實驗二蛋白質(zhì)的顯色反應

關于實驗二蛋白質(zhì)的顯色反應第一頁，共十七頁，2022年，8月28日一、實驗目的1、了解構成蛋白質(zhì)的基本結構單位及主要連接形式。2、了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應原理。3、學習幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。第二頁，共十七頁，2022年，8月28日1.雙縮脲反應2.茚三酮反應3.黃色反應4.考馬斯亮藍反應第三頁，共十七頁，2022年，8月28日呈色反應1、雙縮脲反應（1）原理：尿素加熱至180oC左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性條件下能與Cu2+結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應（二肽和氨基酸都不能發(fā)生雙縮脲反應）?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。反應式如下：第四頁，共十七頁，2022年，8月28日第五頁，共十七頁，2022年，8月28日

雙縮脲反應不僅為含有兩個以上肽鍵的物質(zhì)所有，-CH2-NH2,-CS-NH2,-CHR-NH2,-CH2-NH2-CH-NH2-CH2-OH或-CHOHCH2NH2等基團的物質(zhì)以及乙二酰二胺等物質(zhì)也有此反應。NH3也干擾此反應，因為NH3與Cu2+可生成暗藍色的絡離子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。第六頁，共十七頁，2022年，8月28日（2）試劑①尿素，②10%氫氧化鈉溶液，③1%硫酸銅溶液，④改為蛋清溶液：水=1：9（3）操作取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1mL，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。（由于雜質(zhì)以及氨氣的干擾，導致顏色不都是紫紅色）向另一試管加蛋清溶液：水=1：9約1mL和10%氫氧化鈉溶液約2mL，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。第七頁，共十七頁，2022年，8月28日2、茚三酮反應(1)原理蛋白質(zhì)、多肽和各種氨基酸以及所有氨基酸均能發(fā)生該反應，除無α-氨基的脯氨酸和羥脯氨酸呈黃色反應外，其它均生成藍紫色化合物，最終生成藍色化合物。氨、β-丙氨酸和許多一級氨化合物都有此反應。因此，雖然蛋白質(zhì)或氨基酸均有茚三酮反應，但能與茚三酮反應呈陽性反應的不一定都是蛋白質(zhì)或氨基酸。該反應的適宜的PH為5～7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。第八頁，共十七頁，2022年，8月28日該反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化脫氨形成酮酸，酮酸脫羧成醛，放出CO2、NH3，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有藍色物質(zhì)。反應機理如下：第九頁，共十七頁，2022年，8月28日第十頁，共十七頁，2022年，8月28日（2）試劑①蛋白質(zhì)溶液：新鮮雞蛋清溶液（蛋清：水=1：9），②0.5%甘氨酸，③0.1%茚三酮水溶液，④0.1%茚三酮-乙醇溶液。（3）操作①取兩支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1mL，再各加0.5mL0.1%茚三酮水溶液,混勻，在沸水浴中加熱1～2分鐘，觀察顏色由粉色變紫色再變藍色（pH不同顏色深淺不同）。②在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴一滴0.1%茚三酮-乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現(xiàn)。第十一頁，共十七頁，2022年，8月28日3、黃色反應（1）原理含有苯環(huán)的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進一步形成深橙色的硝醌酸鈉。反應式如下：多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以呈黃色反應，苯丙氨酸不易硝化，須加入少量濃硫酸才有黃色反應。第十二頁，共十七頁，2022年，8月28日（2）試劑①雞蛋清溶液（將新鮮雞蛋清用6層紗布過濾，然后按雞蛋清：水=1：20配制而成。②大豆提取液：將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀再用紗布過濾。③頭發(fā)。④指甲。⑤0.5%苯酚溶液。⑥濃硝酸。⑦0.3%色氨酸溶液。⑧0.3%酪氨酸溶液。⑨10%氫氧化鈉溶液。（3）操作向7個試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化（1～4管可能需要加熱）。第十三頁，共十七頁，2022年，8月28日第十四頁，共十七頁，2022年，8月28日4、考馬斯亮藍反應（1）原理考馬斯亮藍G250（R250）具有紅色和藍色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色；當它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結合后變?yōu)樗{色。它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍。反應速度快，約在2分鐘左右時間達到平衡，在室溫一小時內(nèi)穩(wěn)定。在0.01～1.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質(zhì)含量。第十五頁，共十七頁，2022年，8月28日（2）試劑①蛋白質(zhì)溶液（雞蛋清：水=1：20配制而成）。②考馬斯亮藍溶液：考馬斯亮藍G250100ｍg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混勻，配成原液。