光譜分析技術(shù)課件

第五章

常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

第一節(jié)光譜分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析第三節(jié)電泳技術(shù)第四節(jié)層析技術(shù)第五節(jié)自動(dòng)生化分析技術(shù)第五章

常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

第一節(jié)光譜分析技術(shù)1

光譜分析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)吸收或發(fā)射輻射能而建立起來的一類分析方法，因不同分子的原子和原子團(tuán)，其發(fā)射光譜和吸收光譜不同，而相同的物質(zhì)在一定條件下，其發(fā)射光譜和吸收光譜的強(qiáng)度與該物質(zhì)的含量成正比關(guān)系。因此可對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，此類技術(shù)稱為光譜分析技術(shù)。光譜分析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)吸收或發(fā)射輻射能而建2光譜分析技術(shù)是一種最常用的生化檢驗(yàn)技術(shù)，它主要包括：

吸收光譜分析：可見、紫外、紅外分光光度法和原子吸收分光光度法

散射光譜分析：散射比濁法和透射比濁法

發(fā)射光譜分析：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法

光譜分析技術(shù)是一種最常用的生化檢驗(yàn)技術(shù)，它主3光是一種高速傳播的電磁波，光的波長（λ）的常用單位是納米（nm），可見光波長400～760nm，＜400nm稱為紫外光，＞760nm稱為紅外光，波長愈短，能量愈大。可見、紫外吸收光譜是由于多原子分子的價(jià)電子在電磁輻射的作用下，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，這種因物質(zhì)分子對(duì)輻射能的選擇性吸收而得到的光譜稱為吸收光譜。第一節(jié)吸收光譜分析光是一種高速傳播的電磁波，光的波長（λ）的常4吸收光譜分析法包括可見、紫外、紅外和原子吸收分析法。其中最常用的是可見光分析法，也被不嚴(yán)格地稱為比色分析法，準(zhǔn)確的名稱應(yīng)是可見光分光光度法。

用于比色分析的光源與被測溶液的顏色應(yīng)為互補(bǔ)色。吸收光譜分析法包括可見、紫外、紅外和原子吸收5可見、紫外吸收光譜用于定量分析的依據(jù)是光吸收定律，即Lambert-Beer定律，它是吸收光譜法的基本定律?？梢?、紫外吸收光譜用于定量分析的依據(jù)是光吸收定律，6

一、Lambert-Beer定律

1.Lambert定律當(dāng)一束強(qiáng)度為Io的單色光透過某種吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，則透過的光線為It。當(dāng)溶液濃度不變時(shí)，透過的液層愈厚，則光線強(qiáng)度的減弱愈顯著。ItI0一、Lambert-Beer定律ItI07用數(shù)學(xué)式表示為：

透光度隨溶液厚度增加而減少，其關(guān)系是透光度的負(fù)對(duì)數(shù)（－lgT，吸光度A）與溶液厚度成正比，即用數(shù)學(xué)式表示為：8

2.Beer定律當(dāng)一束強(qiáng)度為Io的單色光透過某種吸光溶液后，若液層厚度不變，而濃度不同時(shí)，溶液的濃度愈大，則透過光的強(qiáng)度愈弱，其定量關(guān)系A(chǔ)=K·C。

當(dāng)液層厚度不變時(shí)，吸光度與溶液濃度成正比，這就是Beer定律。2.Beer定律當(dāng)一束強(qiáng)度為Io的單色光9

3.Lambert-Beer定律合并Lambert定律與Beer定律可得

A=K·L·C

說明吸光物質(zhì)對(duì)單色光吸收的強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度和液層厚度成正比。

吸光系數(shù)K的物理意義是吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度，在給定條件下（波長、溶液性質(zhì)、濃度）吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)，K值愈大，能測定的濃度C愈小，則靈敏度愈高。3.Lambert-Beer定律10

二、比色分析儀器

即可見光分光光度計(jì)，各類分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)和原理基本相同，一般包括光源、單色器、吸收池、檢測器和顯色器五大部分。

1.光源可見光常用鎢燈，現(xiàn)用鹵鎢燈；紫外光常用氫燈。

2.單色器可用濾光片、棱鏡、光柵。

3.吸收池

(比色杯)

4.檢測器光電管或光電倍增管

5.顯示器指針式或數(shù)字式二、比色分析儀器11三、比色分析的特點(diǎn)

1.靈敏度高被測定物質(zhì)的最低濃度一般為10－5～10－6mol/L。

2.測定快速、簡便。

3.應(yīng)用范圍廣一些無色物質(zhì)在一定條件下與顯色劑反應(yīng)，可生成有色物質(zhì)。三、比色分析的特點(diǎn)12四、比色分析的定量方法

（一）對(duì)比法

又稱標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比法，通常在測定未知濃度樣品的同時(shí)，測定一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液作比較，然后分別測定兩者的吸光度。

AS=KLSCS

AR=KLRCR四、比色分析的定量方法13

因測定成分相同，故K值相同，比色時(shí)用同樣規(guī)格的比色皿故LS=LR，所以比色分析中測定標(biāo)準(zhǔn)液與未知液吸光度的比值也就等于其濃度的比值，即若標(biāo)準(zhǔn)液與樣品用量不等時(shí)，則再乘。用對(duì)比法進(jìn)行定量時(shí)，為了減少誤差，選用標(biāo)準(zhǔn)液濃度應(yīng)盡可能接近待測樣品濃度。因測定成分相同，故K值相同，比色時(shí)用同樣規(guī)格14

（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線法

配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)液，按一定操作方法顯色后，用選定的波長分別測定它們的吸光度，然后以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上標(biāo)出各坐標(biāo)點(diǎn)，通過連接各點(diǎn)，使其成一直線，即A-C曲線。（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線法15·····A0.60.50.40.30.20.124681012C·····A2416

注意事項(xiàng)

1.測定條件發(fā)生變化時(shí)（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。

2.標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。

3.當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定。

4.標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的條件完全一致。注意事項(xiàng)17

用波長200～400nm的紫外光譜測定無色物質(zhì)的方法稱為紫外分光光度法。芳香族類及含有共軛雙鍵的烯烴、炔烴等不飽和烴類，在200～400nm波長范圍具備光吸收特性，故不需經(jīng)顯色反應(yīng)就能直接利用紫外分光光度法測定，其選擇性和靈敏度均高于比色分析法。五、紫外分光光度法用波長200～400nm的紫外光譜測定無色物18

（一）單組分測定原理其基本原理與可見分光光度法相同，除可采用前述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法和對(duì)比法外，還可采用：

1.吸光系數(shù)法對(duì)于單一組分的純物質(zhì)，只要已知其摩爾吸光系數(shù)，測得吸光度（A）后，可直接按下列公式計(jì)算物質(zhì)的濃度。（一）單組分測定原理19

例：已知維生素B12的水溶液在361nm波長處的ε為28056，2ml維生素B12的水溶液用蒸餾水稀釋到4ml，用1cm比色杯測得溶液的吸光度為0.414，求該維生素B12水溶液的濃度。例：已知維生素B12的水溶液在361nm波長20（二）多組分混合物的測定原理多組分指同一試樣中含兩種或兩種以上待測組分，測定時(shí)可根據(jù)各組分吸收光譜的重疊程度來確定定量方法。

1.各組分吸收峰不相互重疊按單組分測定方法

2.各組分吸收峰相互重疊

可采用解聯(lián)立方程法，等收吸雙波長法、系數(shù)光譜法。（二）多組分混合物的測定原理21

（一）火焰光度法是利用火焰使金屬元素激發(fā)，能發(fā)射出特征譜線的特點(diǎn)進(jìn)行測定的一種方法。

1.基本原理

某些金屬元素的基態(tài)原子受到火焰激發(fā)后，其外層電子獲得能量而從基點(diǎn)躍遷到激發(fā)態(tài)，接著它們又以發(fā)射光譜的形式釋放出所獲得的能量，而返回基態(tài)，在相同條件下，同一元素所釋放的單位能量相同，故能形成固定光譜。六、其它光譜分析技術(shù)（一）火焰光度法六、其它光譜分析技術(shù)22

如鈉發(fā)射光譜波長589nm，鉀發(fā)射光譜波長767nm。由于火焰供給的能量不強(qiáng)，只能激發(fā)堿金屬和堿土金屬元素，生化檢驗(yàn)中常用于鉀、鈉的測定。元素的發(fā)射譜線強(qiáng)度與該元素濃度的關(guān)系可表示為I=a·c·b

a是與試樣組成，激發(fā)溫度，激發(fā)電位有關(guān)的常數(shù)，b為自吸收系數(shù)，當(dāng)濃度很低時(shí)，b≈1，所以上式可寫成I=a·c，即發(fā)射譜線強(qiáng)度與測定元素濃度成正比。如鈉發(fā)射光譜波長589nm，鉀發(fā)射光譜波長23

2.干擾因素（1）共存元素的干擾

①共存元素產(chǎn)生的輻射干擾由于火焰使標(biāo)本中其他元素激發(fā)，當(dāng)發(fā)射時(shí)光譜接近，甚至重疊時(shí)，可產(chǎn)生干擾，引起誤差，如鈣對(duì)鋰、鈉的測定干擾明顯。②陽離子的干擾主要是通過對(duì)待測陽離子的電離度產(chǎn)生影響，造成發(fā)射時(shí)強(qiáng)度的改變。2.干擾因素24③陰離子的干擾因陰離子可與某些被測陽離子在火焰溫度下形成僅能緩慢蒸發(fā)的化合物而抑制了原子激發(fā)，一般用釋放劑來消除干擾，與干擾陰離子牢固結(jié)合。（2）火焰對(duì)測定的影響火焰是激發(fā)光源，火焰的純度和燃燒狀態(tài)，穩(wěn)定性，可直接影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，因此，要求所用燃料燃燒時(shí)火焰背景色淺，溫度高，無雜色。③陰離子的干擾因陰離子可與某些被測25（3）標(biāo)準(zhǔn)品的影響由于生物樣品中成分復(fù)雜，定量測定中會(huì)互相干擾影響測定的準(zhǔn)確性，所以，如果以單純的被測物質(zhì)預(yù)制標(biāo)準(zhǔn)液則與血清樣品的結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，故應(yīng)使用血清作為標(biāo)準(zhǔn)以消除影響。（3）標(biāo)準(zhǔn)品的影響26（二）原子吸收分光光度法

1.基本原理待測元素經(jīng)原子蒸氣發(fā)生器轉(zhuǎn)化成氣態(tài)原子（處于基態(tài)），由空心陰極燈提供的待測元素的共振線經(jīng)過待測元素的蒸氣，共振輻射強(qiáng)度被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子吸收而減弱，其吸收規(guī)律遵循Beer定律。

共振線：電子從基態(tài)躍遷至第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)所吸收的譜線為共振吸收線。簡稱為共振線。（二）原子吸收分光光度法27

2.應(yīng)用在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要用于體液、毛發(fā)、指甲等組織鈣、鎂、鐵、鈉、鋅、鋁、汞、鉛、砷等多種元素的測定。優(yōu)點(diǎn)：①選擇性好受干擾少，原子吸收是光的窄帶吸收，僅0.001～0.01nm，而分子對(duì)光的吸收是寬帶吸收，達(dá)幾個(gè)nm。②靈敏度高能測定10－9～10－6g的元素。③測定快速、簡便④應(yīng)用范圍廣只需更換不同空心陰極燈，儀器昂貴。2.應(yīng)用在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要用于體28

（三）熒光分析法利用某些物質(zhì)光致發(fā)光的特性，籍此對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性，定量分析的方法。

1.基本原理

某些物質(zhì)的分子吸收了光能，從基態(tài)躍遷至某一電子激發(fā)態(tài)中的某一振動(dòng)能級(jí)，處于激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)中的分子通過運(yùn)動(dòng)或與其他分子的碰撞而將吸收過多的能量輸給其他分子，并返回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，同時(shí)發(fā)射熒光，躍遷到基態(tài)發(fā)射熒光，在一定濃度范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度與溶液濃度呈線性關(guān)系。（三）熒光分析法29

2.影響熒光強(qiáng)度的因素（1）溶劑

增大溶劑的極性，可時(shí)電子躍遷的能量降低，熒光增強(qiáng)。（2）溫度、pHT↑分子碰撞頻率↑，因此熒光強(qiáng)度隨溫度升高而減弱。pH可影響化合物電離或使熒光物質(zhì)水解，如苯胺在pH7～12溶液中主要以分子形式存在，產(chǎn)生藍(lán)色熒光，而在pH<7或>13的溶液中以離子形式存在，不能產(chǎn)生熒光。2.影響熒光強(qiáng)度的因素30（3）激發(fā)光和發(fā)射光在定量測定時(shí)，一般應(yīng)選擇熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長（λex）和最大熒光波長（λem），但有些熒光物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，受激發(fā)光照射后易分解，縮短樣品照射時(shí)間，改變激發(fā)光波長。（4）物質(zhì)濃度的影響熒光分析品適合稀溶液，因熒光物質(zhì)濃度高，分子間碰撞增加，使熒光強(qiáng)度減弱，這種現(xiàn)象稱為自熄滅，自熄滅現(xiàn)象隨濃度增加而增強(qiáng)。（3）激發(fā)光和發(fā)射光在定量測定時(shí)，一般應(yīng)31

3.儀器與測定方法作為熒光分析的儀器有光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)光電熒光計(jì)的結(jié)構(gòu)與光電比色計(jì)很相似，不同之處是檢測器與光線成直角，并多一塊濾光片。如濾光片改為棱鏡或光珊作單色器，就和可見紫外發(fā)光光度計(jì)相似而成熒光分光光度計(jì)。3.儀器與測定方法作為熒光分析的32儀器的組成部件的比

光源單色器測定池 光敏元件檢測器光電比色計(jì)鎢燈濾光片玻璃光電池檢流計(jì)

(二面透光)光電管 光電熒光計(jì)鹵鎢燈濾光片玻璃光電管檢流計(jì)

(300～700nm)兩塊(四面透光)檢流計(jì)可見紫外鎢燈光柵或棱鏡分光光度計(jì)(400～760nm)玻璃光電管檢流計(jì)氫燈石英光電倍增管自動(dòng)記錄

(200～400nm)熒光分光氙弧燈光柵或棱鏡玻璃光電倍增管自動(dòng)記錄光度計(jì) (200～700nm)石英 氙弧燈發(fā)射的強(qiáng)烈紫外線對(duì)人眼有害。儀器的組成部件的比 光源33

熒光分析優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高比可見紫外吸收光譜高103～104倍。

②特異性強(qiáng)通過選擇合適的激發(fā)光波長和熒光波長可避開其它物質(zhì)干擾。

③操作簡便、快速、重現(xiàn)性好

④樣品用量少熒光分析優(yōu)點(diǎn)：34不足之處：①應(yīng)用范圍有一定局限性，因許多物質(zhì)不能產(chǎn)生熒光。②對(duì)測定條件要求嚴(yán)格，如試劑、溶劑不應(yīng)含有熒光物質(zhì)。③儀器價(jià)格較貴熒光分析法在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中可用于測定類固醇激素（腎上腺皮質(zhì)激素）及代謝產(chǎn)物，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（兒茶酚胺，5-HT）某些維生素（VitA，B族）。不足之處：35

電化學(xué)分析是一種以溶液電化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)測定物質(zhì)含量的分析方法。按測定量的電化學(xué)參數(shù)的不同，可分為電位法、電導(dǎo)法、庫侖法、極譜法和伏安法等，下面主要介紹電位法中的離子選擇電極法。第二節(jié)電化學(xué)分析電化學(xué)分析是一種以溶液電化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)測定物36是一種電化學(xué)敏感器，它的電勢與溶液中給定離子的濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，故可以通過簡單的電位測量，直接測定溶液中離子活度。

離子濃度與離子活度的關(guān)系

a=f.c

在稀溶液中（10－4mol/L以下）活度系數(shù)接近1。離子選擇電極（ionselectiveelectodeISE）是一種電化學(xué)敏感器，它的電勢與溶液中給定離37

ISE分析法的優(yōu)點(diǎn)：

1.是一種直接的非破壞性分析方法，可反復(fù)進(jìn)行，不受樣品溶液顏色、渾濁等因素的干擾。

2.分析速度快，單次分析通常只1～2min

3.測量范圍寬，4～5個(gè)數(shù)量級(jí)

4.操作簡便

5.測量特定離子活度，對(duì)臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)更有實(shí)用意義ISE分析法的優(yōu)點(diǎn)：38

ISE大都屬于膜電極，膜中含有與待測離子相同的離子。膜的內(nèi)表面與具有相同離子的固定濃度溶液接觸，其中插入一內(nèi)參比電極，當(dāng)膜的外表面與待測離子溶液接觸時(shí)，引起膜電位的改變。由于電極膜材料、制備方法不同，使電板的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度也不同。一、ISE分析法的基本原理一、ISE分析法的基本原理ISE大都屬于膜電極，膜中含有與待測離子相39

膜電位的產(chǎn)生：將電極插入待測離子溶液中時(shí)，由于離子的交換和擴(kuò)散作用，改變了兩相中原有的電荷分布，因而存在一定的電位差，因?yàn)閮?nèi)充溶液中有關(guān)離子的濃度恒定，內(nèi)參比電極的電位固定，所以ISE的電位（E）只隨離子活度不同而改變，其電位可用Nernst方程式表示。

膜電位的產(chǎn)生：將電極插入待測離子溶液中時(shí)，由于離子的40

ISE的E值不能直接測定，必須將ISE與參比電極浸入被測溶液中組成原電池，然后通過電動(dòng)勢來測定E值。

參比電極：是指在溫度、壓力恒定的條件下，當(dāng)被測溶液離子濃度有所改變時(shí)，電極電位保持不變的電極。ISE的E值不能直接測定，必須將ISE與參比41離子選擇電極晶體膜電極均相膜電極非均相膜電極剛性基質(zhì)電極流動(dòng)載體電極非晶體膜電極基本電極氣敏電極敏化電極酶電極二、離子選擇電極的分類離子選擇電極晶體膜電極均相膜電極非均相膜電極剛性基質(zhì)電極流動(dòng)42（一）晶體膜電極

其敏感膜為金屬微溶鹽，經(jīng)加壓成片，制成單晶、多晶或混晶體電極敏感膜，如氟電極，其敏感膜為LaF3單晶片。（二）非晶體膜電極

1.剛性基質(zhì)電極其敏感膜為玻璃，故稱為玻璃電極。成分一般為Na2O-AI2O3-SiO2改變這三種成分的配合比例，分別制出對(duì)Li+、Na+、K+、Ag+的離子選擇電極。（一）晶體膜電極43

2.流動(dòng)載體電極其敏感膜是由溶解在與水不相混溶的有機(jī)溶劑中的離子締合劑或混合劑作為離子交換體，再將此溶液滲透在具有惰性，微孔性和疏水性的塑料薄膜內(nèi)。（三）氣敏電極

是基于界面化學(xué)反應(yīng)對(duì)氣體敏感的電極，它是在一般的離子選擇電極的基礎(chǔ)上，再覆蓋一層疏水的透氣膜（如聚四氟乙烯），如CO2、NH3電極。2.流動(dòng)載體電極其敏感膜是由溶解44（四）酶電極

它由離子敏感膜和覆蓋在表面含有酶的酶涂層膠組成，敏感膜對(duì)待測物的酶促反應(yīng)有選擇性響應(yīng)，如尿素酶電極。（四）酶電極45

1.響應(yīng)范圍及檢測下限：響應(yīng)范圍是指電極對(duì)待測離子的響應(yīng)符合Nernst式的線性區(qū)，此范圍越寬越好，一般在4～7個(gè)數(shù)量級(jí)之間，檢測F限是指能夠檢測被檢離子的最低濃度一般在10-5～10-7mol/L。

2.選擇性

是指電極對(duì)待測離子和共存干擾離子的響應(yīng)程度的差異。常用選擇性系數(shù)或選擇比系描述，選擇性系數(shù)越小，表示電極選擇性越強(qiáng)。三、離子選擇電極的性能1.響應(yīng)范圍及檢測下限：響應(yīng)范圍是指電極對(duì)46

3.響應(yīng)斜率和轉(zhuǎn)換系數(shù)

ISE在Nevnet響應(yīng)范圍內(nèi)被測離子活度變化10倍所引起的電報(bào)電位變化的數(shù)值，即響應(yīng)斜率（S）。從理論上說，但對(duì)某一ISE來說，實(shí)際S值與理論S值并不完全相符，其偏差用轉(zhuǎn)換系數(shù)表示，一般轉(zhuǎn)換系數(shù)達(dá)到理論值90％以上的電極性能較好。

4.電極壽命取決于電極制作材料，結(jié)構(gòu)和使用保管情況。3.響應(yīng)斜率和轉(zhuǎn)換系數(shù)ISE在Ne47

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其電位值Es，繪制Es-lgc標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同條件下測定樣品溶液電位值Ex。

2.電極校正法用標(biāo)準(zhǔn)溶液校正ISE，制成直讀式電儀表。四、IES的分析定量方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度48

1.電動(dòng)勢測量，對(duì)于一價(jià)離子的響應(yīng)，電勢測量每差1mV引起濃度的相對(duì)誤差為4％，對(duì)于二價(jià)離子則為8％，因此對(duì)于測量電勢的儀器精度要求達(dá)到0.1mV。

2.溫度

Nernst公試中的斜率，內(nèi)參比電極的電信號(hào)，以及離子活度等都與溫度有關(guān)，因此在整個(gè)測量過程中應(yīng)保持溫度恒定。五、ISE分析方法的誤差1.電動(dòng)勢測量，對(duì)于一價(jià)離子的響應(yīng)，電勢49

3.pH

溶液pH值可影響被測離子在溶液中的存在形式，從而影響相應(yīng)離子的活度，如LaF3電極測定F－時(shí)，如pH＜5，F(xiàn)－則會(huì)生成HF，使結(jié)果偏低。

4.滯后效應(yīng)

使用ISE若先測濃溶液后，再測稀溶液時(shí)電位平衡緩慢并出現(xiàn)誤差，這一現(xiàn)象稱為“滯后效應(yīng)”。3.pH溶液pH值可影響被測離子50一、電泳的基本原理（一）

電泳的概念溶液中帶電顆粒在直流電場中向電荷相反方向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。利用電泳現(xiàn)象對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)叫電泳技術(shù)。第三節(jié)

電泳技術(shù)一、電泳的基本原理第三節(jié)

電泳技術(shù)51電泳技術(shù)的應(yīng)用始于1937年，瑞典Tiselius利用界面電泳將血清蛋白質(zhì)分離成五種成分。

1948年Wieland發(fā)明紙電泳，使電泳技術(shù)大為簡化。此后，電泳技術(shù)發(fā)展迅速，特別是電泳技術(shù)與層析法，免疫學(xué)方法的結(jié)合，使其分辨率達(dá)到mg/ml水平，成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的一種重要分析技術(shù)。電泳技術(shù)的應(yīng)用始于1937年，瑞典Tisel52（二）

溶液中粒子的帶電狀態(tài)蛋白質(zhì)分子電離時(shí)有帶正電荷的氨基，也有電離帶負(fù)電荷的羧基，故蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。在酸性條件下，羧基電離受抑制，－NH2→-NH3+

帶正電在堿性條件下，羧基電離增強(qiáng)，－COOH→－COO－帶負(fù)電。（二）

溶液中粒子的帶電狀態(tài)53

（三）

電泳遷移率

指帶電粒子在單位電場強(qiáng)度作用下的電泳速度，通常用μ表示

μ=V/EV為粒子移動(dòng)速度（cm/s）E為電場強(qiáng)度（V/cm）遷移率取決于帶電粒子的性質(zhì)（粒子所帶電量Q，粒子大小r形狀）介質(zhì)粘度η，對(duì)于球狀分子，根據(jù)Stoke定律

V=QE/6πrηU=Q/6πrη（三）

電泳遷移率54在實(shí)際測定中，電泳速度V以單位時(shí)間t（秒）內(nèi)移動(dòng)的距離d（厘米）表示

V=d/t（cm/s）電場強(qiáng)度E以單位長度I（厘米）上所施加的電勢差V（伏特）表示

E=V/I（V/cm）故u=V/E=（d/t）/（V/I）

=d×I/V×t（cm2/v.s）通過測量d,l,v,t便可計(jì)算出顆粒的遷移率。在實(shí)際測定中，電泳速度V以單位時(shí)間t（秒）內(nèi)55由于不同的帶電粒子其遷移率的不同，因此在同一電場中的移動(dòng)距離不同，故能將其分離，根據(jù)公式

dA=V.t/l×μAdB=V.t/l×μBA、B移動(dòng)距離差為

Δd=(dA—dB)=（dA—dB）×V.t/l

分離距離與電壓和電泳時(shí)間成正比，與支持物長度成正比。由于不同的帶電粒子其遷移率的不同，因此在同一56二、電泳的分類和電泳儀（一）電泳的分類1.根據(jù)被分離樣品的多少分析電泳，制備電泳。2.根據(jù)電泳電壓的高低常壓電泳，高壓電泳。3.根據(jù)是否使用支持介質(zhì)自由電泳，區(qū)帶電泳。4.根據(jù)電泳系統(tǒng)的組成是否均一連續(xù)電泳，不連續(xù)電泳。二、電泳的分類和電泳儀57

（二）電泳儀

由直流電源和電泳槽兩部分組成。1、直流電源將交流電源經(jīng)整流，濾波后獲得。分為

（1）恒壓電源電泳過程中的電壓恒定不變。但電泳過程中的熱效應(yīng)，降低外周電路的電阻，使電流慢慢增大。（2）恒流電泳電泳過程中的電流恒定不變。用這種電流的輸出電壓可隨外周阻力減少而減少，從而保持電流恒定。（3）恒功率電源電泳中輸出功率恒定不變。主要用于等電聚焦電泳。（二）電泳儀582.電泳槽盛裝緩沖液和進(jìn)行電泳分析的場所，一般用塑料和有機(jī)玻璃制成，它包括電極，緩沖液槽，電泳支架，透明蓋組成。電泳槽的外形有水平式，垂直式，圓盤式等多種。電極應(yīng)具有良好的導(dǎo)電性，抗腐蝕性和抗電解作用。以鉑金材料最為理想，最好貫穿整個(gè)緩沖液槽。2.電泳槽盛裝緩沖液和進(jìn)行電泳分59三、影響電泳的因素（一）緩沖液維持電泳介質(zhì)pH恒定，并起導(dǎo)電作用。1.組成由弱酸和弱酸鹽組成，常用的有磷酸鹽，硼酸鹽，巴比妥鹽和三羥甲基氨基甲烷（Tris）等，其中巴比妥緩沖液用的最多，由巴比妥鈉和巴比妥組成。三、影響電泳的因素60選擇緩沖液時(shí)應(yīng)考慮的因素：（1）化學(xué)性能穩(wěn)定，不易水解。（2）緩沖液的pH應(yīng)與弱酸的pK值接近，有較強(qiáng)緩沖能力。（3）緩沖液中正負(fù)離子應(yīng)有相近的遷移率，避免電暈出現(xiàn)正負(fù)離子分布不均。（4）緩沖液的離子應(yīng)該是一價(jià)的，多價(jià)離子有較厚的雙電層，移動(dòng)性差。（5）緩沖液的電導(dǎo)率要低，避免通電時(shí)產(chǎn)生較多的熱。選擇緩沖液時(shí)應(yīng)考慮的因素：612.pH

緩沖液pH決定了蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，電泳時(shí)應(yīng)選擇一個(gè)合適pH，使各種蛋白質(zhì)在這一pH時(shí)凈電荷差別最大以利于分離。血清蛋白醋酸纖維薄膜電暈常用pH8.6的巴比妥緩沖液。各種蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。緩沖液pH的計(jì)算pH=pKa+lg([鹽]/[酸])電泳過程水會(huì)發(fā)生電離。正極：2OH－→H2O＋1/2O2↑＋2epH↓負(fù)極：2H＋＋2e→H2↑pH↑故電泳2～4次后應(yīng)將緩沖液正極交換，減少這種影響。2.pH緩沖液pH決定了蛋白質(zhì)的帶623.離子強(qiáng)度是指溶液中各種離子的摩爾濃度（Ci）與其電荷數(shù)平方（Zi2）乘積總和的1/2。即

I=1/2∑CiZi2I的單位是mol/L。如0.1mol/LNaCLI=0.1mol/L0.2mol/LMgCL2I=0.6mol/L

對(duì)于緩沖液I計(jì)算，由于弱酸的電離度很低，一般只計(jì)算鹽的。3.離子強(qiáng)度是指溶液中各種離子的摩爾63

I愈大，緩沖能力越大，pH越穩(wěn)定，但緩沖液所載分電流增加，樣品所栽的電流減少，電泳速度減慢，導(dǎo)電能力增加，產(chǎn)熱增加。

I過小，緩沖能力小，pH不穩(wěn)定，緩沖液所載分電流減少，樣品所載分電流增加，緩沖液粘度系數(shù)降低，電泳速度加快。但樣品在支持物上擴(kuò)散嚴(yán)重，分辨率降低。兼顧兩方面的影響，一般在0.05~0.1mol/L。I愈大，緩沖能力越大，pH越穩(wěn)定，但緩沖液所64

（二）支持介質(zhì)對(duì)支持介質(zhì)的基本要求是具有化學(xué)惰性，不與被分離的樣品或緩沖液起化學(xué)反應(yīng)，并具有一定的堅(jiān)韌度。

1.吸附使被分離樣品滯留，而降低電泳速度，造成拖尾而使分辨率降低。

2.電滲電泳過程中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲。實(shí)際上是電泳材料表面的電荷引起水的定向移動(dòng)。當(dāng)電滲作用方向與電泳方向一致，電泳速度加快，順?biāo)兄邸．?dāng)電滲作用方向與電泳方向相反，電泳速度減慢，逆水行舟。（二）支持介質(zhì)對(duì)支持介質(zhì)的基本要求是具有化65四、常用電泳技術(shù)區(qū)帶電泳是目前應(yīng)用最廣泛的一種電泳技術(shù)，區(qū)帶電泳的支持介質(zhì)常用的有濾紙，醋酸纖維薄膜，凝膠等。（一）濾紙電泳（PE）是應(yīng)用最早的支持介質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：材料價(jià)廉易得，有一定機(jī)械強(qiáng)度。缺點(diǎn)：電泳時(shí)間長，8～10h，吸附作用大，造成拖尾而降低了分辨率，目前已淘汰。

四、常用電泳技術(shù)66（二）醋酸纖維薄膜電泳（CAE）

1957年Kohn首先采用，醋酸纖維素是將纖維素分子中葡萄糖單體上的羥基乙?；纬衫w維素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶劑溶解，涂成均勻薄膜。優(yōu)點(diǎn)：對(duì)蛋白質(zhì)吸附作用很小，分辨率高，區(qū)帶清晰，不吸附燃料，區(qū)帶周圍燃料可完全清掉，檢測靈敏度較高，樣品用量少0.3~2μl，電泳時(shí)間短20min~1小時(shí)，可透明，便于用光密度掃描儀定量。缺點(diǎn)：有輕度電滲作用，吸水性較差，較脆。（二）醋酸纖維薄膜電泳（CAE）67

（三）瓊脂糖凝膠電泳（AGE）瓊脂糖是從瓊脂中分離得到的一種多糖。主要由半乳糖和L-3，6-脫水半乳糖構(gòu)成。常用濃度0.5~1.0%。優(yōu)點(diǎn)：吸附作用，電滲作用很小，故分辨率重現(xiàn)性好，應(yīng)用廣，同工酶，脂蛋白，免疫電泳，樣品用量少0.6~3.0μl，電泳時(shí)間短30min~1h。透明度好，電泳后可直接掃描定量，也可烘干制成薄膜。缺點(diǎn)：電泳完畢后區(qū)帶易擴(kuò)散，可及時(shí)固定。點(diǎn)樣方法，挖孔法，濾紙插入法。（三）瓊脂糖凝膠電泳（AGE）68

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是一種人工合成的高分子材料，60年代新用于電泳分析，能將血清蛋白分為20多種組成。優(yōu)點(diǎn)：

1.具有分子篩作用，分離效果好。

2.化學(xué)穩(wěn)定性高，是一種穩(wěn)定的親水膠體。

3.幾乎沒有吸附和電滲作用。

4.機(jī)械強(qiáng)度好，無色透明，可直接光密度掃描。

5.可調(diào)節(jié)凝膠孔徑以適合不同分子量的分離。

（四）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）69

1.聚合丙烯酰胺＋甲叉丙烯酰胺聚丙烯酰胺（Acr）單體（Bis）交聯(lián)劑化學(xué)摧化過硫酸銨-TEMED（四甲基乙二胺）系統(tǒng)加速劑TEMED促使引發(fā)劑過硫酸銨形成自由基，自由基與Acr接能，使Acr單體形成自由基而活化，從而引發(fā)聚合，聚合速度與pH，單體濃度，溫度有關(guān)。催化系統(tǒng)引發(fā)劑加速劑1.聚合催化系統(tǒng)引發(fā)劑70光催化核黃素-TEMED系統(tǒng)，核黃素經(jīng)光照被還原成無色核黃素，在和痕量氧的條件下，無色核黃素又被氧化成核黃素自由基，使Acr活化，從而引發(fā)聚合。優(yōu)點(diǎn)：核黃素用量少（10mg/L），對(duì)樣品分析無影響，聚合時(shí)間可通過調(diào)節(jié)光照時(shí)間，強(qiáng)度來控制。光催化核黃素-TEMED系統(tǒng)，核黃71

2.孔徑與機(jī)械強(qiáng)度凝膠孔徑由凝膠總濃度和交聯(lián)度決定。凝膠總濃度T（g/dl）表示100ml凝膠中Acr和Bis的總克數(shù)，T值越大，孔徑越小。

交聯(lián)度C（%）表示交聯(lián)劑Bis占凝膠總濃度T的百分比，C值越大，孔徑越小。

T值固定不變時(shí)，C值在5%時(shí)，凝膠孔徑最小，大于或小于5%，孔徑都會(huì)增大。2.孔徑與機(jī)械強(qiáng)度72

常用標(biāo)準(zhǔn)膠T=7.5g/dl，孔徑約5nm。凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度全要取決于T及Acr與Bis的比值。通常要求：

T為2%~5%Acr/Bis=205%~10%Acr/Bis=4015%~20%Acr/Bis=125~200常用標(biāo)準(zhǔn)膠T=7.5g/dl，孔徑約5n733.分類圓柱型根據(jù)凝膠的形狀水平式平板型垂直式根據(jù)凝膠系統(tǒng)和緩沖液組成：連續(xù)（均相），操作方便。不連續(xù)（多相），分離效果好。

3.分類74

4.分離原理聚丙烯酰胺凝膠電泳大多屬于不連續(xù)電泳。

（1）兩種不同孔徑的凝膠系統(tǒng)

（2）電泳過程中形成不均勻不連續(xù)系統(tǒng)

上層大孔徑濃縮膠T2~3g/dl、Tris-HCl、pH6.7。下層小孔徑分離膠，T5~10g/dl，Tris-HCl，pH8.9。電極緩沖液Tris-甘氨酸pH8.3。

（3）電極槽兩層凝膠中的緩沖液pH和組成不同。4.分離原理75高分辨率主要是由于下面三種效應(yīng)

1.樣品濃縮效應(yīng)

Cl－遷移率最大，快離子，解離度最小的甘氨酸離子遷移率最小，慢離子。蛋白質(zhì)離子介于兩者之間，快離子與慢離子之間形成低導(dǎo)電區(qū)，有較高的電位梯度，促進(jìn)蛋白質(zhì)和慢離子的移動(dòng)，使蛋白質(zhì)樣品被壓縮為一薄層。

2.分子篩效應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)入分離膠，由于凝膠有一定的孔徑，不同的蛋白質(zhì)分子大小不同，受到的阻力不同，小分子受阻力小，走在前面，大分子受阻力大，走在后面。

3.電荷效應(yīng)同一般電荷。高分辨率主要是由于下面三種效應(yīng)76五、蛋白質(zhì)區(qū)帶的定性和定量分析

（一）蛋白質(zhì)區(qū)帶的染色蛋白質(zhì)電泳分離后可以直接用紫外光密度掃描儀定量（利用蛋白質(zhì)對(duì)280nm紫外光的吸收），但需專門的儀器，故臨床上一般采用染色來進(jìn)行定性或定量分析。蛋白質(zhì)染色劑大多是陰離子燃料，易與蛋白質(zhì)陽離子結(jié)合，因此在pH＜pI的酸性溶液中較強(qiáng)。常用的染色劑有氨基黑10B，溴酚藍(lán)，麗春紅S。五、蛋白質(zhì)區(qū)帶的定性和定量分析77（二）蛋白質(zhì)區(qū)帶的定性分析經(jīng)染色后，首先應(yīng)仔細(xì)觀察有無異常區(qū)帶。如多發(fā)性骨髓瘤病人有大量單克隆蛋白質(zhì)（主要是IgG或IgA）電泳時(shí)可在β和γ之間呈現(xiàn)一條區(qū)帶，稱為M區(qū)帶。（三）蛋白質(zhì)區(qū)帶的定量分析

蛋白質(zhì)電泳的定量分析通常以各區(qū)帶占總量的百分率表示如同時(shí)測定了蛋白質(zhì)總量，也可換算成各組分的絕對(duì)量（g/L）表示。總蛋白75g/LA:66%α1:3%α2:7%β:10%γ:15%49.5g/L2.25g/L5.25g/L7.25g/L11.25g/L（二）蛋白質(zhì)區(qū)帶的定性分析781.光密度儀直接掃描法透明的電泳圖譜可用光密度儀直接掃描得出各組分的百分率。操作簡便，迅速，誤差小，結(jié)果較準(zhǔn)確。2.洗脫比色法染色后將各區(qū)帶分別剪下侵入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，將蛋白質(zhì)吸附的染料全部洗脫然后進(jìn)行比色，求出各組分的百分含量。操作繁瑣，費(fèi)時(shí)，準(zhǔn)確度不如光密度儀直接掃描法。1.光密度儀直接掃描法透明的電泳圖79六、特殊電泳技術(shù)（一）等電聚焦電泳（IFE）是利用具有線性pH梯度的兩性電解質(zhì)為載體，分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)等兩性分子的一種電泳新技術(shù)。其分辨率可達(dá)0.01pH單位，特別適用于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)分子。正常人血清蛋白質(zhì)采用此法可分出50多條區(qū)帶。六、特殊電泳技術(shù)801.基本原理在電泳系統(tǒng)中建立一個(gè)從正極到負(fù)極，pH由低到高的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度。處于這一系統(tǒng)的各種蛋白質(zhì)，根據(jù)各自pI與所處環(huán)境pH值的差別帶上正電或負(fù)電，電泳時(shí)逐漸靠近與其pI相同的pH位點(diǎn)，而不斷失去凈電荷，直至達(dá)到pH=pI，凈電荷為零時(shí)，不再受電場力的作用，而達(dá)到聚焦。

2.基本條件①建立一個(gè)穩(wěn)定、重復(fù)性良好的連續(xù)pH梯度。②有一個(gè)抗對(duì)流的材料，防止已分離樣品重新混合。③電泳后有適當(dāng)?shù)姆椒▉龛b定分離的區(qū)帶。1.基本原理在電泳系統(tǒng)中建立一個(gè)從正813.pH梯度的建立能建立穩(wěn)定pH梯度的兩性電解質(zhì)是一種多羧基、多氨基的脂肪族化合物。如瑞典LKB公司生產(chǎn)的商品名為“Ampholine”的，它由丙烯酸和多乙烯多胺合成。理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：

（1）各成分的導(dǎo)電能力彼此相近。

（2）各成分的pI彼此接近，并在pI附近有良好的緩沖能力。

（3）分子量小，易于與樣品分離。

（4）對(duì)280nm紫外光沒有或僅有很低的吸光度，不干擾樣品測定。3.pH梯度的建立能建立穩(wěn)定pH梯度的82（二）

雙向電泳

是先把樣品從一個(gè)方向進(jìn)行電泳分離，然后在與其成90。方向上進(jìn)行第二次電泳分離。如第一次電泳可以其電荷性質(zhì)為基礎(chǔ)；第二次電泳則以分離量不同進(jìn)行分離。通常將等電聚焦電泳為第一相電泳，以SDS-聚丙烯酰胺凝膠為第二相電泳。

（二）

雙向電泳83（三）

轉(zhuǎn)移電泳又稱印跡轉(zhuǎn)移電泳。此項(xiàng)技術(shù)是1975年由Southern在進(jìn)行DNA片段的研究中首先使用。將凝膠電泳所得區(qū)帶經(jīng)吸附作用轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜（NC膜）上，由于轉(zhuǎn)移過程類似于將墨跡吸到吸水紙上，故稱為(Southernbolt印跡法)。

1977年Alwine將此法應(yīng)用于RNA研究，取名Nerthernblot。

1979年Towbin又將其擴(kuò)展到蛋白質(zhì)研究，將其風(fēng)趣的稱為Westernblot.1981年，Reinhart等將等電聚焦電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC上，取名為Easternblot.

（三）

轉(zhuǎn)移電泳84轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)包括三個(gè)步驟

1.采用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)或核酸，電泳方式有單向，雙相，梯度，等電聚焦等。

2.轉(zhuǎn)移電泳，將已分離的蛋白質(zhì)或核酸經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移到NC或重氮芐氨基甲基紙上，前者為非共價(jià)吸附，后者為共價(jià)結(jié)合。

3.鑒定膜上的蛋白質(zhì)或核酸，方法有，放射自顯影，酶標(biāo)免疫化學(xué)等。

轉(zhuǎn)移電泳的優(yōu)點(diǎn):對(duì)分離蛋白質(zhì)的鑒定，比在凝膠上的操作要簡便，轉(zhuǎn)移電泳實(shí)際上是將凝膠電泳的高分辨率與放射標(biāo)記或酶標(biāo)等免疫化學(xué)法的高靈敏度結(jié)合起來。轉(zhuǎn)移電泳技術(shù)包括三個(gè)步驟85第四節(jié)層析技術(shù)

層析法又稱色譜法、色層分離法，1906年由俄國植物學(xué)Jauett首先用于植物色素的分離提取而得名。目前，層析技術(shù)發(fā)展迅速已成為生物化學(xué)、分子生物等及生物工程等學(xué)科常用的分離分析方法，如氣體、無機(jī)離子、AA、糖類、脂類、Vit、藥物，以及大分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的分析。第四節(jié)層析技術(shù)86一、層析的概念與分類（一）基本概念

層析法是利用待分離物質(zhì)中不同組分的某些理化性質(zhì)（在兩相中溶解、吸附、紊和作用等）的差異而建立起來的一種分離技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)均由因定相和流動(dòng)相組成，固定相是固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)的液體，流動(dòng)相是可以流動(dòng)的物質(zhì)。如水、某些溶劑和氣體。一、層析的概念與分類87當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異，它們在固定相和流動(dòng)相中的分配比不同，隨溶媒的向前移動(dòng)，各組分不斷地在兩相中進(jìn)行再分配，與固定相作用力越弱的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，向前移動(dòng)速度快，反之，與固定相作用強(qiáng)的組分，則向前移動(dòng)速度慢。如紙層析、薄層層析、薄膜層析、層析移動(dòng)的速度用比移值或阻滯因子（Rf）來表示。當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于混88（二）層析法分類1.按兩相所處的狀態(tài)不同分類按流動(dòng)相的狀態(tài)不同，再按固定相的狀態(tài)不同。氣相層析液相層析氣固層析氣液層析液固層析液液層析層析法（二）層析法分類氣相層析液相層析氣固層析氣液層892.按層析分離機(jī)制（分離原理）分類

（1）吸附層析法（AC）固定相是固體吸附劑，利用各組化吸附劑表面吸附能力的差別而分離。

（2）分配層析法（PC）固定相是液體利用各組分化流動(dòng)相和預(yù)止液相同（固定相）中的分配系數(shù)不同的分離。2.按層析分離機(jī)制（分離原理）分類90

（3）離子交換層析法（IEC）固定相是離子交換劑，利用各組分對(duì)離子交換劑親和力的不同而分離。

（4）凝膠層析法（GPC）固定相為多孔性凝膠，利用各組分分子大、形狀不同在凝膠中受阻滯的程度不同而分離。

（5）親和層析法

利用各組分生物學(xué)特殊性不同而建立的一種層析方法，固定相工能和一種待分離成分類一結(jié)合，使其與其他物質(zhì)分離，如利用抗原、抗體的結(jié)合來分離相應(yīng)的抗原或抗體。（3）離子交換層析法（IEC）固定相是離913.按操作形式不同分類

（1）柱層析法（CC）固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)向到分離。

（2）薄層層析法（TLC）將顆粒狀的固定均勻地鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開。

（3）紙層析法（PC）用濾紙作為液體的載體，點(diǎn)樣后用流動(dòng)相展開。

（4）薄膜層析法（TFC）用高分子有機(jī)吸附劑制成薄膜，以類似紙層析的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離。3.按操作形式不同分類92二、層技術(shù)在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用（一）薄層層析在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用薄層層析根據(jù)固定相的不同有吸附、分化和離子交換等技術(shù)，以吸附薄層層析為例說明其基本方法。1.固定相與流動(dòng)相及選擇（1）固定相為吸附劑，常用的有硅膠、氯化鋁、硅薄土纖維素等，固定相選擇時(shí)應(yīng)考慮的因素。二、層技術(shù)在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用93①吸附劑如硅膠是弱酸性吸附劑，適合于酸性和中性物質(zhì)的分離，氫化鋁是微堿性吸附劑，適合于堿性和中性物質(zhì)分離，硅薄土、纖維素、屬性吸附劑。②吸附能力常稱為活度，主要受吸附劑含水量的影響，含水量高活度低，從強(qiáng)到弱分為I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5級(jí)，活度強(qiáng)吸附作用強(qiáng)，一般分離水溶性物質(zhì)活度弱些，而分離脂溶性物質(zhì)活度要強(qiáng)些。①吸附劑如硅膠是弱酸性吸附劑，適合于酸94③顆粒狀大小為了使每次測定的Rf值恒定，吸附劑要求顆粒大小均勻、適當(dāng)，顆粒細(xì)、吸附能力強(qiáng)，展開慢、顆粒粗、吸附能力弱，展開快、分離放開差，一般顆粒直徑為無機(jī)類0.07～0.1mm（70～140目）。

（2）流動(dòng)相即展開劑，展開劑的選擇是薄層層折中又一關(guān)鍵，一般極性大的化合物需用極性大的展開劑。③顆粒狀大小為了使每次測定的Rf值恒定952.薄層層折法操作技術(shù)（1）制板常用方法有三種。干法、濕法和燒結(jié)法。干法制板（軟板），常用厚度0.25～3.0mm，方法簡便，但不堅(jiān)固易吹散，只能水中放置，點(diǎn)樣，顯色需加小心，濕法制板（硬板）加入一定粘合劑（石膏、羧甲基纖維素鈉、淀粉等），燒結(jié)法制板吸附劑，加入一定量無水乙醇調(diào)成糊狀制板，然后放入高溫爐中加熱至750℃、60～75mm，機(jī)械強(qiáng)度好，可反復(fù)使用。2.薄層層折法操作技術(shù)96制成的板要求涂布均勻，晾干、活化。（2）點(diǎn)樣用毛細(xì)玻管點(diǎn)樣，斑點(diǎn)直徑均2mm，板據(jù)需要可點(diǎn)2-3次，點(diǎn)樣處距下端1.5cm。（3）展開將層折板放入加有展開劑點(diǎn)層折槽中，立即蓋嚴(yán)，展開距離10cm取出，劃出溶劑前沿線。（4）顯色等溶劑揮發(fā)后，用相應(yīng)顯色劑顯色。制成的板要求涂布均勻，晾干、活化。973.薄層層折法的定性及定量

定性分析主要依據(jù)Rf值，與標(biāo)準(zhǔn)液的Rf比較，定量，采用專用的薄層掃描儀，測量斑點(diǎn)的薄線大小，并與標(biāo)準(zhǔn)液斑點(diǎn)比較。4.應(yīng)用

主要用于AA、肽、核苷酸、糖類、脂類和激素等物質(zhì)的分離和鑒定。3.薄層層折法的定性及定量98（二）凝膠層折在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用

又稱凝膠過濾、分子篩層折、排阻層折。固定相是多孔凝膠，商品凝膠是干燥顆粒，當(dāng)吸收一定量液體后溶脹成一種柔軟而富有彈性、不帶電荷、不與溶質(zhì)互作用的惰性物質(zhì)，由于凝膠有一定孔徑，對(duì)分子大小不同的組分的阻滯作用不同。在被分離物質(zhì)中，大分子組分由于直徑大，不當(dāng)進(jìn)入凝膠孔徑內(nèi)，隨流動(dòng)相向前移快，小分子組分則能進(jìn)入凝膠微孔內(nèi)，向前移動(dòng)慢，而達(dá)到分離。（二）凝膠層折在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用991.凝膠的種類和性能

常用的凝膠有葡聚糖、凝膠、聚丙烯酰凝膠和瓊脂糖凝膠。（1）葡聚糖凝膠將右旋葡萄糖的線性聚合長鏈間，用交聯(lián)劑1-氯代-2、3-環(huán)氯丙烷通過醚橋交聯(lián)而成。穩(wěn)定性好，不溶于水，但在酸性條件下糖易水解，由于分子中會(huì)有大量羥基，因此有很大的吸水性，吸水后溶脹成透明，而且有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的彈性顆粒，孔徑的大小與交聯(lián)度有關(guān)，交聯(lián)度大，孔徑小、吸水量小，商品膠型號(hào)多以吸水量10倍表示，如每克干膠吸水量為2.5g，即為G-25型，最常用的交聯(lián)葡聚糖商品名為Sephadex。1.凝膠的種類和性能100（2）聚丙烯酰胺凝膠層析用的聚丙烯酰胺凝膠商品名為生物凝膠-P（Bio-gel-P），是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（Bis），經(jīng)自由基引發(fā)聚合而成，型號(hào)有P-2，P-4，P-6，P-10，P-30，P-60，P-100，P-150，P-200，P-300，可分離子肽及蛋白質(zhì)量，100～40萬。具有隋性，但在酸堿性較強(qiáng)的情況下如葡聚糖凝膠穩(wěn)定，適用pH范圍2-11，使用范圍與型號(hào)和葡聚糖凝膠相似。（2）聚丙烯酰胺凝膠層析用的聚丙烯酰胺101（3）瓊脂糖凝膠屬于天然凝膠，從瓊脂中提取結(jié)構(gòu)為D-半孔糖和L-3.-6-脫水半孔糖的線基交替所組成的多聚糖，常用商品名是Sepharose和Bio-gel-A，型號(hào)有Sepharose2B、4B、6B，數(shù)字表示瓊脂糖含量（W/W）。機(jī)械強(qiáng)度大，分子量使用范圍寬（達(dá)108），吸附生物高，分子勇最低常用生物高分子物質(zhì)的分離，但穩(wěn)定性很差，使用條件限制很嚴(yán)格（T0～40℃、pH9）。（3）瓊脂糖凝膠屬于天然凝膠，從瓊脂中提取1022.凝膠層折中注意的幾個(gè)問題

（1）柱直徑與長度凝膠層折一般為柱層柱，柱直徑一般在1～5cm，長度L與直徑D比值L/D一般為7～10，但對(duì)移動(dòng)緩慢的物質(zhì)宜30～40。（2）凝膠的選擇一般要以大分子物除去小分子物質(zhì)時(shí)，如從蛋白質(zhì)溶液中除鹽和AA可選用交聯(lián)度大的，如葡聚糖G-25或G-50，反之欲將小分子物質(zhì)收集濃縮而去除大分子，則應(yīng)選用交聯(lián)度小的，如G-100或G-150。2.凝膠層折中注意的幾個(gè)問題103（3）靜水壓

Vo和Vi的比值，分離時(shí)需維持一定的靜水壓，孔徑愈大，最高靜水壓愈低，如G-10，最高靜水壓>100cm，而G-100、35cm。Vi指凝膠孔隙中水的體積稱為內(nèi)水，Vo指凝膠顆粒之間水的體積，稱為外水，裝柱良好的凝膠柱，其Vo/Vi的比值應(yīng)為40％～60％。

（4）樣品的濃度和體積大分子物質(zhì)溶液粘度隨濃度增大而增大，而影響分離效果，一般將粘度控制在5cp（厘泊）以下，樣品體積小于凝膠總體積的5％～10％。（3）靜水壓Vo和Vi的比值，分離時(shí)需維1043.凝膠層折的應(yīng)用（1）去鹽高分子（如蛋白質(zhì)核膠、多糖等），溶液的低分子雜質(zhì)，可用凝膠層折法除去，這一過程稱為去鹽。

（2）高分子溶液的濃縮如蛋白質(zhì)的稀溶液需要濃縮時(shí)，可加入葡聚糖G-25或G-50的干膠，蛋白質(zhì)稀溶液中的水份及小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部孔隙中，蛋白質(zhì)則在顆粒外，將溶脹后的凝膠分離除去，得到濃縮的蛋白質(zhì)濃液。3.凝膠層折的應(yīng)用105（3）用于分離提純廣泛用于酶蛋白質(zhì)、AA、核苷酸多糖、激至少、抗生素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。（4）用于測定高分子物質(zhì)的分子量用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，放入同一凝膠柱，在同一條件下層折，測定每種組分的保留體積，并以保留體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作用，得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）用于分離提純廣泛用于酶蛋白質(zhì)、AA、106

（三）高效液相層折化生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用

高效液相層折（highpeilozmamceliguidchomatagaphyHPLC）又稱為高效液相色譜法，始于60年代末，是在經(jīng)典液相層折法基礎(chǔ)上引進(jìn)氣相層折理論發(fā)展起來的，它具有氣相層折的全部優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了氣相層折的缺點(diǎn)，具有分離能力強(qiáng)，測定靈敏度高（ng水平）應(yīng)用范圍廣（極性到非極性、小分子到大分子、熱穩(wěn)定與不穩(wěn)定化合物），在室溫下進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)。（三）高效液相層折化生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用107HPLC裝置儀器化它包括輸液系統(tǒng)、層折柱和檢測系統(tǒng)三部分，輸液系統(tǒng)主要是高壓泵將流動(dòng)相輸入，層折柱按分離機(jī)理不同分為：吸附、分配、離子交換等類型，檢測器應(yīng)用最多的是紫外吸收檢測器、熒光檢測器、信號(hào)送入數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)或記錄儀。在臨床生化檢驗(yàn)中HPLC已用于類同醇激素、兒茶酚胺的測定，同工酶的分離，治療藥物的監(jiān)測和篩選。

HPLC裝置儀器化它包括輸液系統(tǒng)、層108第五節(jié)自動(dòng)化技術(shù)生化檢驗(yàn)的自動(dòng)化技術(shù)是指生化分析的取稱，加試劑，樣品預(yù)處理，樣品分析和結(jié)果處理及器材清洗等步驟部分或全部由模仿成代替和操作的儀器來完成。一、自動(dòng)分析儀的種類

（一）按機(jī)械設(shè)計(jì)原理分類1.流動(dòng)或自動(dòng)生化分析儀是指測定項(xiàng)目相同的各待測樣品與試劑混合后的化學(xué)反應(yīng)在同一管道流動(dòng)的過程中完成，第一代。

第五節(jié)自動(dòng)化技術(shù)1092.分立式自動(dòng)生化分析儀是每個(gè)待測樣品與試劑混合的化學(xué)反應(yīng)都是分別在各自的反應(yīng)杯中完成的。第二代

3.離心或自動(dòng)生化分析儀是每個(gè)待測樣品和試劑分別放在各自的四糟內(nèi)，然后在離心力的作用下混合、反應(yīng)。第三代前兩者屬于回順序分析，因化離心力的作用下，各樣品與試劑幾乎是同時(shí)被混合，反應(yīng)并被測定。

2.分立式自動(dòng)生化分析儀是每個(gè)待測樣110

（二）按同時(shí)可測項(xiàng)目分類可分為單通過與多通道兩類單通道即每個(gè)樣品每次只能進(jìn)一個(gè)項(xiàng)目測量，而多通道則每個(gè)樣品每次可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)項(xiàng)目測定，活動(dòng)式、分立式自動(dòng)生化分析儀均有單通道和多通道之分，離心式的一般都為單通道。（二）按同時(shí)可測項(xiàng)目分類111（三）按儀器的復(fù)雜程度和分析功能分類分為小型、中型、大型三類。小型一般為單通道，只能測某一特定項(xiàng)目的專用分析儀（血糖、血鈣測定儀。中型的有單通道也有多通道，單通道的可用更換程序而更換測定項(xiàng)目，可選幾十次，多通道的則可用時(shí)測定2～10個(gè)項(xiàng)目，但一般只能測定臨床常規(guī)生化項(xiàng)目，而大型的則往往可同時(shí)測定10個(gè)以上項(xiàng)目，且分析項(xiàng)目可自由選擇、組合。除進(jìn)行常規(guī)生化項(xiàng)目外，還可進(jìn)行激素，免疫球蛋白測定，以及酶免疫，熒光免疫分析等。（三）按儀器的復(fù)雜程度和分析功能分類112

（四）測定按測定程序可否改變分類

分為固定程度序和可往意編程的兩類。固定程序的測定項(xiàng)目的程序和方法使用若無法更改?？赏饩幊痰目筛鶕?jù)使用者的需要進(jìn)行程序的更改、變換、增減。二、自動(dòng)生分分析的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

各種類型的自動(dòng)生分析儀一般由以下幾個(gè)部分組成。

1.樣品器放置待測樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品

2.吸樣結(jié)構(gòu)吸樣探針、輸送樣品、試劑管道

3.稀釋器或比例泵吸取、分配、輸送試劑（四）測定按測定程序可否改變分類1134.反應(yīng)杯或反應(yīng)管道5.恒溫器6.檢測器、比色計(jì)、分光光度計(jì)、熒光光度計(jì)7.微處理機(jī)械或程序控制器8.打印機(jī)或記錄儀4.反應(yīng)杯或反應(yīng)管道114（一）流動(dòng)式自動(dòng)生分析儀比例泵是這類分析儀的特殊結(jié)構(gòu)，泵的作用好比心臟的收縮和舒張，偌此吸入樣品，試劑和空氣，推動(dòng)液流向前流動(dòng)，混合管，為一螺旋玻管，好比重不同液體充分混合。透析器，去蛋白（二）分立式自動(dòng)生化析儀采用唧筒式吸樣器和稀釋器來取樣和加試劑，用獨(dú)立的反應(yīng)杯取代了管道系統(tǒng)。（一）流動(dòng)式自動(dòng)生分析儀115

（三）離心式自動(dòng)生化分析儀離心轉(zhuǎn)頭是這類分析的特殊結(jié)構(gòu)。樣品與試劑分別加特制圓盤的凹槽內(nèi)，圓盤將放在離心轉(zhuǎn)頭上，離心機(jī)開動(dòng)時(shí)，樣品與試劑化在離心力作用下甩入外圈比色槽混合，并進(jìn)行比色檢測。（四）干片式分析儀各種有關(guān)試劑分層鋪在一薄膜內(nèi)，膜分4層，涂布層、去蛋白。試劑層，樣品經(jīng)去蛋白后的濾液進(jìn)入試劑層進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，指示劑層，反應(yīng)產(chǎn)物與指示劑結(jié)合產(chǎn)生有然復(fù)合物，支持層，一張?jiān)嚨鸵粋€(gè)項(xiàng)目，特別適用于急診和門診，無污染。（三）離心式自動(dòng)生化分析儀116本章小結(jié)1.光譜分析技術(shù)的分類（吸收光譜分析、散射光譜分析和發(fā)射光譜分析。2.吸收光譜分析可見分光光度法（光吸收定律、比色分析儀器、比色分析的特點(diǎn)及比色分析的定量方法）；原子吸收分光光度法。3.發(fā)射光譜分析火焰光度法（基本原理、影響火焰光度法測定的因素）；熒光光度法（基本原理、影響熒光強(qiáng)度的因素、），實(shí)驗(yàn)試劑的配制、保存和使用（注意事項(xiàng)、保存、使用），試劑盒的選擇與評(píng)價(jià)。本章小結(jié)1.光譜分析技術(shù)的分類（吸收光譜分117復(fù)習(xí)思考題

1.光譜分析技術(shù)可分為哪幾類？2.何謂光吸收定律（Lambert-Beer定律）？3.可見-紫外分光光度計(jì)的基本部件包括哪些？4.影響火焰光度法測定的因素主要有哪些？

5.常用的發(fā)射光譜分析技術(shù)有哪些？復(fù)習(xí)思考題118參考文獻(xiàn)：《現(xiàn)代臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)》主編張秀明人民軍醫(yī)出版社《臨床生物化學(xué)及生物化學(xué)檢驗(yàn)》主編周新人民衛(wèi)生出版社結(jié)束預(yù)習(xí)內(nèi)容：第七章酶學(xué)分析技術(shù)參考文獻(xiàn)：《現(xiàn)代臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)》結(jié)束預(yù)習(xí)內(nèi)容：第七章119第五章

常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

第一節(jié)光譜分析技術(shù)第二節(jié)電化學(xué)分析第三節(jié)電泳技術(shù)第四節(jié)層析技術(shù)第五節(jié)自動(dòng)生化分析技術(shù)第五章

常用生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

第一節(jié)光譜分析技術(shù)120

光譜分析技術(shù)是根據(jù)物質(zhì)吸收或發(fā)射輻射能而建立起來的一類分析方法，因不同分子的原子和原子團(tuán)，其發(fā)射光譜和吸收光譜不同，而相同的物質(zhì)在一定條件下，其發(fā)射光譜