.基因表達調(diào)控(Regulationofgeneexpression)在外環(huán)境作用下，細胞內(nèi)的特定因素控制特定基因表達的規(guī)律及其機制Includestheprocessesthatcellsusetoregulatethewaythattheinformationingenesisturnedintogeneproducts.主要內(nèi)容：轉(zhuǎn)錄水平的基因表達調(diào)控翻譯水平的基因表達調(diào)控染色體水平的基因表達調(diào)控67轉(zhuǎn)錄水平的基因表達調(diào)控對DNA的調(diào)控81.基因轉(zhuǎn)錄需要具備哪些條件？基因是一段特定的DNA序列基因表達：Gene(DNA）mRNAProteinATGATGATCGATCTATCGATCGATTAGAGGTAA轉(zhuǎn)錄mRNA—依照DNA序列合成mRNA的過程RNA聚合酶：負責合成RNA

需要識別及/或特定DNA序列—啟動轉(zhuǎn)錄

—終止轉(zhuǎn)錄基因序列：應該位于啟動位點與終止位點之間9我們再將基因完善如下：ATGACGATCGATCTATCGATCGATTAGAGGTAA轉(zhuǎn)錄mRNA—依照DNA序列合成mRNA的過程可見，—RNA聚合酶并不需要直接與基因的編碼序列結(jié)合—具備startpoint和terminator的DNA序列就可以被轉(zhuǎn)錄

稱這種序列為轉(zhuǎn)錄單位(transcriptionunit）StartpointTerminator啟動子PromoterAUG5-non-codingsequence3-non-codingsequence—具備完整轉(zhuǎn)錄單位的基因才能被轉(zhuǎn)錄10原核基因以操縱子為轉(zhuǎn)錄單位transcriptionStartpointtermination調(diào)控區(qū)信息區(qū)啟動子操作子串聯(lián)的結(jié)構(gòu)基因—多順反子順式作用元件一個操縱子是一個轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄調(diào)控也是以操縱子為單位的11可見，基因轉(zhuǎn)錄需要具備：完整的轉(zhuǎn)錄單位（啟動子-基因-終止子）RNA聚合酶122.啟動子可影響基因的轉(zhuǎn)錄啟動子可直接影響RNA聚合酶對轉(zhuǎn)錄的起始ATGACGATCGATCTATCGATCGATTAGAGGTAAStartpointTerminator啟動子Promoter-35區(qū)：T82G78A65C54A95-10區(qū)：T80A95T45A60A50T96Consensussequence(共有序列)+1轉(zhuǎn)錄方向-GTGTATTGACATGATAGAAGCACTCTACTATATTCTCAATAGGTCCACG--CACATAACTGTACTATCTTCGTGAGATGATATAAGAGTTATCCAGGTGC-+1-10-355'5'3'3'大腸桿菌的啟動子：13大腸桿菌啟動子有3個功能區(qū)：—起始部位(initiationsite)：+1區(qū)—結(jié)合部位(bindingsite)：-10區(qū)—識別部位(recognitionsite)：-35區(qū)-GTGTATTGACATGATAGAAGCACTCTACTATATTCTCAATAGGTCCACG--CACATAACTGTACTATCTTCGTGAGATGATATAAGAGTTATCCAGGTGC-+1-10-355'5'3'3'如果啟動子序列有變異，RNA聚合酶結(jié)合能力會發(fā)生變化—促進RNA聚合酶的結(jié)合能力（強啟動子）—減弱RNA聚合酶的結(jié)合能力（弱啟動子）真核基因的Ⅱ類啟動子：TATAboxCAATboxGCbox

增強子

核心元件

結(jié)構(gòu)基因-GCGC---CAAT---TATAInitiator,Inr起始子-3+5上游元件遠端調(diào)控區(qū)TATAAAA5-Y-Y-A+1-N-T/A-Y-Y-Y-3Y：C或TN：任意堿基T/A：T或A與位置、方向無關(guān)，一個基因可受多個增強子調(diào)控+1Startpoint啟動子：—位于基因的上游—啟動其下游基因的轉(zhuǎn)錄—決定轉(zhuǎn)錄方向機模板鏈15附：啟動子變異也會引起疾病例如，-地中海貧血患者在-珠蛋白基因與其遠端上游調(diào)控元件之間有一個SNP(AG)TAATAATGATAA轉(zhuǎn)錄因子GATA-1結(jié)合位點GATA-1GATA-1兩個結(jié)合位點競爭結(jié)合GATA-1轉(zhuǎn)錄因子TGATAATGATAA珠蛋白編碼基因從而干擾原有啟動子的活性，下調(diào)珠蛋白的表達水平16可見，啟動子的序列和位置對轉(zhuǎn)錄有影響啟動子的序列可影響RNA聚合酶的結(jié)合能力173.RNA聚合酶(RNApol.)的轉(zhuǎn)錄活性原核生物只有一種RNA聚合酶RNApol.全酶問：如果編碼RNA聚合酶的基因突變了會怎樣？18大腸桿菌的RNA

pol.全酶覆蓋-40~+20區(qū)域RNA聚合酶移動方向：35—RNA聚合酶是抗菌靶點例如：利福平—亞基肝素——亞基(體外)問：具備RNApol.和啟動子，基因一定能被轉(zhuǎn)錄嗎？194.調(diào)控蛋白參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)-35-10+1+20+28RNA聚合酶結(jié)合區(qū)阻遏蛋白結(jié)合區(qū)原核基因的操縱子：RNA聚合酶和阻遏蛋白結(jié)合區(qū)有部分是重疊的即：一旦阻遏蛋白先結(jié)合了，RNA聚合酶就無法轉(zhuǎn)錄

反之亦然20例：乳糖操縱子調(diào)控模式乳糖操縱子(Lacoperon)：阻遏蛋白負調(diào)控CAP正調(diào)控Catabolitegeneactivatorprotein,CAP(分解代謝物基因活化蛋白)IPOLacZLacYLacAStructuregenesRepressorgeneRepressorbindingsiteRNApol.bindingsiteCAPbindingsite乳糖操縱子結(jié)構(gòu)：21IPOLacZLacYLacAStructuregenesRepressorgeneCAP-bindingsitetranscriptionmRNANoexpression阻遏蛋白的結(jié)合阻礙RNApol的通過：22IPOLacZLacYLacAStructuregenesRepressorgeneCAP-bindingsiteExpressionX誘導物可解除阻遏蛋白的阻遏：23真核生物有三種RNA聚合酶—轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要是對RNApolII活性的調(diào)控—RNApolⅡ不能直接與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子復合物：為RNApolⅡ搭起了接近并結(jié)合DNA的“腳手架”也是決定基因是否啟動轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄強度的關(guān)鍵因素TBPRNAPolymeraseII+10+20Startpoint-10-20-30-40+1ATGRNAPolymeraseIIRNAPolymeraseII基因轉(zhuǎn)錄24小結(jié)：基因是一段DNA序列基因轉(zhuǎn)錄需要完整的轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄單位：“啟動子-基因-終止子”結(jié)構(gòu)框架啟動子是RNA聚合酶識別及/或結(jié)合位點RNA聚合酶活性直接影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白參與調(diào)控RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性總之，蛋白質(zhì)-DNA的相互作用都是在影響RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性25翻譯水平的基因表達調(diào)控對mRNA的調(diào)控261.核糖體定位到mRNA上啟動翻譯原核生物mRNA上的SD序列決定翻譯起始效率核糖體(ribosome)：是蛋白質(zhì)-rRNA復合物通過rRNA與mRNA互補配對方式結(jié)合到mRNA上SD序列(Shine-Dalgarnosequence)基本特點：一般位于mRNA上游距AUG約8-11nt位點由6個核苷酸組成的consensussequenceInE.coli,AGGAGG基本功能：負責招募核糖體定位到起始密碼處，啟動蛋白質(zhì)的合成互補序列：CCUCCU，位于16SrRNA的3-end被稱作anti-SDsequence在多順反子mRNA中，每一個蛋白編碼區(qū)都有一個AUG，在AUG上游都有一個SD序列AUGAUGAUGAUGSDSDSDSD核糖體可直接結(jié)合到mRNA上的任何一個SD序列上，并從其后的AUG開始啟動蛋白質(zhì)的翻譯SD序列與AUG之間的距離直接影響基因產(chǎn)物的翻譯效率XXXXXXXAUG7basesSDpromoterIL-2geneStartpointTranscriptionTranslationIL-2表達最高XXXXXXXXAUG8basesSDpromoterIL-2geneStartpointTranscriptionTranslationIL-2表達水平降低500倍因此，SD序列的位置在基因表達調(diào)控中起重要作用例如：30問題：SD序列與AUG之間的距離直接影響基因產(chǎn)物翻譯效率的本質(zhì)是什么？其實：是影響了核糖體精確定位到AUG上31Kozak序列(Kozaksequence)真核生物mRNA上有Kozak序列Kozak序列是真核mRNA上的一段序列Consensussequence：(gcc)gccRccAUGG一般是嘌呤(A或G)-6-5-4-3-2-1+1+2+3+4核糖體啟動翻譯需要識別Kozak序列但Kozak序列并不是核糖體結(jié)合位點(RBS)5’-capofmRNALocatedat32附：Kozak序列變異可引起疾病在意大利東南部的一個家庭：-球蛋白(+)mRNA的-6GC地中海貧血形成血紅蛋白的球蛋白比例錯誤：-鏈-鏈相對過剩不能形成四聚體-鏈與紅細胞膜結(jié)合并產(chǎn)生毒性這是第一例Kozak序列突變引起的疾病AUG作為翻譯起始密碼子是Kozak序列中重要的核苷酸+4G和-6G對于翻譯起始非常重要-1、-2位核苷酸并不保守，但對于Kozak序列的強度還是有作用33可見，核糖體的精確定位是翻譯的重要步驟原核SD序列、真核Kozak序列與核糖體定位有關(guān)342.mRNA本身也是翻譯調(diào)控的靶點原核生物的mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、降解偶聯(lián)進行RNApol大多數(shù)細菌mRNA都非常不穩(wěn)定—細菌mRNA的平均半衰期2min細菌的轉(zhuǎn)錄和翻譯有相似的速率在37℃條件下：mRNA轉(zhuǎn)錄：40nt/s≈13aa蛋白質(zhì)翻譯：15aa/s≈45nt35真核mRNA需要經(jīng)過剪接后運輸?shù)桨麧{—mRNA的運輸是受控制的細胞核細胞漿mRNAcaptail進入細胞漿的mRNA才有機會作為蛋白質(zhì)合成的模板留在核內(nèi)的RNA大約在1小時內(nèi)降解成小片段—大約只有20%的成熟mRNA有機會被運輸?shù)郊毎麧{中36真核mRNA的剪接是有選擇性的—剪接是一個基因產(chǎn)生多種mRNA的原因5...AAGUAAGU…..CURAY..(10-40)..(U/C)11NCAGG…3Intron

Exon

Exon

5-splicesite3-splicesiteBranchpointsequencePolypyrimidinetractConsensussequencesofsplicingsites:問：如果剪接位點變了會怎樣？動畫：mRNAsplicing37FGFR1Kinase-deficientFGFR1In1994-1996,—myworkinUCSFDNAcloningDNAsequencingGenefunctionassay

—tyrosinekinaseactivityRNaseprotectionassay例：FGFR1mRNA選擇性剪接產(chǎn)生一種激酶活性缺失型FGFR1WangLiying,etal.Anaturalkinase-deficientvariantofFGFR1.Biochemistry，1996,35(33):10134Lost111bp(for37aa)lengthofanexon38真核mRNA可被特異性阻抑或降解—siRNA誘導轉(zhuǎn)錄后沉默SmallinterfereRNA(siRNA)Lin-4miRNAtargets3-UTRofLin-14mRNA:3UTRLin-14mRNALin-4miRNALin-14蛋白質(zhì)siRNA是一種小雙鏈RNA，可以通過激活Dicer發(fā)揮定向切割靶RNA作用這種現(xiàn)象也叫轉(zhuǎn)譯抑制

(translationalinhibition)Lin-4miRNA是人們鑒定出的第一個microRNA分子Lin-4miRNA以不完全互補方式靶向Lin-14mRNA參與調(diào)控線蟲的發(fā)育時序Lee,R.C.;Feinbaum,R.L.;Ambros,V.(1993)."TheC.Elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14".Cell

75(5):843–85439為什么一個只有21nt的RNA分子起著如此重要的調(diào)節(jié)作用？—個別現(xiàn)象？2000年發(fā)現(xiàn)第二個miRNA—miRNAlet-7控制線蟲的發(fā)育時序人和果蠅有同源物參與多種癌癥的發(fā)生ReinhartB.J.etal.(2000)."The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans".Nature

403(6772):901–906.PasquinelliA.E.etal.(2000)."Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA".Nature

408(6808):86–89.—miRNA

的發(fā)現(xiàn)也是對中心法則中RNA次要的中介角色的重要補充40問：你怎么理解mRNA末端有非翻譯區(qū)？Un-translatedregion(UTR)ATGTGAInitiationorstartpointTermination+1CodingsequenceStartcodonStopcodon5-UTR3-UTRAnexonisanucleicacidsequencethatisrepresentedinthematureformofanRNAmolecule41真核mRNA的帽尾結(jié)構(gòu)參與蛋白翻譯—3-poly(A)尾縮短使mRNA易降解mRNA上的“AAUAAA”是加尾信號加尾信號后30bp處加上polyA尾(200-300nt)問：在一個基因的DNA序列中是否含有polyA尾的模板序列？動畫：lifecycleofanmRNA42小結(jié)：核糖體與mRNA的結(jié)合是調(diào)控要點之一原核mRNA的SD序列和真核mRNA的Kozak序列都是與核糖體啟動翻譯有關(guān)mRNA自身的穩(wěn)定性及定位也影響蛋白翻譯miRNA直接在mRNA水平阻抑蛋白翻譯總之，真核細胞有核，mRNA水平的調(diào)控環(huán)節(jié)更多比原核細胞多包括：選擇性運輸，選擇性剪接，帽尾結(jié)構(gòu)、miRNA阻抑，等ProteinDNARNA43染色體水平的基因表達調(diào)控轉(zhuǎn)錄前的染色體變構(gòu)44真核染色體：DNA纏繞在組蛋白上形成染色體真核染色體多且結(jié)構(gòu)致密人：23對染色體

也就是說：染色體是否適當?shù)乃山庾儤?gòu)對直接影響基因表達問：你知道原核生物的染色體結(jié)構(gòu)嗎？Protein-membranecoreorscaffoldSupercoileddomain50-100kbindependentloopsordomains負超螺旋DNA以蛋白質(zhì)-細胞膜為支架45轉(zhuǎn)錄前的調(diào)控主要是對染色質(zhì)變構(gòu)的調(diào)節(jié)其實，—就是有效暴露待轉(zhuǎn)錄的DNA序列影響因素：組蛋白與DNA的親和性DNA甲基化程度目的：—增加轉(zhuǎn)錄因子和RNApol對DNA的易接近性組蛋白乙酰化：“l(fā)oosen”核小體(ribosome)使核心組蛋白從DNA上移位暴露一些供其他蛋白結(jié)合的位點46問：一旦組蛋白發(fā)生變異可能會出現(xiàn)什么事件？那么，當H5替代H1組裝核小體如何？已知：H1從核小體上的解離是釋放DNA的重要因素與DNA的親和性：H5>H1472012年8月(Nature)：基因表達受到兩類蛋白的共同控制：—轉(zhuǎn)錄因子—表觀遺傳調(diào)控子DNA甲基化及組蛋白乙酰化都屬于表觀調(diào)控的結(jié)果DNA甲基化能引起：—染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變—DNA構(gòu)象改變—DNA穩(wěn)定性改變—DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變——Early-stageepigeneticmodificationduringsomaticcellreprogrammingbyParp1andTet2.Nature,488:652–655(30Aug2012)調(diào)控基因表達48通過基因組重編程誘導出多能干細胞（iPS）兩位科學家剛剛因此獲2012年諾貝爾獎ShinyaYamanakaBorn:1962Affiliationatthetimeoftheaward:KyotoUniversity,Kyoto,Japan,GladstoneInstitute,SanFrancisco,CA,USASirJohnB.GurdonBorn:1933Affiliationatthetimeoftheaward:GurdonInstitute,Cambridge,UnitedKingdomTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2012Forthediscoverythatmaturecellscanbereprogrammedtobecomepluripotent49Heasked:arethecellsofanadultorganismgeneticallyidenticaltothefertilizedeggfromwhichtheyarederived?Hehypothesisedthatitsgenomemightstillcontainalltheinformationneededtodriveitsdevelopmentintoallthedifferentcelltypesofanorganism.體細胞核去核卵細胞In1962,hetestedthishypothesis.Thenucleusofthematurecellhadnotlostitscapacitytodrivedevelopmentto