冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵菌絲體中化學(xué)成分分析

收稿日期:2007-02-02基金項(xiàng)目:國家“863”資助項(xiàng)目(2006AA10Z347;天津科技大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20060207作者簡介:譚之磊(1977-,男,助理研究員,研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail:tanzhilei@*通訊作者:賈士儒(1954-,男,教授,研究方向?yàn)榘l(fā)酵微生物學(xué)。E-mail:jiashiru@冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵菌絲體中化學(xué)成分分析譚之磊,殷海松,黃皓,賈士儒*(天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津300457摘要:對(duì)冬蟲夏草(Cordycepssinensis液態(tài)發(fā)酵菌絲體的主要化學(xué)成分進(jìn)行了分析。冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體中粗蛋白和粗脂肪的含量分別為24.53%和6.69%;腺苷含量為0.3755mg/g,D-甘露醇含量為88.80mg/g,胞內(nèi)多糖含量為133.9mg/g,麥角甾醇含量為1.80mg/g。冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵菌絲體主要成分含量與天然蟲草相似。關(guān)鍵詞:冬蟲夏草(Cordycepssinensis;發(fā)酵菌絲體;化學(xué)成分ChemicalIngredientsofSubmergedCultivationMyceliumofCordycepssinensisTANZhi-lei,YINHai-song,HUANGHao,JIAShi-ru*(TianjinKeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology,SchoolofBioengineering,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,ChinaAbstract:ThisinvestigationcharacterizedthemainchemicalingredientsofsubmergedcultivationmyceliumofCordycepssinensis.Tteinandcrudefatwere24.53%and6.69%respectively;Thecontentsofadenosine,mannitol,intracellularpolysaccharideandergosterolwere0.3755,88.80,133.9and1.80mg/grespectively.ThelevelofmainingredientsinthesubmergedcultivationmyceliumwassimilartothatinthenaturalCordycepssinensis.Keywords:Cordycepssinensis;submergedcultivationmycelium;chemicalingredients中圖分類號(hào):TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1002-6630(200803-0328-04冬蟲夏草(Cordycepssinensis,又名蟲草,是麥角科真菌冬蟲夏草(Cordycepssinensis(Berk.Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合物,在中國、日本、韓國等國被廣泛用作滋補(bǔ)食品或補(bǔ)藥。冬蟲夏草具有多種藥理作用如:抗腫瘤[1-3]、免疫調(diào)節(jié)[4]、抗氧化[5]等。其中蟲草多糖具有抗腫瘤作用和抗氧化作用;腺苷具有抑制血小板凝聚作用;甾醇類物質(zhì)具有抗腫瘤作用;D-甘露醇具有利尿脫水、鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘作用。冬蟲夏草子實(shí)體及無性型菌絲體的化學(xué)成分的種類基本相同[6],但是含量差異明顯[7]。近年來,由于過量采集,自然界中野生蟲草越來越少;同時(shí),市場的需求量在不斷增大,野生蟲草已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。因此,大量人工培養(yǎng)的蟲草菌絲體被開發(fā)成保健品和藥品。與冬蟲夏草人工栽培和固體培養(yǎng)相比,液體深層培養(yǎng)具有容易控制培養(yǎng)條件、易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。開發(fā)人工蟲草產(chǎn)品,使其化學(xué)成份和含量接近于野生蟲草的化學(xué)成份,對(duì)確保其療效是非常重要的。本研究對(duì)深層液體培養(yǎng)獲得的冬蟲夏草菌絲體的有效成分進(jìn)行了分析,為開發(fā)人工蟲草產(chǎn)品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料與方法1.1材料冬蟲夏草菌(Cordycepssinensis天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院。將PDA斜面菌種接種到裝有50ml土豆葡萄糖培養(yǎng)基(土豆200g/L,葡萄糖30g/L,蛋白胨15g/L,KH2PO43.0g/L,MgSO4?7H2O1.5g/L,滅菌前pH調(diào)到5.5的250ml三角瓶中,150r/min,24℃培養(yǎng)3d,作為液體種子。用5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基相同,工作體積為3L,接種量10%,24℃培養(yǎng)6d。初期攪拌速率為200r/min,發(fā)酵第3d升至350r/min,第4d后為400r/min。培養(yǎng)基的通氣速率為1vvm。發(fā)酵結(jié)束后7000×g離心15min收集菌絲體。菌絲體冷凍干燥后用粉碎機(jī)研磨成粉末備用。1.2試劑腺苷標(biāo)準(zhǔn)品、麥角甾醇(分析純Sigma公司;乙醇、甲醇為國產(chǎn)色譜純;其他試劑為國產(chǎn)分析純。1.3儀器1100SeriesLCChemstation高效液相色譜儀、1100系列VWD可變波長檢測器Agilent公司。1.4方法1.4.1粗蛋白含量測定凱氏定氮法[8]。1.4.2水溶性蛋白含量的測定考馬斯亮藍(lán)染色法[9]。1.4.3粗脂肪含量的測定索氏脂肪抽提法-Soxhlet[8]。1.4.4總糖含量的測定[10]取冬蟲夏草發(fā)酵菌粉0.2g,精密稱定,置于50ml圓底燒瓶中,加入6mol/LHCl10ml,蒸餾水15ml,在沸水浴中水解1.5h,過濾,用蒸餾水沖洗殘?jiān)?以酚酞為指示劑,用10%NaOH中和至微紅色,最后定容至100ml,苯酚-硫酸法比色測定總糖。1.4.5腺苷含量的分析[11]取蟲草發(fā)酵菌粉1.0g,精密稱定,于索氏提取器中加50%乙醇50ml,回流提取2.0h,提取液濃縮至10ml,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,即為供試液。采用高效液相色譜測含量。色譜條件:色譜柱:TSK-GELODS-100S(4.6×250mm;柱溫:30℃;檢測波長:260nm;流動(dòng)相:0.02mol/L磷酸二氫鉀:甲醇(80:20;流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:20μl。標(biāo)準(zhǔn)曲線與含量分析參見文獻(xiàn)[11]。1.4.6冬蟲夏草胞內(nèi)多糖含量的分析[12]取冬蟲夏草菌粉2.0g,精密稱定,以20倍體積的水浸泡,加熱至微沸,維持溫度1.0h,冷卻至室溫,4000r/min離心20min,殘?jiān)貜?fù)提取2次,合并三次上清液,真空濃縮至溶液濃度約0.5g生藥/ml,加入2倍體積的95%乙醇醇析24h,離心收集沉淀,冷凍干燥即得到冬蟲夏草粗多糖。將粗胞內(nèi)多糖用蒸餾水溶解,用苯酚-硫酸法測定胞內(nèi)多糖含量。1.4.7D-甘露醇含量的分析[13]取發(fā)酵菌絲體粉2.0g,精密稱定,加蒸餾水50ml,回流2h后過濾,用蒸餾水洗殘?jiān)?將濾液、洗液合并于50ml容量瓶中,加蒸餾水至刻度。精密量取濾液1.0ml置100ml容量瓶中,加蒸餾水至刻度為供試品溶液。通過比色法分析冬蟲夏草中D-甘露醇含量。1.4.8麥角甾醇含量的分析[14]取0.5g冬蟲夏草菌絲體粉,精密稱定,置250ml圓底回流瓶中,加入20%氫氧化鉀溶液20ml和無水乙醇10ml,沸水浴中回流2.5h。冷至室溫,加乙醚25ml,劇烈震蕩15min,靜置2h,分層,取上層萃取液于波長281.5nm測定吸收度。2結(jié)果與分析2.1粗蛋白、粗脂肪和總糖的分析冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體中粗蛋白、水溶性蛋白、粗脂肪和總糖含量見表1。冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體中的粗蛋白質(zhì)含量為24.53%,低于天然冬蟲夏草和固體發(fā)酵菌絲體中粗蛋白的含量[7,15-16];但高于Tai-HaoH等[7]報(bào)道的冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體中粗蛋白含量14.80%。冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體中粗脂肪含量為6.69%,略低于Tai-HaoH等[7]報(bào)道天然冬蟲夏草蟲體和子實(shí)體中粗脂肪含量(分別為8.62%和9.09%,與王尊生等[15]報(bào)道的冬蟲夏草(Cordycepssinensis菌絲體固體發(fā)酵粉中的粗脂肪含量6.45%和Tai-HaoH等[7]報(bào)道液體發(fā)酵菌絲體中粗脂肪含量6.63%基本一致。水溶性蛋白質(zhì)含量為1.77%,高于張巧霞等[17]測得的天然冬蟲夏草水溶性蛋白含量1.00%和蟲草菌HK-1液體發(fā)酵菌絲體中水溶性蛋白含量1.20%。冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體中總糖含量為41.75%,高于Tai-HaoH等[7]報(bào)道的野生冬蟲夏草及固體酵菌絲體中的總糖含量(分別為24.90%和23.30%,與其報(bào)道的液體發(fā)酵菌絲體中總糖含量39.40%非常接近。2.2主要活性成分分析冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵菌絲體中腺苷、胞內(nèi)多糖、D-甘露醇和麥角甾醇含量見表2。腺苷是冬蟲夏草中的主要活性成分,通過HPLC測定的冬蟲夏草發(fā)酵菌絲體中腺苷含量為0.3755mg/g,色譜圖見圖1,與天然冬蟲夏草腺苷含量接近[7,18];高于趙祥軍等報(bào)道的人工蟲草菌絲體中腺苷含量0.2652mg/g[19]。本實(shí)驗(yàn)室通過液體培養(yǎng)獲得的冬蟲夏草菌絲體符合2005年《中國藥典》冬蟲夏草腺苷含量大于0.1mg/g的要求。含量(%成分冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體天然冬蟲夏草子實(shí)體冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體冬蟲夏草菌絲體固體發(fā)酵粉粗蛋白24.5330.40[7]14.80[7]30.81[15]粗脂肪6.699.09[7]6.63[7]6.45[15]水溶性蛋白1.771.00[17]1.20[17]總糖41.7524.90[7]39.40[7]23.30[15]表1冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵菌絲體粗成分分析Table1AnalysisofproximatecompositionofsubmergedcultivationmyceliumofCordycepssinensis近年來,由于多糖具有清除自由基、抗氧化、抗病毒、肝保護(hù)、抗纖維化和降低膽固醇等功效而倍受人們的關(guān)注[20]。但是由于提取和檢測方法的不同,不同文獻(xiàn)報(bào)道的冬蟲夏草多糖含量存在比較大的差異。本實(shí)驗(yàn)室通過深層液體培養(yǎng)獲得的冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體中多糖含量為133.9mg/g,與蟲草固體發(fā)酵粉中多糖含量接近[15],高于沈曉云等報(bào)道的天然冬蟲夏草胞內(nèi)多糖含量3%[21]。通過比色法測得的冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體中D-甘露醇的含量為88.8mg/g。汪寶琪等用薄層掃描分析法測定西藏冬蟲夏草中的D-甘露醇含量為84.0mg/g[22]。李雪芹等通過比色法測定天然冬蟲夏草的甘露醇含量為110.0mg/g,而人工蟲草膠囊中甘露醇含量最高為68.3mg/g[13]。本實(shí)驗(yàn)及汪寶琪等人的研究結(jié)果表明人工培養(yǎng)的蟲草中D-甘露醇含量一般要低于天然冬蟲夏草中的含量。本實(shí)驗(yàn)室通過液體培養(yǎng)獲得的菌絲體中D-甘露醇含量要高于其他報(bào)道的人工培養(yǎng)蟲草中D-甘露醇含量,而且比較接近天然冬蟲夏草中的D-甘露醇含量。麥角甾醇是VD2的前體物質(zhì),它也被用于生產(chǎn)可的松和黃酮激素,具有重要的藥用價(jià)值。冬蟲夏草液體發(fā)酵菌絲體中麥角甾醇含量為1.80mg/g,高于李紹平等報(bào)道的人工冬蟲夏草菌絲體中麥角甾醇的含量0.89~1.44mg/g和王尊生等報(bào)道的固體發(fā)酵菌絲體中麥角甾醇的含量1.38mg/g[15],但低于李紹平等報(bào)道的天然冬蟲夏草中麥角甾醇的含量[23]。3結(jié)論從以上分析結(jié)果中可知,本實(shí)驗(yàn)室通過深層液體培養(yǎng)獲得的冬蟲夏草菌絲體中蟲草多糖、腺苷、D-甘露醇、麥角甾醇等主要功能成分與天然冬蟲夏草一致且含量相近,甚至高于天然冬蟲夏草。由于目前野生蟲草越來越少,藥理實(shí)驗(yàn)證明冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵菌絲體與天然冬蟲夏草有相似的藥理作用[5],通過人工栽培和固體發(fā)酵獲得生物活性物質(zhì)又還存在一些缺點(diǎn),因此通過冬蟲夏草深層液體培養(yǎng)獲得生物活性物質(zhì)是一種非常有應(yīng)用前途的方法。參考文獻(xiàn):[1]BOKJW,LERMERL.AntitumorsterolsfromthemyceliaofCordycepssinensis[J].Phytochemistry,1999,51(7:891-898.[2]NAKAMURAK,YAMAGUCHIY,KAGOTAS,etal.ActivationofInkupffercellfunctionbyoraladministrationofCordycepssinensisinrats[J].Japanesejournalofpharmacology,1999,79(4:505-508.[3]CHOMA,LEEDS,KIMMJ,etal.AntimutagenicityandcytotoxicityofcordycepinisolatedfromCitaris[J].FoodScienceandBiotechnology,2003,12(5:472-475.[4]YANGLY,HUANGWJ,HSIEHHG,etal.H1-Aextractedfrom25002000150010005000012345674.011mAU時(shí)間(min5.731A300250200150100500012345673.980mAU時(shí)間(min5.685B5.396880.8043.33.2613.5304.180A:腺苷標(biāo)準(zhǔn)品;B:液體發(fā)酵菌絲體提取物。圖1腺苷的色譜圖Fig.1Chromatogramofadenosine3.678含量(mg/g生物活性成分冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵菌絲體天然冬蟲夏草人工培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體0.37550.3966[18]0.2652[19]腺苷0.311[7]1.930[7]胞內(nèi)多糖133.930.0[21]175.9[15]D-甘露醇88.884.0[22]68.3[13]110.0[13]麥角甾醇1.803.57~10.68[23]0.89~1.44[23]1.38[15]表2冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵菌絲體生物活性成分分析Table2AnalysisofbioactiveingredientsofsubmergedcultivationmyceliumofCordycepssinensisCliferationofhumanmesangialmotesapoptosis,probablybyinhibitingthetyrosinephosphorylationofBcl-2andBcl-XL[J].JournalofLaboratoryandClinicalMedicine,2003,141(1:74-83.[5]LISP,LIP,DONGTTX,etal.Anti-oxidationactivityofdifferenttypesofnaturalCordycepssinensisandculturedCordycepsmycelia[J].Phytomedicine,2001,8(3:207-212.[6]LISP,SUZR,DONGTTX,etal.ThefruitingbodyanditscaterpillarhostofCordycepssinensisshowcloseresemblanceinmainconstituentsandanti-oxidationactivity[J].Phytomedicine,2002,9(4:319-324.[7]TAI-HAOH,LI-HUAS,CHIENYANH,etal.ApositionandbioactiveingredientsoftheChinesemedicinalmushroomDongChongXiaCao,itscounterfeitandmimic,andfermentedmyceliumofCordycepssinensis[J].FoodChemistry,2002,78:463-469.[8]王福榮.生物工程分析與檢測[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2005:118-170.[9]李建武,蕭能賡,余瑞元,等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].北京:人民教育出版社,1994:174-177.[10]薛德鈞,章明.三種肉蓯蓉糖類成分的分析[J].中藥材,1994,17(2:36-37.[11]吳春敏,葉榕平.HPLC法測定冬蟲夏草中腺苷含量[J].中草藥,1999,30(9:658-660.[12]張國華,李紹平,季暉,等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化冬蟲夏草多糖的提取工藝[J].安徽醫(yī)藥,2004,8(6:404-405.[13]李雪芹,包天桐,王雁.比色法測定冬蟲夏草