支氣管肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測對肺癌的診斷價(jià)值

支氣管肺泡灌洗液中SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測對肺癌的診斷M陳瑞英;劉雅;孫婷瀏峰輝;馬小花【摘要】目的:對疑診肺癌患者支氣管肺泡灌洗液(BALF)中SHOX2、RASSF1A基因甲基化分析，評估兩指標(biāo)聯(lián)合檢測區(qū)分肺癌與肺良性疾病的診斷效能及聯(lián)合細(xì)胞學(xué)使用對肺癌的診斷價(jià)值.方法:收集276例肺部疾病患者(肺癌組131例，肺部良性疾病組145例)的BALF樣本應(yīng)用PCR法檢測BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化，并將檢測結(jié)果和Sanger測序法結(jié)果比較.結(jié)果:PCR和Sanger測序法一致性分析顯示兩種方法在檢測SHOX2和RASSF1A基因甲基化具有良好的一致性(Kappa=0.978,95%CI=0.954~1.000).SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測在肺癌組的診斷靈敏度為0.840,高于良性疾病組(0.193)(P<0.001);肺癌組BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測陽性率在小細(xì)胞肺癌和肺鱗癌中分別是100%和90.9%,高于肺腺癌(66.0%);SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測陽性率在晚期肺癌高達(dá)89.3%,明顯高于早期肺癌陽性檢出率.ROC曲線分析顯示當(dāng)SHOX2、RASSF1A基因甲基化、細(xì)胞學(xué)三指標(biāo)聯(lián)合使用時(shí)進(jìn)一步將診斷靈敏度提高至0.931.結(jié)論:對BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化PCR檢測在肺癌診斷中有良好的靈敏度;SHOX2、RASSF1A甲基化PCR檢測與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合使用可顯著提高肺癌診斷靈敏度，是肺癌病理學(xué)診斷的有效補(bǔ)充工具.【期刊名稱】《鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》【年(卷)，期】2019(054)005【總頁數(shù)】5頁(P732-736)【關(guān)鍵詞】肺癌；DNA甲基化;SHOX2;RASSF1A【作者】陳瑞英;劉雅;孫婷瀏峰輝;馬小花【作者單位】鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸及睡眠科鄭州450052;鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院呼吸科鄭州450052;鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸及睡眠科鄭州450052;鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸及睡眠科鄭州450052;鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸及睡眠科鄭州450052【正文語種】中文【中圖分類】R734.1提高肺癌診斷率并及早治療是降低肺癌高死亡率的關(guān)鍵［1-2］。在美國，低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(low-dosecomputedtomography,LDCT)篩查已被證明可降低高危肺癌患者的死亡率，但LDCT篩查存在假陽性及過度診斷的問題［3］。對疑似肺癌患者，通過纖維支氣管鏡獲取活組織檢查是確診肺癌常用的侵襲性方法，但其診斷陽性率受病灶部位、大小、肺部合并癥等因素影響，大約50%患者首次支氣管鏡檢呈陰性結(jié)果［4］。支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)細(xì)胞學(xué)檢查一定程度上不受病灶位置限制，但受人為因素影響大，靈敏度低(43%~48%)。因此，需要探索一種高度敏感、特異的BALF分析方法作為病理學(xué)檢查的補(bǔ)充，以提高肺癌的診斷率。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究的重要方面，其與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，參與了細(xì)胞癌變過程中的早期事件［5］。隨著以甲基化特異性PCR(methylation-specificPCR,MS-PCR)為代表的檢測技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)多種基因的甲基化狀態(tài)與肺癌關(guān)系密切［6-8］。矮小同源盒基因2(shortstaturehomobox2,SHOX2)是目前肺癌診斷中研究較多的甲基化指標(biāo)，無論單獨(dú)還是與組織/細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合應(yīng)用，可以有效提高肺癌檢出率［9-11］;研究［10,12］還顯示，不同肺癌病理類型中存在組織特異性甲基化水平改變。Ras相關(guān)區(qū)域家族蛋白1A(ras-associationdomainfamily1A,RASSF1A)被認(rèn)為是新型抑癌基因，與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，90%以上的小細(xì)胞肺癌及50%~80%的非小細(xì)胞肺癌RASSFIA呈雜合性或純合性缺失，RASSF1A在肺癌中存在著較高的表達(dá)。本研究測定了可疑肺癌患者BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化狀態(tài)，評估其在肺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。1對象與方法1?1研究對象研究對象均來自于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，研究方案經(jīng)該院倫理委員會(huì)同意并與患者簽署知情同意書。收集2015年1月至2017年6月在該院就診、經(jīng)胸部影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肺部高密度陰影病灶或有其他肺部癥狀(咳嗽、咯血、胸悶、胸腔積液等)的疑似肺癌患者276例，進(jìn)一步經(jīng)組織病理學(xué)和(或)BALF細(xì)胞學(xué)確診，原發(fā)性肺癌患者131例(病理類型:肺腺癌47例，鱗癌44例，小細(xì)胞肺癌31例，大細(xì)胞肺癌5例，其他類型4例分期:Stage0期5例，1期18例，H期32例，B期39例，3期28例，分期未明9例)，肺部良性疾病145例。肺癌組年齡(59.15±13.25)歲，肺部良性疾病組年齡(60.56±13.45)歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.878,P=0.381)。肺癌組男性患者91例，女性40例;肺部良性疾病組男性患者115例，女性30例，性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=1.041,P=0.308)。1.2BALF留取與病理分析276例患者均接受纖維支氣管鏡檢查，操作符合2013年英國胸科協(xié)會(huì)成人纖支鏡檢操作規(guī)范［15］。在病變肺段注入37°C滅菌生理鹽水50mL,立即用負(fù)壓吸引回收灌洗液，共灌洗2次，記錄回收的BALF總量(每位患者回收量不低于40mL)；然后進(jìn)行支氣管活檢，采集組織學(xué)標(biāo)本。標(biāo)本處理:取20mLBALF,2000r/min離心10min，去上清，用20~25mL蒸餾水重懸沉淀，再次以2000r/min離心10min，去上清，取沉淀制作乙醇固定玻片并行Papanicolaou染色，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。固定支氣管活檢或手術(shù)標(biāo)本，并用蘇木精-曙紅染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。由該院資深病理學(xué)家閱片并出具診斷報(bào)告。1.3BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化檢測1.3.1DNA提取和處理取10mLBALF，以10000r/min離心5min，取沉淀用于DNA提取。使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，提取后的DNA直接進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，具體步驟參見ZYMORESEARCH生物公司EZDNAMethylation-DirectTM試劑盒說明書［16］。1.3.2甲基化的PCR檢測甲基化人SHOX2和RASSF1A基因檢測試劑盒、引物和探針均由上海透景生命科技股份有限公司提供。PCR反應(yīng)液包含3pL擴(kuò)增引物，1.5pL標(biāo)記探針，4.8pL2xTaq緩沖液（包括dNTP和Taq聚合酶）和10.7pLddH2O；質(zhì)控品為測序確認(rèn)的SHOX2和RASSFIA甲基化陽性DNA;陰性對照為純化水。向PCR反應(yīng)管中每孔加入上述混勻的PCR反應(yīng)液20pL，再加入樣本DNA5pL，預(yù)留兩管加入質(zhì)控品、陰性對照各5pL。PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性10min;95C變性15s,60C退火30s供5個(gè)循環(huán)）;95C變性15s,57C退火30s（共40個(gè)循環(huán)）。在最后循環(huán)階段60C時(shí)收集FAM、VIC及CY5的信號(hào)。1.3.3甲基化的Sanger測序法檢測使用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物，SHOX2正向引物序列:5’-GGTGTTGTGTCGTATAGGGAGT-3’，反向引物序列:5’-TCCGCCTCCTACCTTCTAAC-3’；RASSF1A正向引物序列:5’-GAGGGAAGGAAGGGTAAGG-3’，反向引物序列:5’-GAGGGAAGGAAGGGTAAGG-3’。PCR反應(yīng)體系:共40pL，包含5pLcDNA,10pmoI/L正、反向引物各0.8pL,20pL2xTaq緩沖液（包括dNTP和Taq聚合酶）和13,4pLddH2O。PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性10min,95°C變性30s供45個(gè)循環(huán)），58C退火35s,72C延伸30，，最后72C延伸8min。產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Sanger測序。1.4隨訪對病理學(xué)診斷陰性而SHOX2、RASSF1A基因甲基化PCR法檢測陽性的28例患者進(jìn)行門診或電話隨訪，隨訪時(shí)間為6個(gè)月，終點(diǎn)事件為疾病惡化。.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對PCR和Sanger測序法檢測結(jié)果進(jìn)行Kappa—致性檢驗(yàn)，應(yīng)用x2檢驗(yàn)比較肺癌組和肺部良性疾病組BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化陽性率的差異，應(yīng)用ROC曲線評價(jià)單一指標(biāo)和多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測的價(jià)值，并計(jì)算AUC及95%CI;檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。2結(jié)果2.1PCR和Sanger測序法檢測結(jié)果的一致性分析見表1。結(jié)果顯示，兩種方法在檢測SHOX2和RASSF1A基因甲基化上有較好的一致性，Kappa=0.978,95%CI=0.954~1.000。表1PCR和Sanger測序法一致性比較PCRSanger測序法陽性陰性總計(jì)陽性1383141陰性0135135總計(jì)138138276.2肺癌組、良性疾病組BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化PCR檢測結(jié)果見表2。按病理類型分層，SHOX2、RASSF1A兩基因甲基化PCR檢測同時(shí)陽性者在小細(xì)胞肺癌患者中最高，為93.5%，而肺腺癌和肺鱗癌較低，僅為40.4%和36.4%；但兩基因甲基化PCR聯(lián)合檢測時(shí)，任一陽性者肺腺癌、鱗癌檢出率分別達(dá)到66.0%和90.9%（表3）。不同TNM分期肺癌患者BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測陽性率均高于單一指標(biāo)檢測陽性率;晚期肺癌患者BALF中基因甲基化的陽性率最高，為89.3%（表3）。表2肺癌組、良性疾病組BALF中SHOX2和RASSF1A基因甲基化PCR檢測結(jié)果例（%）組別nSHOX2RASSF1A二者均陽性任一陽性肺癌組131101（77.1）77(58.8)68(51.9)110(84.0)良性疾病組14522(15.2)12(8.3)6(4.1)28(19.3)x2106.83480.34380.036115.093P<0.001<0.001<0.001<0.001表3不同病理類型及疾病分期肺癌患者BALF中基因甲基化PCR檢測結(jié)果例(％)項(xiàng)目nSHOX2RASSF1A二者均陽性任一陽性肺癌病理類型肺腺癌4727(57.4)23(48.9)19(40.4)31(66.0)肺鱗癌4437(84.1)19(43.2)16(36.4)40(90.9)小細(xì)胞肺癌3130(96.8)30(96.8)29(93.5)31(100.0)大細(xì)胞肺癌55(100.0)3(60.0)3(60.0)5(100.0)其他類型42(50.0)2(50.0)1(25.0)3(75.0)肺癌分期Stage0期51(20.0)2(40.0)0(0)3(60.0)Stage期1813(72.2)8(44.4)8(44.4)13(72.2)StageH期3226(81.2)19(59.3)17(53.1)28(87.5)StageB期3931(79.5)25(64.1)22(56.4))34(87.2)StageIV期2823(82.1)19(67.9)17(60.7)25(89.3)分期未明97(77.8)4(44.4)4(44.4)7(77.8).3BALF細(xì)胞學(xué)聯(lián)合基因甲基化PCR檢測的價(jià)值比較見表4。表4單一指標(biāo)與多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測結(jié)果*:各指標(biāo)間并聯(lián)指標(biāo)靈敏度特異度約登指數(shù)AUC及95%CIBALF細(xì)胞學(xué)0.4351.0000.4350.782(0.725~0.840)RASSF1A0.5880.8910.4730.762(0.703~0.826)SHOX20.7710.8480.6190.810(0.756~0.863)SHOX2+RASSF1A*0.8400.8070.6470.823(0.771~0.875)細(xì)胞學(xué)+SHOX2*0.8930.8480.7410.871(0.825~0.916)細(xì)胞學(xué)+RASSF1A*0.8320.9170.7490.875(0.829~0.920)細(xì)胞學(xué)+SHOX2+RASSF1A*0.9310.8070.7380.869(0.823~0.915)2.4良性疾病組中SHOX2和RASSF1A基因甲基化陽性患者的隨訪研究在145例肺良性疾病患者中，有28例SHOX2和(或)RASSF1A基因甲基化檢測陽性，臨床診斷為肺炎、支氣管擴(kuò)張、呼吸道淀粉樣變、肺結(jié)核、結(jié)節(jié)病等。對上述28例患者進(jìn)行隨訪研究，6個(gè)月隨訪期間有2例病情惡化，后經(jīng)病理確診為肺癌。3討論DNA甲基化已廣泛用于癌癥的輔助診斷，尤其適合微創(chuàng)獲取標(biāo)本（如BALF、胸腔積液等）的檢測［17-18］。多項(xiàng)研究［9,13,19］顯示，SHOX2和RASSF1A基因異常甲基化對肺癌具有診斷價(jià)值，可作為肺癌的生物標(biāo)志物。本研究中作者使用PCR和Sanger測序法對276名疑似肺癌患者BALF標(biāo)本中SHOX2和RASSF1A基因甲基化進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示兩種方法檢測結(jié)果一致性良好，說明PCR法在DNA甲基化分析中是可靠的，而且檢測成本更低，對樣本DNA含量的要求低于Sanger測序法，這些優(yōu)勢是其廣泛推廣應(yīng)用的前提。本研究中，SHOX2和RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測對肺癌的診斷靈敏度為0.840,特異度為0.807，表明SHOX2和RASSF1A甲基化聯(lián)合檢測具有區(qū)分惡性和良性肺部疾病的診斷效能。目前，病理學(xué)仍然是肺癌診斷金標(biāo)準(zhǔn);但臨床中受病灶組織異質(zhì)性、病灶部位等因素影響，病理學(xué)檢查有時(shí)呈現(xiàn)陰性結(jié)果，導(dǎo)致診斷困難，因此迫切需要多種檢測方法相結(jié)合以提高肺癌的診斷率。Darwiche等［20］使用組織學(xué)與SHOX2基因甲基化測定相結(jié)合對肺癌淋巴結(jié)樣本進(jìn)行檢測，達(dá)到99%的檢測靈敏度和99%的特異性。在本研究中，肺癌組BALF細(xì)胞學(xué)診斷靈敏度僅為0.435;與單一指標(biāo)檢測相比，當(dāng)SHOX2、RASSF1A兩指標(biāo)聯(lián)合或者基因甲基化與細(xì)胞學(xué)兩兩聯(lián)合時(shí)，診斷靈敏度顯著升高。當(dāng)SHOX2、RASSF1A基因甲基化和細(xì)胞學(xué)三指標(biāo)聯(lián)合使用時(shí)進(jìn)一步將診斷靈敏度提高至0.931，這表明BALF中SHOX2和RASSF1A甲基化檢測可以作為肺癌細(xì)胞學(xué)診斷的有效補(bǔ)充工具。有研究［10］顯示，SHOX2、RASSF1A基因甲基化陽性檢出率與肺癌病理類型之間存在相關(guān)性。本研究中，SHOX2、RASSF1A基因甲基化聯(lián)合檢測陽性率在小細(xì)胞肺癌和肺鱗癌中分別是100%和90.9%,肺腺癌組最低(大細(xì)胞肺癌例數(shù)過少，僅5例，其陽性檢測率不能提供可靠信息)，表明SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測對小細(xì)胞肺癌和肺鱗癌的敏感性高于肺腺癌，這與以前的研究結(jié)論相似［12,15］；分析原因可能與小細(xì)胞肺癌和肺鱗癌中存在高水平SHOX2基因甲基化有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，SHOX2、RASSF1A基因甲基化水平與肺癌病情分期之間亦有相關(guān)性，晚期肺癌患者SHOX2、RASSF1A基因甲基化水平高于早期肺癌(89.3%vs72.2%)；這與晚期肺癌更具侵襲性、腫瘤生長更快、腫瘤性壞死更多，進(jìn)而導(dǎo)致DNA釋放增多，更容易檢測到甲基化等因素有關(guān)［14］。本研究中，肺良性疾病組有28例患者BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化檢測陽性，在隨訪過程中2例隨后被確診為肺癌;提示對可疑患者進(jìn)行DNA甲基化檢測是必要的，尤其對病理學(xué)檢測結(jié)果陰性而甲基化分析陽性患者，至少可以提前預(yù)警，密切隨訪，必要時(shí)可多次穿刺活檢以免漏、誤診?？傊?，BALF中SHOX2、RASSF1A基因甲基化分析具有區(qū)分惡性和良性肺部疾病的診斷效能；SHOX2、RASSF1A基因甲基化分析與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合使用可顯著提高肺癌診斷靈敏度，是肺癌病理學(xué)診斷的有效補(bǔ)充工具。參考文獻(xiàn)【相關(guān)文獻(xiàn)】[1]ZENGH,CHENW,ZHENGR,etal.ChangingcancersurvivalinChinaduring2003-15:apooledanalysisof17population-basedcancerregistries[J].LancetGlobHealth,2018,6(5):e555[2]ETTINGERDS,WOODDE,AISNERDL,etal.Non-smallcelllungcancer,Version5.2017,NCCNclinicalpracticeguidelinesinoncology[J].JNatlComprCancNetw,2017,15(4):504[3]LIANGMZ,TANGW,XUDM,etal.Low-doseCTscreeningforlungcancer:computer-aideddetectionofmissedlungcancers[J].Radiology,2016,281(1):279[4]OSTDE,ERNSTA,LEIX,etal.Diagnosticyieldandcomplicationsofbronchoscopyforperipherallunglesions:resultsoftheAQuIREregistry[J].AmJRespirCritCareMed,2016,193(1):68[5]DORY,CEDARH.PrinciplesofDNAmethylationandtheirimplicationsforbiologyandmedicine[J].Lancet,2018,392(1149):777[6]SHEAFFERKL,ELLIOTTEN,KAESTNERKH.DNAhypomethylationcontributestogenomicinstabilityandintestinalcancerinitiation[J].CancerPrevRes(Phila),2016,9(7):534[7]劉瑩，王圓圓，賈文青，等.肺癌患者血清p16、FHIT、APC基因甲基化檢測[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2017,52(1):51[8]王威，馮曉蕾，段曉冉，等.基于3種基因啟動(dòng)子甲基化聯(lián)合端粒長度構(gòu)建肺癌診斷支持向量機(jī)模型[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2015,50(4):462[9]WEISSG,SCHLEGELA,KOTTWITZD,etal.ValidationoftheSHOX2/PTGER4DNAmethylationmarkerpanelforplasma-baseddiscriminationbetweenpatientswithmalignantandnonmalignantlungdisease[J].JThoracOncol,2017,12(1):77[10]SONGLL,YUHT,LIYE.DiagnosisoflungcancerbySHOX2genemethylationassay[J].MolDiagnTher,2015,19(3):159[11]IlseP,BiesterfeldS,PomjanskiN,etal.AnalysisofSHOX2methylationasanaidtocytologyinlungcancerdiagnosis[J].CancerGenomicsProteomics,2014,11(5):251[12]MARI-ALEXANDREJ,DIAZ-LAGARESA,VILLALBAM,etal.Translatingcancerepigenomicsintotheclinic:focusonlungcancer[J].TranslRes,2017,189:76[13]DUBOISF,KELLERM,CALVAYRACO,etal.RASSF1Asuppressestheinvasionandmetastaticpotentialofhumannon-smallcelllungcancercellsbyinhibitingYAPactivationthroughtheGEF-H1/RhoBpathway[J].CancerRes,2016,76(6):1627[14]GAOL,XIEEF,YUTF,etal.Methylate