X線照射對實(shí)驗(yàn)性癲癇大鼠腦皮層GABA和GABAA受體的影響

X線照射對實(shí)驗(yàn)性癲癇大鼠腦皮層GABA和GABAA受體的影響

【摘要】

目的探討癲癇大鼠放射治療中γ-氨基丁酸(GABA)及其受體的作用機(jī)制并選擇合理放射劑量。方法利用慢性點(diǎn)燃癲癇大鼠對照組、放射1組、放射3組進(jìn)行0、24、6Gy的X線放射，對放射2組、放射4組和放射5組行12Gy的X線放射，每組10只，對照組和放射1組、放射3組于放射后1h斷頭取腦，放射4組于放射后1天、放射5組于放射后1周進(jìn)行斷頭取腦，并觀察放射5組其放射后癲癇發(fā)作情況，用氨基酸分析儀測定各組癲癇大鼠額葉皮層內(nèi)的GABA含量變化，利用免疫組織化學(xué)方法觀察抗GABAA受體陽性率。結(jié)果放射5組于照射后1周內(nèi)癲癇在鼠未出現(xiàn)誘發(fā)癲癇發(fā)作。放射1組的GABA含量為(254.16±44.68)ng，GABAA受體陽性率為(39.56±7.22)%，均明顯高于對照組，12Gy照射后1h、24h、1周后均較對照組間GABA含量高，其中以24h最為明顯，分別為(252.09±33.89)ng，(348.73±56.00)ng和(258.02±62.95)ng?？笹ABAA受體陽性率在照射后1周內(nèi)基本穩(wěn)定于較高水平。結(jié)論放射治療癲癇主要是通過發(fā)生快速而持續(xù)的GABA與GABAA受體變化發(fā)生作用，癲癇大鼠接受12Gy的放射治療較為合理。

【關(guān)鍵詞】

γ氨基丁酸受體GABA-A癲癇大鼠X線

AlaboratorystudyontheeffectofX-rayonGABAandGABAAreceptorsincerebralcortexofepilepticratCHENJia-yu,LIANGShu-li,ZENGXiao-xiong1.TheAffiliatedHospitalofHunanCollege,Chenzhou,Hunan423000,China;2.DepartmentofNeurosurgery,304ClinicalDivisionofGeneralHospitalofPeople'sLiberationArmy,Beijing100037,China;3.DepartmentofSurgery,ZhongtangHospitalofDongguanCity,Dongguan,Guangdong523220,ChinaAbstract:

Objective

ToinvestigatetheroleofGABAandGABAA

receptorplayinradiotherapyofepilepticrat,andtolookfortheappropriatedoseofradiotherapyforepilepsy.

Methods

Achronicpentylenetetrazolechemicalkindlingratmodelofepilepsywasreproduced,andtheratsweredividedforcontrolgroupandradiogroups1to5with10ratsineachgroup.Controlgroup,groups1and3weregiven0,24,or6GyXrayirradiationtothebraininturns,andgroups2,4and5weregiven12GyXrayirradiation,theratsincontrolgroup,groups1,2,and3werekilled1hour,andgroup4waskilledonday1,andgroup5waskilledin1weekafterradiotherapy.ContentofGABAwasmeasuredbyaminoacidanalyzer,andGABAAreceptorchangeswereassessedbyimmunohistochemicalstaininginfrontallobeofthebrainofratsinallgroups.Seizureofratingroup5wererecordedin1hour,24hoursor1weekafterirradiation.

Results

Theepilepticratsingroup5didn'tsufferfromseizureafterradiotherapy.Ingroup1,thequantityofGABAwas(254.16±44.68)ng，andpositiverateofGABAAreceptorwas(39.56±7.22)%,whichwerehigherthanthoseincontrolgroup,thecontentofGABAinratsreceived12GyX-rayradiotherapywere(252.09±33.89)ng,(348.73±56.00)ngand(258.02±62.95)ngin1hour,1dayand1weekafterirradiation,andsignificanthigherthanthatincontrolgroup,also,thepositiverateofGABAARinthoseratsweresignificanthigherthanthatincontrolgroup.

Conclusions

TheefficacyofradiotherapyforepilepticratmightbeattributabletorapidandsustainedchangeinGABAandGABAA

receptors,and12Gyappearedtobetheappropriateirradiationdoseforepilepticrat.

Keywords:

GABA;

receptor,GABA-A;epilepsy;rats;X-rays

臨床發(fā)現(xiàn)放射治療對癲癇發(fā)作可能有抑制作用，但其作用機(jī)制尚不明確。在癲癇的發(fā)作與治療機(jī)制中γ氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid，GABA)占有主導(dǎo)地位，本研究旨在通過觀察X線照射對大鼠皮層內(nèi)GABA和GABAA型受體(GABAAtypereceptor，GABAAR)α1亞單位含量的影響，探討放射治療癲癇的有效性及其可能的作用途徑。1

資料與方法1.1

實(shí)驗(yàn)動物與分組

清潔級SD(SpragueDawley)大鼠60只（本院實(shí)驗(yàn)動物中心提供），6～7周齡，體重(200±10)g。第一次實(shí)驗(yàn)40只，隨機(jī)分為對照組、放射1組、放射2組、放射3組，第二次實(shí)驗(yàn)在前次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇合理的放射劑量對其余20只大鼠進(jìn)行放射，隨機(jī)分為放射4組、放射5組。1.2儀器與試劑

戊四氮（pentetrazole,PTZ）、兔抗GABAARα1亞單位抗體（G4416）購自美國Sigma公司、液體DAB酶顯色試劑盒和酶標(biāo)抗兔多聚復(fù)合物購自福建邁清公司，混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液購自日本味之素公司、日立#2622-SC樹脂氨基酸分析柱、日立L-8500氨基酸分析儀。1.3癲癇模型建立［1］

所有大鼠均每日上午9：00～10：00時給予PTZ35mg/kg腹腔注射，連續(xù)1個月，注射后觀察20min，癲癇發(fā)作分級標(biāo)準(zhǔn)參照Racine的方法。放射前所有大鼠及放射4、5組取樣前1h均進(jìn)行腹腔注射PTZ，放射5組在放射治療后第4天再進(jìn)行腹腔注射PTZ1次。1.4放射治療

用氯胺酮與速眠新（2∶1）混合液腹腔注射（0.8mg/kg）對所有大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后1h內(nèi)利用垂直X線對大鼠頭部進(jìn)行放射，放射1組劑量為24Gy，放射2、4、5組均為12Gy，放射3組劑量為6Gy，對照組劑量為0Gy。1.5組織標(biāo)本采集［2］

1～3組照射后1h內(nèi)進(jìn)行斷頭取腦，放射4組照射后24h進(jìn)行取腦，放射5組照射后1周進(jìn)行斷頭取腦，取出大腦后用濾紙吸去血液，腦組織置于膠片包裹的冰面上。1.6組織勻漿和GABA含量分析

取下左側(cè)額葉組織150mg放入勻漿管中并加入1.5ml磺基水楊酸，勻漿管置于0℃水中利用超聲勻漿器破碎，在4℃低溫高速離心機(jī)（15000r/min）離心15min，取上清液0.5ml，置于-81℃低溫冰箱保存，1周內(nèi)完成氨基酸含量分析。將樣品融化后，用針頭式濾器（0.45μl）過濾樣品，在日立氨基酸分析儀上進(jìn)行GABA測定，進(jìn)樣量為10μl，緩沖液流速0.4ml/min。1.7病理切片和免疫組織化學(xué)分析

取0.5cm×0.5cm大小右側(cè)額葉組織，石臘包埋4μm膠片(APES+丙酮)切片，常規(guī)脫蠟至水，0.3%過氧化氫溶液封閉處理10min，PBS溶液沖洗3次，微波抗原熱修復(fù)10min，PBS液沖洗3次。然后分別加入一抗抗GABAARα1亞單位抗體（1∶200稀釋），室溫1h孵育，PBS液沖洗3次，然后加入二抗酶標(biāo)抗兔多聚復(fù)合物30min，PBS液沖3次，DAB加過氧化氫混合液顯色，5min后水沖洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，酒精梯度脫水，二甲苯透明后中型樹膠封片，鏡檢分析。陽性細(xì)胞率為在10個高倍鏡（10×40倍）時同一視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)/同類細(xì)胞總數(shù)。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測定數(shù)據(jù)用（±s）表示，樣本間按成組資料進(jìn)行方差分析（F檢驗(yàn)），然后進(jìn)行Q檢驗(yàn)組間比較。2結(jié)果2.1癲癇模型的建立及生存情況

大鼠出現(xiàn)Racine3級以上發(fā)作在開始注射后的7～25天開始，至1個月時所有大鼠均在停藥3天后重新注射PTZ可以出現(xiàn)3級以上發(fā)作，主要表現(xiàn)為雙上肢陣攣、坐起、全身抽搐、跳起陣攣等癥狀。放射4、5組X線治療大鼠在麻醉后3h恢復(fù)正?；顒优c飲食，無死亡，觀察過程中未記錄到癲癇發(fā)作情況。2.2不同劑量X線放射后GABA含量的測定

對氨基酸分析試測定放射1、2、3組與對照組間的GABA含量變化情況見表1。其中放射1、2組較對照組GABA含量高差異均有顯著性。表1

不同放射劑量GABA含量及抗GABAARα1亞單位陽性率(略)2.3放射后不同時間內(nèi)的氨基酸含量變化

氨基酸分析試測定12Gy放射后1h、1天、1周后與對照組間的氨基酸含量變化。其中放射各組均較對照組GABA含量高、抗GABAARα1亞單位陽性率高，且差異均有顯著性，以放射后1天（4組）最為明顯。見表2。表2

放射后不同時間GABA含量及抗GABAARα1亞單位陽性率(略)2.4免疫組織化學(xué)結(jié)果

陽性細(xì)胞時GABAARα1亞單位存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，表現(xiàn)為核呈深棕色染色。陽性細(xì)胞率見表1，表2。3討論

對腦腫瘤、血管畸形等疾病引起的癥狀性癲癇的放射治療后發(fā)現(xiàn)癲癇癥狀有不同程度的好轉(zhuǎn)，從而提示放射治療對癲癇發(fā)作可能有抑制作用。Regis［3］用γ刀治療16例顳葉癲癇的患者，隨訪1年中81%達(dá)到完全緩解，且除1例出現(xiàn)無癥狀性視野缺損外無明顯并發(fā)癥，但Srikijvilaikul［4］報道5例顳葉癲癇患者利用Regis同樣的方法進(jìn)行20Gy放射治療，2例術(shù)后1年內(nèi)死亡，另外3例均無效。所以放療治療癲癇的有效性及其可能的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

GABA能神經(jīng)元占大腦神經(jīng)元的40%，當(dāng)GABA含量下降超過40%時就可能出現(xiàn)癲癇發(fā)作?，F(xiàn)有的抗癇藥物也多是通過GABA產(chǎn)生作用，如苯二氮艸卓、苯巴比妥、丙戊酸是通過增加GABA的抑制，而新的抗癇藥物的研究方面更加突出GABA的作用［5］，如氨己烯酸、加巴噴啶則、噻加賓等。GABA主要的作用是通過與突觸部位的GABA受體結(jié)合而產(chǎn)生中樞興奮的抑制作用，癲癇發(fā)作除了與GABA含量有關(guān)外還與GABA受體有關(guān)。GABA-R有多種類型［6～8］，其中主要包括A、B、C三種類型，Nishimura［6］等在電刺激癲癇持續(xù)狀態(tài)和化學(xué)點(diǎn)燃的大鼠動物模型中都發(fā)現(xiàn)GABAAR的早期和持續(xù)的下降(43%～78%)，而B受體卻有不同程度的升高，說明變化的最主要的是A受體。在A型受體中，又有很多的亞單位組成，Macdonald等［7］發(fā)現(xiàn)原發(fā)性強(qiáng)直—痙攣性癲癇與GABAAR的基因突變有關(guān)，而且不同亞單位的突變與不同的發(fā)作類型有明顯的相關(guān)性。Ni等［8］發(fā)現(xiàn)在癲癇大鼠中不論是單次發(fā)作還是多次發(fā)作組中均有GABAARα1亞單位的減少。本研究也選用了α1亞單位。

所以如果X線放射的方法使神經(jīng)元中的GABA或者GABAARα1亞單位含量增加都可能產(chǎn)生抗癇作用。本研究顯示癲癇大鼠在接受12～24Gy放射治療后表現(xiàn)為GABA和GABAARα1亞單位含量的增加，而在6Gy的放射并不引起GABA的明顯變化，說明在12～24Gy的X線放射都可能產(chǎn)生抗癇作用。長期效果的觀察中發(fā)現(xiàn)GABA或者GABAARα1亞單位含量增加都可以在放射后24h達(dá)到高峰，并維持在較高水平達(dá)到1周以上，特別是GABAARα1亞單位在放射后1周內(nèi)基本無明顯的含量變化。而通過動物的癲癇發(fā)作情況也證實(shí)在治療后癲癇未再見有自發(fā)或誘發(fā)的癲癇發(fā)作，與GABA和GABAARα1亞單位的增加結(jié)果相一致，說明這兩個因素可能參與了X線照射后產(chǎn)生的抗癇作用，而且在早期就產(chǎn)生抗癇作用且維持時間較長。Ananeva等［9］認(rèn)為低劑量照射后GABA的受體結(jié)構(gòu)變化可能是影響突觸電活動的主要因素。

放射治療的劑量存在比較大的爭議，尚不能確定多大的放射劑量對腦組織產(chǎn)生影響可以消除或減少癲癇的發(fā)作。Sun［10］在大鼠的海馬癲癇模型上進(jìn)行10、40Gy的放射治療，發(fā)現(xiàn)40Gy組在放電頻率和持續(xù)時間上都明顯減少，而10Gy組效果不良。低劑量對腦組織無明顯的細(xì)胞學(xué)的改變，而大劑量可以達(dá)到150Gy，此時則可引起明顯的組織壞死和腦水腫，在癲癇治療中應(yīng)選擇一個最低有效劑量，達(dá)到治療的同時降低或避免腦組織損害。本研究中選擇了6、12、24Gy三組劑量，發(fā)現(xiàn)后兩組病例較對照組有明顯的GABA和GABAARα1亞單位的增多，而兩組間差異無顯著性，且12Gy放射組中的這兩者的增多也可能維持較長時間，所以12Gy應(yīng)當(dāng)是一個較為合理的癲癇治療劑量，但對于大鼠治療劑量與人類劑量間的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

［1］SchandraAA,MazaratiAM,GodlevskyLS,etal.Chemicalkinding:implicationsforantiepilepticdrugssensitiveandresistantepilepsymodels［J］.Epilepsia,1996,37(3):269-274.

［2］王升旭,李求實(shí).睡眠剝奪對大鼠腦組織氨基酸遞質(zhì)含量的影響［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2002,22(10):888-890.

［3］RegisJ,BartolomeiF,ReyM,etal.Gammaknifesurgeryinmesialtemporallobeepilepsy［J］.JNeurosurg,2000,93(S3):141-146.

［4］SrikijvilaikulT,NajmI,Foldvary-SchaeferN,etal.Failureofgammakniferadiosurgeryformesialtemporallobeepilepsy:reportoffivecases［J］.Neurosurgery,2004,54(6):1395-402.

［5］CzapinskiP,BlaszczykB,CzuczwarSJ.Mechanismsofactionofantiepilepticdrugs［J］.CurrTopMedChem,2005,5(1):3-14.

［6］NishimuraT,SchwarzerC,GasserE,etal.AlteredexpressionofGABA(a)andGABA(b)receptorsubunitmRNAsinthehippocampusafterkindlingandelectricallyinducedstatusepilepticus［J］