PCR技術(shù)極其應(yīng)用-課件

PCR技術(shù)及其應(yīng)用分子生物學(xué)與臨床中山大學(xué)主講：楊中漢（yangzhonghan163）PCR技術(shù)及其應(yīng)用分子生物學(xué)與臨床中山大學(xué)1目錄PCR的概念PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用目錄PCR的概念2

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerase:DNA聚3基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增4PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））5KaryB.Mullis（1944－）karymullisKaryB.Mullis（1944－）karymulli6三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91

)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)

三篇重要論文TheUnusualOriginofth7生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究……PCR技術(shù)誕生所依賴的社會需求和研究需要生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類8基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段9限制性內(nèi)切酶裂解基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組DNA文庫DNA文庫20kBfragments插入噬菌體載體細(xì)菌擴增限制性內(nèi)切酶裂解基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組D10裂解變性顯影從基因組文庫中篩選目的基因probe放射性核素轉(zhuǎn)印裂解變性顯影從基因組文庫中篩選目的基因probe放射性核素轉(zhuǎn)11DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子12DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶1977年DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物D13引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA1494℃變性50-65℃退火XX℃延伸94℃變性50-65℃退火XX℃延伸1594℃55℃37℃94℃55℃37℃16Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶1772℃94℃55℃PCR循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)18PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理無細(xì)胞分子克隆法19

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類引物復(fù)習(xí)5’3’體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類20加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強酸、堿性作用可以21PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退222PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達23232）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。2）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決24引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。引物設(shè)計：253’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標(biāo)記3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列263）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時間。3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用27目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子284）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)4）用途廣泛生命學(xué)科29PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。

PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物30

總體積50-100lBuffer緩沖液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶

1反應(yīng)體系總體積31PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNA預(yù)變性模板DNATa32PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶循環(huán)儀94℃Taq酶733瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)341）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3PCR反應(yīng)條件1）PCR反應(yīng)成分（1）模板3PCR反應(yīng)條件35（2）引物濃度0.1-0.5mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（2）引物濃度36（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（4）dNTP37（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。382）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。2）循環(huán)參數(shù)39（3）延伸70-75℃,一般為72℃延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加（3）延伸40經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30411）不對稱PCR

目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針

基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究PCR的類型1）不對稱PCRPCR的類型42

高濃度引物低濃度引物高濃度引物低濃度引物432)反向PCR(reversePCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增?？蓪ξ粗蛄袛U增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互44已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶453）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失46電泳引物12341234電泳引物1234123447DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式多重PCR檢測DMD基因缺失DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對48PCR技術(shù)極其應(yīng)用-課件494）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時檢測多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒44）LP-PCR（Labelledprimers)50標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物515）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段兩測的序列

對于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？（固定化PCR）5）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PC52VHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCL53cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點polydC)一起作PCR擴增cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引546）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介557）原位ＰＣＲ原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進行ＰＣＲ擴增?？蛇M行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列7）原位ＰＣＲ原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStill56

原位PCR的作用

既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH）,但在每個細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。原位PCR的作用57操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入2.PCR擴增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測擴增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達操作步驟A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達588）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增8）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈59基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈609)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。9)熒光定量PCR（real-timePCR)61熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記62熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)熒光定量PCR標(biāo)記方法635’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEm645’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEm65Taqman探針3′端Q熒光分子能夠吸收5′端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測不到5′端熒光分子發(fā)出的熒光,只能檢測到3′端熒光分子的熒光信號,但當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物(模板)時,探針與模板退火,即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而激活Taq酶的5′外切酶活性,將探針5′端連接的R熒光分子從探針上切割下來,破壞了兩個熒光分子間的FRET,從而發(fā)出熒光,切割的R熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)Taqman探針3′端Q熒光分子能夠吸收5′端R熒光分子發(fā)出66Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）Oligo1:FluoresceinOligo2:L67RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQ68RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）RQExcitationXRQQRExcitationEmi69引物特異性探針（AmplisenorProbe）引物特異性探針（AmplisenorProbe）705’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（AmplifluorProbe）5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’71熒光定量實時PCR與普通PCR的比較實時在線監(jiān)控對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控,能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加,直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期降低反應(yīng)的非特異性使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合,提高了PCR反應(yīng)的特異性增加定量的精確性全程監(jiān)控,準(zhǔn)確的算法進行定量結(jié)果分析更加快捷方便,無需跑膠

熒光定量實時PCR與普通PCR的比較72全新4通道實時熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀全新4通道實時熒光定量PCR儀普通梯度PCR儀73PCR技術(shù)的應(yīng)用1)基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段PCR技術(shù)的應(yīng)用1)基因克隆重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段74大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產(chǎn)品大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產(chǎn)品755’5’BamHIBamHIBamHIBamHI5’5’BamHIBamHIBamHIBamH76GTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCAGGCCTGGGACGTCCCAGG質(zhì)粒DNA目的基因限制性核酸內(nèi)切酶GTCCGGACCCTGCAGGGTCCGGACCCTGCA772)基因檢測A’內(nèi)源性病變基因正常人A病人病原微生物基因正常人(-)病人(+)2)基因檢測A’內(nèi)源性病變基因正常人A病人病原微生物基因78遺傳病的診斷

基因缺失、插入或置換等地中海貧血珠蛋白鏈合成不平衡遺傳病的診斷基因缺失、插入或置換等地中海貧血珠蛋白79A正常人病人正常病人A正常人病人正常病人80ASO探針法ACTGASO探針正常病人PCR-ASO檢測基因點突變:主是利用PCR技術(shù)擴增靶基因的適當(dāng)片段,然后用人工合成的含突變位點的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交ASO探針法ACTGASO探針正常病人PCR-ASO檢測基因81探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子82PCR-RFLP法：

限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因PCR-RFLP法：限制性內(nèi)切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌83突變限制性內(nèi)切酶突變限制性內(nèi)切酶84正常突變電泳正常突變電泳85

HLA系統(tǒng)基因分型

PCR-RFLP法PCR-SSO法PCR-SSCPPCR-SSP3)基因配型HLA系統(tǒng)基因分型PCR-RFLP法PCR-SSO法PC86

PCR-SSP12345678PCR12345678引物特異性（序列特異性引物-PCR技術(shù)）PCR-SSP123874）基因鑒定女性男性Y引物PCR男性女性4）基因鑒定女性男性Y引物PCR男性女性88法醫(yī)學(xué)分析

個體識別、親緣鑒定方法：PCR-RFLPDNA遺傳指紋PCR-ASOPCR-VNTR多態(tài)性PCR-SSCP線粒體DNA測序法醫(yī)學(xué)分析個體識別、親緣鑒定89PCR-VNTR多態(tài)性檢測PCR；電泳檢測（VNTR：數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列）PCR-VNTR多態(tài)性檢測PCR；電泳檢測（VNTR：數(shù)目可90父’父子母父’父子母91

現(xiàn)嫌1嫌2嫌3現(xiàn)嫌1嫌2嫌392思考題:1)從PCR的基本原理和特點,論述其應(yīng)用價值.思考題:93PCR技術(shù)及其應(yīng)用分子生物學(xué)與臨床中山大學(xué)主講：楊中漢（yangzhonghan163）PCR技術(shù)及其應(yīng)用分子生物學(xué)與臨床中山大學(xué)94目錄PCR的概念PCR技術(shù)的創(chuàng)建PCR的原理PCR的反應(yīng)體系和方法PCR的類型和應(yīng)用目錄PCR的概念95

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:

DNA聚合酶

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerase:DNA聚96基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增基因組DNA引物DNA聚合酶DNA片段體外擴增97PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國《Science》雜志列PCR為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)的創(chuàng)建KaryB.Mullis（穆利斯（美））98KaryB.Mullis（1944－）karymullisKaryB.Mullis（1944－）karymulli99三篇重要論文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91

)SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)

三篇重要論文TheUnusualOriginofth100生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類學(xué)研究……PCR技術(shù)誕生所依賴的社會需求和研究需要生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測人類101基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段基因組DNA獲取特定DNA片段擴增特定DNA片段102限制性內(nèi)切酶裂解基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組DNA文庫DNA文庫20kBfragments插入噬菌體載體細(xì)菌擴增限制性內(nèi)切酶裂解基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝基因組D103裂解變性顯影從基因組文庫中篩選目的基因probe放射性核素轉(zhuǎn)印裂解變性顯影從基因組文庫中篩選目的基因probe放射性核素轉(zhuǎn)104DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子105DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物DNA聚合酶1977年DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測序技術(shù)引物D106引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA10794℃變性50-65℃退火XX℃延伸94℃變性50-65℃退火XX℃延伸10894℃55℃37℃94℃55℃37℃109Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶11072℃94℃55℃PCR循環(huán)72℃94℃55℃PCR循環(huán)111PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中,加入適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴增了特異區(qū)段的DNA帶。

PCR技術(shù)的原理1PCR技術(shù)的基本原理無細(xì)胞分子克隆法112

體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類引物復(fù)習(xí)5’3’體內(nèi)DNA的復(fù)制DNA聚合酶dNTP解旋酶類113加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來,形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強酸、堿性作用可以114PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火PCR擴增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退1152PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍2PCR技術(shù)的特點1）高度的靈敏性30輪循環(huán)擴增量達231162）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。2）特異性引物引物引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決117引物設(shè)計：（1)序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴增區(qū)無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布,G+C占50-60%。（4）引物內(nèi)部避免形成二級結(jié)構(gòu)。（5）兩引物間避免有互補序列。（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無嚴(yán)格限制。引物設(shè)計：1183’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標(biāo)記3’5’3’5’限制性內(nèi)切酶的識別序列1193）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1μg基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構(gòu)建含有目的的基因的載體,然后將它導(dǎo)入細(xì)胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;這種方法,要經(jīng)過DNA內(nèi)切、連接、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等相關(guān)的過程,操作復(fù)雜,一般需要數(shù)周時間。3）操作簡便易行PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用120目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴增擴增提取DNA分子1214）用途廣泛生命學(xué)科醫(yī)學(xué)工程遺傳工程疾病診斷法醫(yī)學(xué)考古學(xué)4）用途廣泛生命學(xué)科122PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物與模板DNA互補,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫(72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP為原料,以引物為復(fù)制的起點,合成新鏈。如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,即高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。

PCR的反應(yīng)體系和方法PCR管加熱使模板變性,退火使引物123

總體積50-100lBuffer緩沖液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶

1反應(yīng)體系總體積124PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本過程PCR技術(shù)的基本過程(1)模板DNA預(yù)變性模板DNATa125PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循環(huán)儀94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循環(huán)25～35次PCR技術(shù)的基本過程(2)Taq酶循環(huán)儀94℃Taq酶7126瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)的基本過程(3)1271）PCR反應(yīng)成分（1）模板單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般100ngDNA模板/100L。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。3PCR反應(yīng)條件1）PCR反應(yīng)成分（1）模板3PCR反應(yīng)條件128（2）引物濃度0.1-0.5mol/L濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（2）引物濃度129（4）dNTPdNTP濃度取決于擴增片段的長度四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入,濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。（4）dNTP130（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。1312）循環(huán)參數(shù)變性

使雙鏈DNA解鏈為單鏈94oC20-30秒(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。2）循環(huán)參數(shù)132（3）延伸70-75℃,一般為72℃延伸時間由擴增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加（3）延伸133經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever經(jīng)典循環(huán)參數(shù)（500bp以內(nèi)）94℃301341）不對稱PCR

目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板制備雜交探針

基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究PCR的類型1）不對稱PCRPCR的類型135

高濃度引物低濃度引物高濃度引物低濃度引物1362)反向PCR(reversePCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增?？蓪ξ粗蛄袛U增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列2)反向PCR(reversePCR)是用反向的互137已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶1383）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失139電泳引物12341234電泳引物12341234140DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對應(yīng)條帶,說明病人外顯子8～19缺失B：病人A中未擴增外顯子帶的強度為C的一半,提示為區(qū)域缺失攜帶者C：正常人DMD基因外顯子的一般擴增形式多重PCR檢測DMD基因缺失DMD：人類肌營養(yǎng)不良基因A：無外顯子8,12,17,19對141PCR技術(shù)極其應(yīng)用-課件1424）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時檢測多種基因成分病毒1病毒2病毒3病毒44）LP-PCR（Labelledprimers)143標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物1445）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR的局限：需了解靶基因片段兩測的序列

對于未知序列和具有不同末端序列怎么辦？（固定化PCR）5）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PC145VHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCLVHCH1CH1CH2CH2CH3CH3VHVLVLCLCL146cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點polydC)一起作PCR擴增cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引1476）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介1487）原位ＰＣＲ原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細(xì)胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進行ＰＣＲ擴增?？蛇M行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測病理切片中含量較少的靶序列7）原位ＰＣＲ原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStill149

原位PCR的作用

既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH）,但在每個細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來,成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測技術(shù)。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。原位PCR的作用150操作步驟1.細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入2.PCR擴增細(xì)胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測擴增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達操作步驟A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達1518）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增8）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈152基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈1539)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。熒光定量PCR儀光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀,通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。9)熒光定量PCR（real-timePCR)154熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記155熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)熒光定量PCR標(biāo)記方法1565’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEm1575’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEm158Taqman探針3′端Q熒光分子能夠吸收5′端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測不到5′端熒光分子發(fā)出的熒光,只能檢測到3′端熒光分子的熒光信號,但當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物(模板)時,探針與模板退火,即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而激活Taq酶的5′外切酶活性,將探針5′端連接的R熒光分子從探針上切割下來,破壞了兩個熒光分子間的FRET,從而發(fā)出熒光,切割的R熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)Taqman探針3′端Q熒光分子能夠吸收5′端R熒光分子發(fā)出159Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）Oligo1:FluoresceinOligo2:L160RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）RQ5