基因工程操作流程

關(guān)于基因工程操作流程第一頁，共三十頁，2022年，8月28日為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動子處結(jié)合呢?啟動子處的核苷酸順序具有特異的形狀以便與RNA聚合酶結(jié)合，就好像酶與其底物的結(jié)構(gòu)相恰恰適合一樣。將100個(gè)以上啟動子的順序進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在RNA合成開始位點(diǎn)的上游大約10bp和35bp處有兩個(gè)共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個(gè)序列的共同順序如下，-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”，-10區(qū)“TTGACATATATT”。大多數(shù)啟動子均有共同順序（consensussequence)，只有少數(shù)幾個(gè)核苷酸的差別。第二頁，共三十頁，2022年，8月28日終止子第三頁，共三十頁，2022年，8月28日能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū):非編碼區(qū):原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)有調(diào)控作用，含啟動子、終止子等。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子第四頁，共三十頁，2022年，8月28日（二）真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ))編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子

能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：

外顯子：

第五頁，共三十頁，2022年，8月28日原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第六頁，共三十頁，2022年，8月28日1.2基因工程的基本操作程序①從細(xì)胞中分離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒④DNA重組⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因第七頁，共三十頁，2022年，8月28日基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定第八頁，共三十頁，2022年，8月28日目的基因——主要指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。取出DNA用限制酶切斷DNA

目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.目的基因的獲取第九頁，共三十頁，2022年，8月28日基因文庫的種類：基因組文庫：含有一種生物所有的基因部分基因文庫：含有一種生物的一部分基因（如：cDNA文庫）獲取目的基因的方法一：從基因文庫中獲取目的基因基因文庫（genelibrary）的概念：將含有某種生物的不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。第十頁，共三十頁，2022年，8月28日組織或細(xì)胞染色體DNA限制性核酸內(nèi)切酶DNA片段重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌載體受體菌基因組文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)菌內(nèi)，由載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA雙鏈cDNA重組DNA分子載體含重組分子的轉(zhuǎn)化菌受體菌用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA制備雙鏈的cDNA后，建立的基因文庫。cDNA文庫第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）無有基因中內(nèi)含子（位于編碼蛋白質(zhì)序列內(nèi)的非編碼DNA片段）無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種間的基因交流可以部分基因可以第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日PCR(polymerasechainreaction)

——多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可獲取大量的目的基因。

獲取目的基因方法二：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

PCR擴(kuò)增儀第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日原理：DNA雙鏈復(fù)制反應(yīng)過程：1.變性：將反應(yīng)系統(tǒng)加熱至90℃-95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈；2.退火：將溫度下降至55℃-60℃左右，使引物與模板DNA退火結(jié)合；3.延伸：將溫度升至70℃-75℃，DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應(yīng)。

上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)25～30次循環(huán)后，可將模板DNA擴(kuò)增達(dá)百萬倍。反應(yīng)體系：模板DNA、特異性引物、 耐熱DNA聚合酶、dNTP及緩沖液第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日DNA合成儀過程：

適用范圍：已知核苷酸序列，基因的核苷酸數(shù)量較少。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成

獲取目的基因方法三：化學(xué)合成法

第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日小結(jié):目的基因的獲?。喝N方法(1)從基因文庫中獲取適用于目的基因序列為未知的情況(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增適用于目的基因的序列為已知的情況(3)人工合成適用于目的基因不是很大且其序列是已知的第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日基因表達(dá)載體的組成目的基因啟動子終止子標(biāo)記基因等標(biāo)記基因：鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日常用的受體細(xì)胞

動物、植物、微生物轉(zhuǎn)化：

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。3、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法轉(zhuǎn)化方法2）將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用CaCl2第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用方法：---農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

適用范圍：雙子葉植物和裸子植物轉(zhuǎn)化過程：第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——基因槍法基因槍法又稱微彈轟擊法，是籍高速度運(yùn)動的金屬微粒將附著于其表面的核酸分子引入到受體細(xì)胞中的一種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù)。這是單子葉植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高此技術(shù)最早由我國學(xué)者周光宇提出的，植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——花粉管通道法第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日2）將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日3）將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法：用Ca+（常用CaCl2）處理細(xì)菌細(xì)胞，以增大細(xì)胞壁的通透性，使細(xì)胞處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)——感受態(tài)細(xì)胞。將重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化。第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日1)分子水平的檢測檢測目的基因是否插入了轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測方法：DNA分子雜交技術(shù)檢測方法：分子雜交技術(shù)檢測方法：抗原-抗體雜交4、目的基因的檢測和鑒定第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日DNA分子雜交技術(shù)該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。第二十七頁，共三十頁，2022年，8月28日

如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。第二十八頁，共三十頁，2022年，