基因工程的操作步驟

關(guān)于基因工程的操作步驟第一頁，共四十六頁，2022年，8月28日基因工程的基本操作程序1.目的基因的獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)與鑒定第二頁，共四十六頁，2022年，8月28日第三頁，共四十六頁，2022年，8月28日知識(shí)點(diǎn)一：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)第四頁，共四十六頁，2022年，8月28日①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子第五頁，共四十六頁，2022年，8月28日第六頁，共四十六頁，2022年，8月28日能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：知識(shí)點(diǎn)一：2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)第七頁，共四十六頁，2022年，8月28日真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)等。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游第八頁，共四十六頁，2022年，8月28日原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第九頁，共四十六頁，2022年，8月28日1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定知識(shí)點(diǎn)二.基因工程基本操作的四個(gè)步驟第十頁，共四十六頁，2022年，8月28日第十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日一、獲取目的基因1.獲取目的基因的途徑

A.從自然界已有的物種中分離

B.人工合成2.獲取目的基因的方法

A.從基因文庫中獲取

B.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增

C.利用化學(xué)方法人工合成目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因第十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘兄苯荧@取1.基因文庫：概念見P92.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類種類基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫3.基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：見課本P9第十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫5.基因文庫的構(gòu)建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)第十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日cDNA合成過程

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。5.基因文庫的構(gòu)建方法之第十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較第十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日

概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制__________的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段原理：DNA復(fù)制2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日四種脫氧核苷酸(dNTP)

一對(duì)引物：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

Mg2+(激活劑)條件：緩沖溶液一對(duì)寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物前提：第十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。第十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日

過程高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈）重復(fù)循環(huán)預(yù)變性（增加DNA變性的概率）第二十頁，共四十六頁，2022年，8月28日2、具體過程第二十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 第二十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.等②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）第二十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第二十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子第二十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因第二十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

——基因工程的核心1、目的：所需物質(zhì)：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。第二十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日2、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因第二十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來第二十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第三十頁，共四十六頁，2022年，8月28日三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞---植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力第三十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞---動(dòng)物細(xì)胞顯微注射法第三十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞---微生物細(xì)胞Ca2+處理

使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中的DNA---感受態(tài)細(xì)胞第三十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):是否插入目的基因（DNA分子雜交技術(shù)）是否轉(zhuǎn)錄（mRNA分子雜交技術(shù)）是否翻譯（抗原—抗體雜交技術(shù)）鑒定:功能活性鑒定抗性鑒定分別提取什么進(jìn)行檢測(cè)歸納步驟第三十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第三十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯第三十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日第三十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日基因操作的基本步驟第三十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日基因操作的基本步驟第三十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa第四十頁，共四十六頁，2022年，8月28日練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用

方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性?；驑尫ǎɑǚ酃芡ǖ婪ǎ┲参锝M織培養(yǎng)脫分化和再分化耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌第四十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、