不同激素處理對(duì)銀條根生長(zhǎng)發(fā)育的影響

銀條莖尖的脫毒組織培養(yǎng)和植株再生河南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文PAGEIIPAGEIV不同激素處理對(duì)銀條根生長(zhǎng)發(fā)育的影響摘要銀條（StachysfloridanaSchuttl.exBenth），又名地靈，系唇形科水蘇屬多年生蓄根草本植物，其地下根狀莖圓狀細(xì)長(zhǎng)，肉質(zhì)潔白，酷名銀條似白銀，故；據(jù)傳是唐僧取經(jīng)過(guò)程中所得，又被譽(yù)為“唐僧肉”。目前，全國(guó)人工種植面積很少，洛陽(yáng)偃師縣（市）是主要產(chǎn)地，約占全國(guó)產(chǎn)量的95%，僅春節(jié)左右大量上市，同時(shí)遠(yuǎn)銷國(guó)內(nèi)外，在市場(chǎng)上常供不應(yīng)求[2]。本研究通過(guò)對(duì)銀條根部分化的培養(yǎng)條件、不同處理對(duì)提高生根率的效果進(jìn)行了研究，并利用不同外植體探討了銀條再生快繁的適宜途徑。目的是獲得脫毒種株并進(jìn)性大量、快速的繁殖，以解決生產(chǎn)中銀條由于結(jié)籽率低，且難以培養(yǎng)成苗，長(zhǎng)期以根狀莖進(jìn)行無(wú)性繁殖所造成的病毒累積的問(wèn)題，并為進(jìn)一步進(jìn)行銀條的營(yíng)養(yǎng)利用、生理代謝、生物育種研究奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果表明：銀條的離體培養(yǎng)以MS作為基本培養(yǎng)基最為適宜，再生苗生長(zhǎng)快速，植株健壯。莖段在MS+0.2mg/LNAA+活性炭3%的培養(yǎng)基中有最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)，在較高的NAA或IBA濃度下，莖段下端愈傷樣化嚴(yán)重，不定根產(chǎn)生量少，在IBA的作用下，銀條莖葉纖弱不利于移栽成活。在MS+0.2mg/LNAA的培養(yǎng)基中，莖段生根量大，根型良好，莖葉粗壯，加入活性炭后，根的長(zhǎng)度進(jìn)一步增長(zhǎng)，呈乳白色，移栽成活率達(dá)90%以上。關(guān)鍵詞：銀條莖段不定根植株再生MS培養(yǎng)基StachysfloridanaMreistemCultureand PlantletRegenerationofVenomTissue RemovalABSTRACTStachysfloridana,alsoknownasLing,LamiaceaeStachysisabuildrootperennialherb,itsundergroundrhizomesroundedslender,whitemeat,resemblessilver,hencethenameStachysfloridana;AccordingtolegendJourneytotheWest.,alsoknownasthe"officialtoldus.Theplantedareararely,LuoyangYanshicounty(city)isthemainproducer,accountingforabout95%ofnationaloutput,alargenumberoflistedonlyaroundtheSpringFestival,andsoldathomeandabroad,ofteninshortsupplyinthemarket.Inthisstudy,onStachysfloridanaapicalmeristemcultureconditions,differenttreatmentstoimprovetheeffectofshoottipsregeneratedplantsdetoxificationrateanddifferentexplantssuitablewaytoexploretheStachysfloridanarenewablerapidpropagation.Theresultsshowed:SilverCulturedwithMSasbasicculturemediumwasthemostsuitableregenerationseedlinggrowth,rapid,robustplants.StemsgrowbestintheculturemediumMS+0.2mg/LNAA+3%ofactivatedcarbon,thehigherNAAorIBAconcentration,thelowerendofseriousstemscallus,adventitiousrootsproducedinsmallamounts,inthepresenceofIBA,silverleafdelicateisnotconducivetothetransplantingsurvival.IntheculturemediumwithMS+0.2mg/LNAA,stemsegmentlargerquantityrooting,root,stemandleafstout,addingactivatedcarbon,rootlengthincreased,milkywhite,thetransplantingsurvivalratereachedmorethan90%.Keywords:Stachysfloridana，Stemsegment，Adventitiousroot，Plantregeneration，MSmedium目錄摘要 IABSTRACT II第一章前言 11.1銀條的生產(chǎn)現(xiàn)狀與價(jià)值 11.1.1銀條的形態(tài)特征及生產(chǎn)現(xiàn)狀 11.1.2銀條的食用價(jià)值 21.2植物組織培養(yǎng)的快繁技術(shù)及應(yīng)用 21.2.1組織培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)介 21.2.2唇形科相關(guān)植物的組培及根誘導(dǎo)介紹 3冬凌草 31.2.3脫毒材料的保存快繁 41.3銀條的研究現(xiàn)狀 51.3.1銀條莖尖玻璃化法超低溫保存及其植株再生 51.3.2關(guān)于銀條的莖尖分生組織的脫毒及再生 61.3.3銀條加工中燙漂護(hù)色工藝的研究 71.3.4銀條根莖膨大過(guò)程中生理生化變化的研究 71.3.5銀條組培研究 81.4本研究的目的和意義 9第二章實(shí)驗(yàn)部分 102.1材料與方法 102.1.1材料 102.1.2儀器與試劑 102.1.3主要溶液及配制 102.1.4方法 112.2結(jié)果與分析 132.2.1銀條根的生長(zhǎng) 132.2.2討論與分析 142.3結(jié)論 14參考文獻(xiàn) 15致謝 18附錄 19英語(yǔ)文獻(xiàn) 20縮寫詞英文中文名稱cmCentimeter厘米dDay天hHour小時(shí)minMinute分鐘sSecond秒gGram克mol/LPorLitreMoore摩爾每升mg/LPorLitermilligram毫克每升MSMSmediumMS培養(yǎng)基LxLux勒克斯2,4-D2,4-DiehlorophenoxyaceticAcid2,4-二氯苯氧乙酸6-BA6-Benzylaminopurine6-芐氨基嘌呤NAAα-NaphthaleneaeeticAcid萘乙酸IAAIndole-3-aceticacid吲哚乙酸KTKinetin6-糖基氨基嘌呤PAGE32第一章前言銀條（StachysfloridanaSchuttl.exBenth），又名地靈，系唇形科水蘇屬多年生蓄根草本植物，其地下根狀莖圓狀細(xì)長(zhǎng)，肉質(zhì)潔白，酷似白銀，故名銀條；據(jù)傳是唐僧取經(jīng)過(guò)程中所得，又被譽(yù)為“唐僧肉”。銀條作為功能性食品具有很高的藥用價(jià)值，對(duì)治療高血壓、高血脂和肥胖等常見(jiàn)疾病有著顯著療效。近年來(lái)，我國(guó)專家首次發(fā)現(xiàn)銀條內(nèi)含有豐富的水蘇糖，并證明其水蘇糖的含量比國(guó)際上通用的大豆原料提取的含量要高出2～3倍，而水蘇糖能迅速改善人體消化道內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡，可軟化血管、降低血脂、改善血液循環(huán)具有獨(dú)特的功效，還具有潤(rùn)肺、益腎之功效，其益壽延年的作用非常顯著，是目前國(guó)際上非常暢銷的保健藥品之一[1]。銀條還具有獨(dú)特的食用價(jià)值，其肉質(zhì)脆嫩，無(wú)纖維、可鹽漬和涼拌等，風(fēng)味獨(dú)特，2001年6月上海APEC會(huì)議，六國(guó)首相品嘗后稱其為“世界奇菜”。銀條主產(chǎn)于華北和新疆等地，處于半野生狀態(tài)，喜溫暖和濕潤(rùn)的氣候，對(duì)土壤要求較嚴(yán)格，需有水而不濕、有沙而不松的沙白土。目前，全國(guó)人工種植面積很少，洛陽(yáng)偃師縣（市）是主要產(chǎn)地，約占全國(guó)產(chǎn)量的95%，僅春節(jié)左右大量上市，同時(shí)遠(yuǎn)銷國(guó)內(nèi)外，在市場(chǎng)上常供不應(yīng)求[2]。1.1銀條的生產(chǎn)現(xiàn)狀與價(jià)值1.1.1銀條的形態(tài)特征及生產(chǎn)現(xiàn)狀偃師銀條根系較淺．地上莖直立。株高59～70cm。葉對(duì)生。葉卵圓形，綠色?；ㄗ仙?。輪傘花序?；ㄆ?～6月份。地下有膨大的根狀甸甸莖，根狀莖側(cè)生有具鱗葉。質(zhì)地細(xì)密、嫩脆多汁、色白、味甘。果實(shí)為小堅(jiān)果，含1粒種子，黑色。卵圓形或長(zhǎng)卵圓形[9]。偃師銀條現(xiàn)種植面積400hm，產(chǎn)量1萬(wàn)t，占國(guó)內(nèi)銀條產(chǎn)量的95以上，每667m銀條能為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民帶來(lái)4000~6000元收入。偃師銀條種植面積受市場(chǎng)銷售量影響較大，產(chǎn)品銷售旺時(shí)，種植面積達(dá)700hm，產(chǎn)量2萬(wàn)t，常年種植面積400hm左右，產(chǎn)量1．1萬(wàn)t左右。偃師銀條集中種植在城關(guān)鄉(xiāng)、三化鄉(xiāng)，城關(guān)鄉(xiāng)的后莊、東寺莊、西寺莊等沿河一帶生產(chǎn)的銀條質(zhì)最好，被定為“河南省無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品種植基地”。偃師市銀條加工企業(yè)現(xiàn)有14家，有5家銀條生產(chǎn)企業(yè)通過(guò)IS09001國(guó)際質(zhì)量體系認(rèn)證。其中西銀公司等三家企業(yè)在國(guó)家商標(biāo)局注冊(cè)了商標(biāo)，并獲國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)和河南省質(zhì)監(jiān)局頒發(fā)的“無(wú)公害產(chǎn)品標(biāo)志”證書，產(chǎn)品銷往北京、上海、廣州等32個(gè)大中城市，出口到日本、韓國(guó)、新加坡、泰國(guó)、俄羅斯等8個(gè)國(guó)家和地區(qū)。在第二屆中西部國(guó)際博覽會(huì)上，偃師銀條獲2項(xiàng)金獎(jiǎng)，5家參展企業(yè)的產(chǎn)品被搶購(gòu)一空，簽訂合同訂單1萬(wàn)t[8]。1.1.2銀條的食用價(jià)值銀條菜富合蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和氨基酸，是食用和藥用兼?zhèn)涞拿厥卟似贩N。對(duì)人體有多種保健效果，延年益壽作用明顯，在《中國(guó)蔬菜品種志》中已有詳細(xì)的記載。河南偃師地區(qū)的“偃師銀條”最為有名，具有悠久的食用歷史。它富含一種被世界食品醫(yī)藥界譽(yù)為“健康寶貝”和“超強(qiáng)雙歧因子”的物質(zhì)-水蘇糖。作為天然四糖的水蘇糖，簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)表示為半乳糖-半乳糖-葡萄糖-果糖。是功效最優(yōu)越的益生元，是已獲得美國(guó)FDA認(rèn)證的寡糖產(chǎn)品。添加水蘇糖的食品，因?yàn)榫哂锌顾ダ?、健康防病的功效，日漸風(fēng)靡于日本和歐美市場(chǎng)。據(jù)現(xiàn)代科學(xué)測(cè)定：銀條富含糖類、酚類、維生素C、粗蛋白、氨基酸、有機(jī)酸等物質(zhì)，對(duì)軟化血管、降低血脂、改善血液循環(huán)具有獨(dú)特的療效[6]。1.2植物組織培養(yǎng)的快繁技術(shù)及應(yīng)用1.2.1組織培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)介自從1943年懷特（White）提出植物細(xì)胞“全能性”（Totipotency）學(xué)說(shuō)及諸多后學(xué)者（Steward，1958，Guha和Marteshwari，1964）相繼證實(shí)后，引發(fā)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)快繁技術(shù)的勃然興起。我國(guó)的專家學(xué)者在20世紀(jì)70年代后也在此領(lǐng)域做了大量的研究和開(kāi)發(fā)工作，創(chuàng)造了很多新方法、新技術(shù)，提出不少新成果，開(kāi)拓了植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的新局面。脫毒株苗具有無(wú)雜菌、繁育較快、質(zhì)量?jī)?yōu)、繁殖系數(shù)高、大批量生產(chǎn)、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，已得到有關(guān)專家的鑒定及高度評(píng)價(jià)。例如脫毒馬鈴薯、甘薯、生姜、大蒜、草莓、苗木、花卉等等都是運(yùn)用組培脫毒技術(shù)得到的。植物組織培養(yǎng)（Planttissueculture）是指在無(wú)菌的條件下，將離體的植物（根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等）、組織（形成層、花藥組織、胚乳、皮層等）、細(xì)胞（體細(xì)胞和生殖細(xì)胞）以及原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，使其長(zhǎng)成完整的植株。由于培養(yǎng)物是脫離植物母體，在玻璃瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，所以也叫做離體培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)脫毒快繁是人工在無(wú)菌條件下利用植物體的一部分，在人工控制的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件下繁殖植物，脫除病毒得到無(wú)毒苗株，繼而在大田快速繁殖的技術(shù)。脫毒主要是進(jìn)行莖尖培養(yǎng)脫除病毒，它是現(xiàn)代生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞工程中的一項(xiàng)具有重要應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)。對(duì)于脫毒苗、新育成、新引進(jìn)、稀缺物種、瀕危植物和基因工程植株等可通過(guò)離體快速繁殖，繁殖比傳統(tǒng)的方法高達(dá)數(shù)百倍以上。植物脫毒技術(shù)的利用及脫毒良種的推廣，帶來(lái)一場(chǎng)新的農(nóng)業(yè)技術(shù)革命。通過(guò)脫毒，使作物恢復(fù)種性，增強(qiáng)抗性，生長(zhǎng)健壯。1.2.2唇形科相關(guān)植物的組培及根誘導(dǎo)介紹冬凌草RabdosiaRubescens(Hcnsi)Hara又名冰凌草,屬唇形科香茶菜屬，多年生草本或亞灌木植物，主要分部在我國(guó)河南、四川、安徽等中西部地區(qū)以MS為基本培養(yǎng)基，運(yùn)用正交設(shè)計(jì)方法，利用植物組織、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，成功地建立了冬凌草的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系。研究出：不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS＋0.2mg·L-1IBA＋0.1mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1NAA；生根培養(yǎng)基為1/2MS+1mg·L-1IBA+1g·L-1活性炭；以冬凌草莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷最佳培養(yǎng)基為MS+1.5mg·L-16-BA+2mg·L-12,4-D無(wú)菌苗的增殖快繁培養(yǎng)切取含2個(gè)腋芽的無(wú)菌苗莖段，長(zhǎng)約1～1.5cm，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法，正交設(shè)計(jì)表頭見(jiàn)表2.1，以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度IBA、NAA和6-BA激素配比的9種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基接種30株，每瓶3株，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件：溫度為（25±2）℃，光強(qiáng)2000lx光照時(shí)間13h/d，培養(yǎng)周期為30d。根的誘導(dǎo),挑選經(jīng)1.2.2步驟獲得的長(zhǎng)勢(shì)較好且長(zhǎng)度超過(guò)5.0cm的無(wú)菌試管苗，分別以1/2MS、MS和2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA和NAA激素，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶3株，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同上，培養(yǎng)時(shí)間20d.不同激素配比對(duì)生根的影響冬凌草試管苗接種到生根培養(yǎng)基上20d后，將其取出洗凈根部培養(yǎng)基，記數(shù)生根情況，結(jié)果見(jiàn)表2.4，從表2.4可以看出1號(hào)培養(yǎng)基的生根率最高，達(dá)到100%，2號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)基生根率雖然也很高達(dá)到90%以上，但是根長(zhǎng)和根數(shù)都沒(méi)有1號(hào)培養(yǎng)基中的好，而且1號(hào)培養(yǎng)基中小苗長(zhǎng)勢(shì)較好。并且通過(guò)極差分析得出，三個(gè)試驗(yàn)因素影響的主次是：活性炭>IBA>基本培養(yǎng)基，而且當(dāng)活性炭的量達(dá)3g·L-1時(shí)效果最好，因此誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基是：1/2MS+1mg·L-1IBA+1g·L-1活性炭。從方差分析可以看出，活性炭對(duì)冬凌草生根影響達(dá)到顯著水平(P值<0.05)，其他兩個(gè)因素影響不大，作用不顯著[11]。唇形科鞘蕊花屬彩葉草(Coleusblumeibenth)．彩葉草不定芽的最適生根培養(yǎng)基是1/2MS+0.5mg/LNAA組合，其平均生根率為92.5%[12]。1.2.3脫毒材料的保存快繁銀條的離體培養(yǎng)以MS作為基本培養(yǎng)基最為適宜，再生苗生長(zhǎng)快速，植株健壯。莖尖分生組織培養(yǎng)在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖4％+瓊脂6.5g/L上，成苗率可達(dá)74.1％，最適宜莖尖的培養(yǎng)；經(jīng)指示植物法、電鏡觀察檢測(cè)，再生植株的脫毒率隨莖尖切割長(zhǎng)度的減小而提高，但過(guò)小的莖尖操作、培養(yǎng)困難，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，成苗率低[13]。0.5mm大小的莖尖成苗率與脫毒率相對(duì)較高，分別為71.4％、30.0％，較為適合培養(yǎng)；莖尖的重復(fù)切割培養(yǎng)與接種植株進(jìn)行預(yù)熱處理均有顯著提高脫毒率的作用，但同時(shí)也降低了成苗率。植株在42℃高溫下，經(jīng)15d熱處理后，0.5mm大小莖尖切割培養(yǎng)成苗率與脫毒率分別達(dá)到50.0％、57.1％，重復(fù)切割培養(yǎng)3次后則分別為28.6％、87.5％。為減小操作難度，縮短周期，銀條植株經(jīng)42℃，15d熱處理后，切取0.5mm大小莖尖進(jìn)行一次培養(yǎng)較為適宜。不同生育時(shí)期的外植體愈傷組織的誘導(dǎo)能力不同，剛展開(kāi)的幼嫩葉片、粗壯的幼嫩莖段及花蕾長(zhǎng)度在0.5cm左右時(shí)的花藥最適宜愈傷的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率最高。幼嫩莖段與花藥在MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+IAA0.5mg/L培養(yǎng)基上，幼嫩葉片在MS+6-BA2.5mg/L+NAA1.5mg/L+IAA1.0mg/L上，愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，愈傷生長(zhǎng)快速，顏色鮮艷，繼代培養(yǎng)不褐化。愈傷組織不定芽的分化中，花藥誘導(dǎo)形成的愈傷難以形成不定芽；葉片與莖段誘導(dǎo)的愈傷可以在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.8mg/L+GA_32.0mg/L上分化形成不定芽，誘導(dǎo)分化率分別為71.4％、78.6％。對(duì)幼嫩葉片、幼嫩莖段與莖尖進(jìn)行不定芽的直接誘導(dǎo)與增殖，發(fā)現(xiàn)銀條葉片組織未能再生；莖尖、莖段組織直接誘導(dǎo)較大不定芽的再生率較低，平均每個(gè)外植體最多可誘導(dǎo)不定芽5～7個(gè)。而通過(guò)莖段先誘導(dǎo)出不定芽芽團(tuán)，再進(jìn)行芽的伸長(zhǎng)這一途徑，每個(gè)外植體誘導(dǎo)的不定芽數(shù)平均可提高到14.3個(gè)，且芽團(tuán)經(jīng)5次繼代增殖再生能力沒(méi)有衰退表現(xiàn)，再生植株生產(chǎn)潛力非常巨大，是一條較優(yōu)的再生途徑。莖段不定芽芽團(tuán)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加6-BA5.0mg/L的MS培養(yǎng)基;增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA4.5mg/L;不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基以MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.4mg/L較好。對(duì)不同溫度、光照條件、以及蔗糖、6-BA濃度對(duì)離體培養(yǎng)條件下銀條根狀莖誘導(dǎo)的影響進(jìn)行研究表明:全黑暗的培養(yǎng)條件是銀條根狀莖誘導(dǎo)的必需因子，短日照與長(zhǎng)日照均促使甸旬莖發(fā)育成側(cè)枝;高濃度蔗糖有利于根狀莖的誘導(dǎo)，單獨(dú)使用低濃度的蔗糖(3%)不能誘導(dǎo)根狀莖產(chǎn)生而形成黃化的側(cè)枝，再添加6-BA5..0mg/L后雖然可以形成根狀莖，但單株產(chǎn)量很低。6-BA對(duì)根狀莖形成具有明顯的促進(jìn)作用，能增加根狀莖數(shù)，提高單株產(chǎn)量。銀條根狀莖的誘導(dǎo)溫度以20℃1.3銀條的研究現(xiàn)狀1.3.1銀條莖尖玻璃化法超低溫保存及其植株再生為長(zhǎng)期穩(wěn)定保存銀條種質(zhì),建立了玻璃化法超低溫保存其莖尖的技術(shù)體系。選擇繼代4次的銀條無(wú)菌壯苗,5℃低溫馴化14d;剝?nèi)?mm的莖尖,在含有0.5mol.L-1蔗糖的MS(無(wú)Ca2+)液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)1d;25℃條件下經(jīng)改良MS+2PVS2裝載20min;在-20℃,95%乙醇浴中以PVS2脫水處理4h;更換新鮮的PVS3后投入液氮,保存24h后取出冷凍管在40℃水浴中化凍1min;以含有1.2mol.L-1蔗糖的改良MS(無(wú)Ca2+)溶液洗滌2次,每次10min;凍存后的莖尖相對(duì)存活率超過(guò)70%。將凍存后的莖尖轉(zhuǎn)接到再生培養(yǎng)基上,暗培養(yǎng)20d后轉(zhuǎn)入正常光照條件下培養(yǎng),存活率達(dá)1.3.2關(guān)于銀條的莖尖分生組織的脫毒及再生以“二細(xì)一粗”銀條作為研究試材，對(duì)銀條莖尖分生組織的培養(yǎng)條件、不同處理對(duì)提高莖尖再生植株脫毒率的效果進(jìn)行了研究，并利用不同外植體探討了銀條再生快繁的適宜途徑。目的是獲得脫毒種株并進(jìn)性大量、快速的繁殖，以解決生產(chǎn)中銀條由于結(jié)籽率低，且難以培養(yǎng)成苗，長(zhǎng)期以根狀莖進(jìn)行無(wú)性繁殖所造成的病毒累積的問(wèn)題，并為進(jìn)一步進(jìn)行銀條的營(yíng)養(yǎng)利用、生理代謝、生物育種研究奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果表明：銀條的離體培養(yǎng)以MS作為基本培養(yǎng)基最為適宜，再生苗生長(zhǎng)快速，植株健壯。莖尖分生組織培養(yǎng)在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖4％+瓊脂6.5g/L上，成苗率可達(dá)74.1％，最適宜莖尖的培養(yǎng)；經(jīng)指示植物法、電鏡觀察檢測(cè)，再生植株的脫毒率隨莖尖切割長(zhǎng)度的減小而提高，但過(guò)小的莖尖操作、培養(yǎng)困難，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，成苗率低。0.5mm大小的莖尖成苗率與脫毒率相對(duì)較高，分別為71.4％、30.0％，較為適合培養(yǎng)；莖尖的重復(fù)切割培養(yǎng)與接種植株進(jìn)行預(yù)熱處理均有顯著提高脫毒率的作用，但同時(shí)也降低了成苗率。植株在42℃高溫下，經(jīng)15d熱處理后，0.5mm大小莖尖切割培養(yǎng)成苗率與脫毒率分別達(dá)到50.0％、57.1％，重復(fù)切割培養(yǎng)3次后則分別為28.6％、87.5％。為減小操作難度，縮短周期，銀條植株經(jīng)42℃，15d熱處理后，切取0.5mm大小莖尖進(jìn)行一次培養(yǎng)較為適宜。不同生育時(shí)期的外植體愈傷組織的誘導(dǎo)能力不同，剛展開(kāi)的幼嫩葉片、粗壯的幼嫩莖段及花蕾長(zhǎng)度在0.5cm左右時(shí)的花藥最適宜愈傷的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率最高。幼嫩莖段與花藥在MS+6-BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L+IAA0.5mg/L培養(yǎng)基上，幼嫩葉片在MS+6-BA2.5mg/L+NAA1.5mg/L+IAA1.0mg/L上，愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，愈傷生長(zhǎng)快速，顏色鮮艷，繼代培養(yǎng)不褐化。愈傷組織不定芽的分化中，花藥誘導(dǎo)形成的愈傷難以形成不定芽；葉片與莖段誘導(dǎo)的愈傷可以在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.8mg/L+GA_32.0mg/L上分化形成不定芽，誘導(dǎo)分化率分別為71.4％、78.6％。對(duì)幼嫩葉片、幼嫩莖段與莖尖進(jìn)行不定芽的直接誘導(dǎo)與增殖，發(fā)現(xiàn)銀條葉片組織未能再生；莖尖、莖段組織直接誘導(dǎo)較大不定芽的再生率較低，平均每個(gè)外植體最多可誘導(dǎo)不定芽5～7個(gè)。而通過(guò)莖段先誘導(dǎo)出不定芽芽團(tuán)，再進(jìn)行芽的伸長(zhǎng)這一途徑，每個(gè)外植體誘導(dǎo)的不定芽數(shù)平均可提高到14.3個(gè)，且芽團(tuán)經(jīng)5次繼代增殖再生能力沒(méi)有衰退表現(xiàn)，再生植株生產(chǎn)潛力非常巨大，是一條較優(yōu)的再生途徑1.3.3銀條加工中燙漂護(hù)色工藝的研究郭香鳳，史國(guó)安以銀條為實(shí)驗(yàn)材料，以成品的褐變度為指標(biāo)，對(duì)銀條加工中燙漂護(hù)色工藝參數(shù)進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在95℃燙漂溫度下，燙漂3．0min，最佳褐變抑制劑組合為0．05％L-cys、0．05％VC、1％CA，產(chǎn)品的外觀色澤潔白；不同抑制劑抑制銀條褐變作用的順序是CA>L-cys>VC。單獨(dú)使用各種物理和化學(xué)抑制措施時(shí)，在95℃溫度下，熱燙3．0min，或分別在燙漂水中添加1％CA、0．05％L-cys、1％亞硫酸氫鈉時(shí)護(hù)色效果顯著。單獨(dú)使用抗壞血酸對(duì)銀條護(hù)色效果不顯著。鑒于亞硫酸氫鈉的副作用，建議銀條加工過(guò)程中應(yīng)避免其危害[20]。銀條采后加工過(guò)程中發(fā)生的褐變主要是由酶促褐變引起的。單獨(dú)或復(fù)合使用燙漂、檸檬酸、L．半胱氨酸等酶促褐變抑制措施對(duì)防止銀條的褐變是有效的1.3.4銀條根莖膨大過(guò)程中生理生化變化的研究張書玲，劉建鳳以銀條為材料，探討了銀條根狀莖中維生素C(VC)、抗壞血酸氧化酶(AAO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)在其根莖膨大時(shí)期含量的積累變化。結(jié)果表明：在根莖開(kāi)始膨大60d后，VC含量最高達(dá)61rag／100g；AAO酶活性在根莖膨大后30d達(dá)最大值0．147rag／g；SOD和POD酶活性在銀條根莖膨大后75d達(dá)到最高值為9．O5U／mg和l3．6Onmol·min-1·g-1；PPO在根莖膨大過(guò)程中出現(xiàn)上升一下降一上升的趨勢(shì)[9]。銀條根莖含有豐富的VC，特別是在根莖膨大中后期VC含量達(dá)到最大值。根據(jù)各國(guó)對(duì)成年人推薦的VC日攝人量，每日只需食用100~200g的銀條就能滿足人體的需要。VC含量在根莖膨大后75d出現(xiàn)稍微下降現(xiàn)象，可能是因?yàn)樗岛蟮厣喜糠珠_(kāi)始枯死導(dǎo)致。所以，在霜降前(10月中下旬)采收銀條會(huì)含有較高的VC。同時(shí)抗壞血酸氧化酶(AAO)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶是VC代謝過(guò)程中主要的氧化分解酶u。在植物細(xì)胞內(nèi)，VC的含量受這2個(gè)酶的影響。所以VC的含量和抗壞血酸氧化酶的活性大致相反而不會(huì)完全相反[1]。植物在生命過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(包括過(guò)氧化氫、超氧陰離子、羥自由基和單線態(tài)氧等)，而組織衰老的機(jī)理多歸于超氧自由基引起的膜脂氧化與過(guò)氧化的損害。SOD、POD是植物抗氧化酶系統(tǒng)中2種重要的酶。它們?cè)诨钚匝醯那宄?、抑制膜脂過(guò)氧化等植物抗逆生理方面發(fā)揮作用。隨著銀條根莖的生長(zhǎng)，在膨大后60d(11月上旬)，銀條的SOD和POD活性迅速上升，可能是因?yàn)樗狄院?，天氣逐漸變冷，在逆境下植物產(chǎn)生更多的氧自由基，加劇膜脂過(guò)氧化，SOD和POD酶活性的上升，是植物細(xì)胞對(duì)低溫逆境的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。另外，PPO能催化各種酚類物質(zhì)氧化成為醌，再聚合成黑色素，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變黑，是果蔬的儲(chǔ)藏和加工過(guò)程中引起褐變的主要酶類，從而降低果實(shí)色澤和品質(zhì)[27]。銀條在生長(zhǎng)的不同成熟期PPO的活性不同，在膨大后30～45d(9月下旬至l0月上旬)時(shí)PPO的活性較低，隨后緩慢上升，可以利用這個(gè)時(shí)期加工銀條，以提高其抗褐變作用[28]。1.3.5銀條組培研究為給草食蠶（銀條）的快繁研究提供參考，以草食蠶無(wú)菌苗為材料，比較研究不同激素配比條件下不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生。結(jié)果表明，草食蠶無(wú)菌苗葉片、葉柄和莖段均可作為離體培養(yǎng)的外植體，但葉柄效果最好。將外植體接種于添加6-BA(0.3～1.5rag／L)和NAA(0.05～0.80mg／L)的MS培養(yǎng)基上。經(jīng)14～16d培養(yǎng)，可100％脫分化產(chǎn)生綠色致密愈傷組織，且愈傷組織分化產(chǎn)生大量不定芽。將單芽莖段接種于添加KT(0.1～1.0mg／L)和NAA(0.05rag／L)的MS培養(yǎng)基上，經(jīng)4周培養(yǎng)，產(chǎn)生的芽苗健壯，增殖系數(shù)高達(dá)7．86。將高約3cm的芽接種于分別添加IAA(0.1～0.5mg／L)、IBA(0.1～0.5rag／L)或NAA(0.05～0.10mg／L)的1/2MS培養(yǎng)基上，可100％產(chǎn)生不定根，獲得完整的再生植株。生根苗采用“二步法”移栽，移栽成活率為92.5％。生根苗采用“二步法”移栽。移栽前，首先逐步打開(kāi)封口膜煉苗4～6d，然后以5cm厚珍珠巖為苗床，洗凈生根苗根部培養(yǎng)基后，均勻移入苗床。外搭塑料棚和遮陽(yáng)網(wǎng)，控制棚內(nèi)光強(qiáng)在10000lx以下，保持濕度在82％左右，溫度在30C以下，嚴(yán)格管理4周左右，成活后即可常規(guī)管理。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件啟動(dòng)培養(yǎng)基為不添加任何激素的MS培養(yǎng)基(MSO)，愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基為添加一定質(zhì)量濃度的6-BA和NAA或單獨(dú)添加2，4-D的MS培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)基為添加一定質(zhì)量濃度6-BA、KT、NAA和IAA的MS培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基為添加一定質(zhì)量濃度NAA、IBA和IAA的1/2MS培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均添加3％的蔗糖，用0.46%瓊脂固化，pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為(25土2)℃，光照強(qiáng)度為1500～2000Lx，光照時(shí)間14h/d。增殖芽的生根與移栽，將無(wú)根苗接種于生根培養(yǎng)基中，定期觀察，結(jié)果草食蠶較易生根，不添加任何激素時(shí)生根率可達(dá)93％，但根較細(xì)弱，不利于移栽。單獨(dú)添加不同生長(zhǎng)素時(shí)，均可100％誘導(dǎo)生根，且根發(fā)生早，接種4d后，即有根原基發(fā)生(見(jiàn)圖4)；IBA、IAA、NAA的質(zhì)量濃度影響根的生長(zhǎng)狀況，質(zhì)量濃度較低時(shí)產(chǎn)生的根細(xì)長(zhǎng)，質(zhì)量濃度較高時(shí)生根較早且根短粗(見(jiàn)圖5)，有利于移栽。生根苗采用“二步法”移栽。成活率可達(dá)92．5％[24]。1.4本研究的目的和意義本研究通過(guò)對(duì)銀條根部分化的培養(yǎng)條件、不同激素處理對(duì)提高生根率的效果進(jìn)行了比較和研究，以獲得最適的培養(yǎng)條件和最佳的激素配比。目的是獲得脫毒種株并進(jìn)性大量、快速的繁殖，以解決生產(chǎn)中銀條由于結(jié)籽率低，且難以培養(yǎng)成苗，長(zhǎng)期以根狀莖進(jìn)行無(wú)性繁殖所造成的病毒累積的問(wèn)題，并為進(jìn)一步進(jìn)行銀條的營(yíng)養(yǎng)利用、生理代謝、生物育種研究奠定基礎(chǔ)。銀條地下塊莖營(yíng)養(yǎng)十分豐富，每100g含蛋白質(zhì)5.5g，脂肪0.3g，糖類20.3g，且富含多種礦物質(zhì)、維生素及生理活性物質(zhì)，對(duì)人體有重要的營(yíng)養(yǎng)保健和美容功效；其塊莖還可人藥，有潤(rùn)肺益腎、滋陰補(bǔ)血的功效，還可用于治療氣喘、肺虛咳嗽、腎虛腰痛、淋巴結(jié)核等癥，是上好的食用保健品。此外，現(xiàn)代藥學(xué)研究表明，草食蠶含有水蘇堿、膽堿、胡盧巴堿和豐富的水蘇糖等，其中水蘇堿對(duì)KCN所引起的缺氧癥具有一定療效，可降血糖、降血脂，還對(duì)防治老年性癡呆有獨(dú)特療效。由于其集食用和藥用價(jià)值于一體。值得大力推廣種植，但草食蠶適生于半干旱半沙化地區(qū)，目前我國(guó)自然條件下種植面積較小，資源有限，而且通常以塊莖繁殖。難以對(duì)優(yōu)良種系進(jìn)行大規(guī)?？寺》敝郴蚝Y選。且易引起種系退化。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行草食蠶的快繁，具有繁殖周期短、條件可控、繁殖系數(shù)高和便于工廠化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)提高繁育速度、保持植物優(yōu)良性狀或進(jìn)行品種改良有重要意義，也是開(kāi)發(fā)其藥用價(jià)值和商品價(jià)值的有效途徑。第二章實(shí)驗(yàn)部分2.1材料與方法2.1.1材料繼代培養(yǎng)約60天，長(zhǎng)勢(shì)健壯且均勻的銀條（StachysfloridanaSchuttl.exBenth）幼苗，由河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。2.1.2儀器與試劑（1）儀器：高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、燒杯、試管、酒精燈、鑷子、剪刀、濾紙、錐形瓶、培養(yǎng)皿、移液管（5、1、0.5ml）、玻璃棒、微波爐、棉線、牛皮紙、分析天平、玻璃板、廣口瓶、解剖刀、鉛筆（2）試劑：80%乙醇溶液、大量元素(母液Ⅰ)：25ml、大量元液（母液Ⅱ）：0.5mg/L、有機(jī)溶液：0.5mg/L、EDTA：0.5mg/L、FeSO4溶液：0.5mg/L、肌醇：0.05g、蔗糖：15g、瓊脂：7g、NAA（萘乙酸1mg/mL）：5mL、6-BA（6-芐基嘌呤0.1mg/mL）：1mL、IBA、2,4-D2.1.3主要溶液及配制（1）配制1.0mol/L的NaOH溶液，用以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值至5.8-6.0。（2）按照MS基本培養(yǎng)基配方配制MS、1/2MS和1/4MS3種大量元素含量不同的培養(yǎng)基。其中，MS基本培養(yǎng)基配方見(jiàn)表2-1。（3）分別配制NAA、IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液（用NaOH溶液助溶），用以設(shè)置不同激素組合。表2-1MS基本培養(yǎng)基配方母液藥品名稱濃度（mg/L)擴(kuò)大倍數(shù)大量元素NH4NO33300020KNO338000CaCl2·2H2O8800MgSO4·7H2O7400KH2PO43400微量元素KI166400H3BO31240MnSO4·4H2O4460ZnSO4·7H2O1720Na2MoO4·2H2O50CuSO4·5H2O5CoCl2·6H2O5鐵鹽FeSO4·7H2O5560100Na2-EDTA·2H2O7460有機(jī)成分肌醇20000100煙酸100鹽酸吡哆醇(維生素B6)100鹽酸硫胺素(維生素B1)100甘氨酸4002.1.4方法將繼代產(chǎn)生的健壯且生長(zhǎng)一致的無(wú)根苗切去上部3-4cm的莖段，垂直接入不同培養(yǎng)基中，深度約1cm。（1）基本培養(yǎng)基根據(jù)銀條的生長(zhǎng)習(xí)性及繼代培養(yǎng)狀況，以MS培養(yǎng)基和1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。（2）激素的使用分別在1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基中添加0、0.2、0.5、1mg/LNAA，0、0.5、1mg/LIBA，0、0.2mg/L6-BA和30g/L活性炭。以上培養(yǎng)基均附加30g/L蔗糖、7g/L瓊脂，PH值5.6。每個(gè)處理10瓶，每瓶接3個(gè),20天之后統(tǒng)計(jì)生根結(jié)果。（3）生根激素條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)5個(gè)因素4個(gè)水平13個(gè)處理組合，篩選銀條生根的最佳條件。5因素分別為培養(yǎng)基（A）、6-BA濃度（B）、NAA濃度（C）、IBA濃度（D）、活性炭（E），4個(gè)水平分別表示為a、b、c、d，如表2-2表示：表2-2條件優(yōu)化的因素和水平Tab2-2FactosandlevesofoptimizationAB/mg.L-1C/mg.L-1D/mg.L-1E/g.L-1A1/30B1-0.51-C--1--D--2--E將不同因素的水平進(jìn)行組合，設(shè)置了13個(gè)處理，每個(gè)處理樣本量30，如表2-3所示：經(jīng)20天恒溫培養(yǎng)，記錄生根數(shù)目，確定生根的最優(yōu)條件。表2-3條件優(yōu)化的處理組合Tab.2-3TreatmentsforoptimizationABCDE1baccb2bbccb3bbccb4bbbcb5bbeab6abebb7abccb8abeab9abbcb10abbab11bbacb12bbecb13bbaca2.2結(jié)果與分析2.2.1銀條根的生長(zhǎng)銀條莖段在除菌培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)一周的恒溫培養(yǎng)，莖段基部陸續(xù)出現(xiàn)白色的組織分化，15天之后會(huì)產(chǎn)生明顯的根部分化，20天之后可清晰記錄根部生長(zhǎng)發(fā)育情況。期間培養(yǎng)基表面上部也發(fā)生相應(yīng)的變化，體現(xiàn)出激素處理對(duì)除根以外的莖葉部分的影響。分別采用不同的基本培養(yǎng)基成分、不同的激素濃度、共培養(yǎng)條件和共培養(yǎng)天數(shù)，設(shè)置了13個(gè)處理，結(jié)果如表2-4所示：表2-4不同處理的生根條件對(duì)銀條根生長(zhǎng)的影響Tab2-4Impactsofdifferenttreatmentsonrootsinduction處理Treatment生根率（%）Rootingrate平均生根數(shù)(根)Averagerootnumber平均根長(zhǎng)(mm)Theaveragerootlength根部生長(zhǎng)狀況Theconditionofrootgrowth莖葉生長(zhǎng)狀況Theconditionofstemandleaf176.748基部愈傷樣化嚴(yán)重，根纖細(xì)發(fā)黃，有玻璃化傾向293.3715較細(xì)，極少根毛較粗壯393.3614較細(xì)，極少根毛較粗壯496.7518可見(jiàn)少量分叉，根毛較明顯較粗壯596.7611較細(xì)，根毛不明顯莖部纖細(xì)，葉片有萎蔫現(xiàn)象693.3616可見(jiàn)少量分叉，根毛較明顯莖葉纖細(xì)796.7918纖細(xì)，根尖發(fā)白一般893.3616根尖褐色莖葉纖細(xì)996.7719根尖發(fā)黃，較細(xì)一般1093.3915根纖細(xì)，發(fā)白一般111001022根較粗，根尖淺黃，根毛明顯粗壯，葉片較大1296.7164較細(xì)莖部較粗，葉片小131001224較粗，白色，根毛明顯粗壯，葉片較大2.2.2討論與分析由表2-4可看出6-BA會(huì)使銀條莖段基部發(fā)生較嚴(yán)重的愈傷樣化，阻礙其根的分化，并使莖葉部分產(chǎn)生玻璃化的不良現(xiàn)象；1/2MS培養(yǎng)基可使銀條莖段生根速度加快，但根體較細(xì)，莖葉部分也并不粗壯，相比之下MS培養(yǎng)基生根速度不如1/2MS培養(yǎng)基，但根部較粗，莖葉部分較粗壯，生長(zhǎng)潛力較大；IBA和NAA在生根能力上基本相同，都有較好的生根效果，但I(xiàn)BA對(duì)莖葉部分的生長(zhǎng)作用效果明顯不如NAA，在IBA的影響下，銀條莖葉都比較纖細(xì)，而在NAA的作用下銀條莖葉較粗壯，這個(gè)效果在NAA和IBA結(jié)合使用時(shí)也很明顯，0.5mg/LNAA和0.5mg/LIBA結(jié)合使用時(shí)根尖發(fā)黑，較細(xì)，根毛不明顯，莖葉部分相比單純使用IBA時(shí)并無(wú)明顯改善；單純使用激素NAA有較好的生根效果，并且在較低濃度的NAA濃度下，根部均勻，直徑較粗，長(zhǎng)度較長(zhǎng)，根毛健康；活性炭的添加使根的生長(zhǎng)有了良好的暗環(huán)境，活性炭的吸附作用使培養(yǎng)基中雜質(zhì)成分減少，更有理由銀條根生長(zhǎng)發(fā)育。2.3結(jié)論將無(wú)根苗接種于生根培養(yǎng)基中，定期觀察，結(jié)果草食蠶較易生根，不添加任何激素時(shí)生根率可達(dá)93％，但根較細(xì)弱，不利于移栽。莖段在MS+0.2mg/LNAA+活性炭3%的培養(yǎng)基中有最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)，在較高的NAA或IBA濃度下，莖段下端愈傷樣化嚴(yán)重，不定根產(chǎn)生量少，在IBA的作用下，銀條莖葉纖弱不利于移栽成活。在MS+0.2mg/LNAA的培養(yǎng)基中，莖段生根量大，根型良好，莖葉粗壯，加入活性炭后，根的長(zhǎng)度進(jìn)一步增長(zhǎng)，呈乳白色，將生根的完整植株移栽到消過(guò)毒的1蛙石:1珍珠巖的基質(zhì)上，成活率高達(dá)95.8%。參考文獻(xiàn)[1]喬琦,苗艷芳,郭大勇等.洛陽(yáng)地區(qū)特色物藥的GAP實(shí)踐和發(fā)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2007,142(7):1634-1635.[2]喬琦,張亞冰,肖婭萍.洛陽(yáng)市特色植物地靈的經(jīng)營(yíng)發(fā)展和科研方向[J].中國(guó)種業(yè),2006,140:16-17.[3]劉孟剛姚連芳劉會(huì)超等.鎘脅迫對(duì)銀條內(nèi)鎘殘留及其品質(zhì)的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2010,19(4):809-812.[4]李順興,吳敬章;銀條菜的栽培與加工[J];農(nóng)業(yè)科技通訊;1985年02期[5]崔瑾徐志剛邸秀茹等.LED在植物設(shè)施栽培中的應(yīng)用和前景[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(8):249-253.[6]李昌華，李小川，趙美華，趙軍良，羅春香;養(yǎng)研大蒜莖尖脫毒培技術(shù)及組織究[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);1995年03期[7]張國(guó)裕;銀條（StachysFloridanaSchuttl.exBenth.）脫毒及快速繁殖體系的建立[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2003年[8]郭東偉馬有志周一龍等.銀條根莖離體誘導(dǎo)[J].園藝學(xué)報(bào),2006,33(4):873-875.[9]徐睿;偃師銀條發(fā)展前景及生產(chǎn)建議[J];中國(guó)林副特產(chǎn);2008年04期[10]劉曉濱;鐘少薇;張建軍;陳昕;脫毒過(guò)程中美沙酮急性中毒及原因分析[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第三屆全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文（摘要）集[C];2001年[11]覃蘭英,李青,鄧世秀,黃宇,李明福,張成良,李桂芬,賀森林,牛長(zhǎng)占;核果類病毒識(shí)別鑒定及脫毒技術(shù)[J];北京農(nóng)業(yè)科學(xué);1997年05期[12]崔瑾徐志剛邸秀茹等.LED在植物設(shè)施栽培中的應(yīng)用和前景[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(8):249-253.[13]張國(guó)裕程智慧李娟周文安王新華.銀條莖尖培養(yǎng)快繁及離體根狀莖的誘導(dǎo)[J].園藝學(xué)報(bào),2004,31(1):106-108.[14]等.銀條根莖離體誘導(dǎo)[J].園藝學(xué)報(bào),2006,33(4):873-875.[15]宋尚偉苗紅霞胡青霞王娟.銀條莖尖玻璃化法超低溫保存及其植株再生[J]園藝學(xué)報(bào),2009,36(12):1810-1815.[16]VamaharaJ，KitaniT，KobayashiH，eta1．StudiesonStachyssieboldiiMiq．II．Anti-anoxiaactionandtheactiveconstituents[J]．JournalofthePhar—maceuticalSocietyofJapan，1990，110(12)：932—935．[17]Hayashik，NagmatsutItoM，eta1．Aeteoside：acomponentofstachyssieboldiiMiq．，maybeapromisingantinephriticagent(3)：effectofacteosideonexpressionofintercellularadhesionmolecule·1inexperimentalnephriticglomeruliinratsandculturedendothelialcells[J]．PhJPhannacol，1996，70(2)：157-168．[18]StasollaC，YeungECAscorbicacidmetabolismduringwhitespruce~maticembryomaturationandgermination[J]．Physio1．Plant，2001，iii：196-205．[19]AwadMA，JagerA.Flavonoidandchlorogenieacidconcentrationsinskinof‘Jonagold’and‘Elstar’applesduringandafterregularandultralowoxygenstorage[J]．PostharvestBiologyandTechnology，2000，20：15—24[20]KondoS，TsudaK，MutoN，eta1．Antioxidativeactivityofappleskinorfleshextractsasscoiatedwithfruitdevelopmentonselectedapplecultivars．ScientiaHorticu1turae，2OO2，96：177—185．[21]LeeJH，MaYZ，WakoT，LiLC，KimKY，ParkSW，UchiyamaS，F(xiàn)ukaiK．FlowkaryotypesandchromosomalDNAcontentsofgenus,Triticumspeciesandrye(Secalecereale)．ChromsomeResearch，2004，12：93～102[22]WeiT，LatoyaCH，VilayO，RonaldJN．TheeffectofdiferentplantgrowthregulatorsonadventitiousshootformationfromVirginiapinezygotic,embryoexplants．PlantCell，TissueandOrganCulture，2004，78：237～240[23]DanielleJD。WarrenKC，ShirlynEC．Potatomicmtuberproductionandperformance：areview．AmericanJournalofPotatoResearch，2003，80：103～115[24]XuX，vanLammerenAAM，VermeerE，eta1．TheroleofgibbereLlin，abscisicacid，andsucroseintheregulationofpotatotuberformationinvitro．PlantPhysiol，1998，117：575～584[25]MooreBM，F(xiàn)lurkeyWH．Tyrosinaseactivitiesandisoenzymesinthreestrainsofmushrooms[J]．JFoodporcpres，1997，21：485-494．[26]陳杰飛,徐雪梅王平等．北五味子育苗技術(shù)[J]．林業(yè)科技，2002，27(4)：69．[27]陳建軍，王東升，李亞?wèn)|等．北五昧子豐產(chǎn)栽培經(jīng)驗(yàn)[J]．中藥材，1996，19(9)：437—438．[28]鐘先鋒.黃桂東.易軍鵬.朱文學(xué)銀條的開(kāi)發(fā)利用[J]-中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)2006(8).[29]崔瑾,徐志剛,邸秀茹等.LED在植物設(shè)施栽培中的應(yīng)用和前景[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(8):249-253.[30]李欣,易軍鵬,蘆雷鳴.銀條的殼聚糖復(fù)合涂膜保鮮效果研究[J];河南化工;2005年06期.致謝幾個(gè)月的努力，在學(xué)校和農(nóng)學(xué)院的大力支持下以及喬琦老師的精心指導(dǎo)下終于完成了本實(shí)驗(yàn)和論文的撰寫。喬老師淵博的專業(yè)知識(shí),對(duì)工作認(rèn)真負(fù)責(zé)，從試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施到論文的撰寫和修改整個(gè)過(guò)程都凝聚了她無(wú)數(shù)的心血和汗水。喬老師不但為人親和，試驗(yàn)期間喬老師都給予我無(wú)私的幫助和極大地關(guān)懷，我不僅學(xué)到了更多的專業(yè)知識(shí)，掌握了更多的專業(yè)技能，更從喬老師身上學(xué)到了許多寶貴的品格和為人處世的態(tài)度，這將使我受益終身。在此，謹(jǐn)向喬老師表示衷心的感謝和崇高的敬意。同時(shí)，再次向大學(xué)期間給予我教導(dǎo)和幫助的農(nóng)學(xué)院各位老師給予我?guī)椭完P(guān)心支持我的每位同學(xué)致以我深深的謝意和衷心的祝福！毛瑞祥 2014年5月附錄圖1.1/2MS+0.5mg/LIBA 圖2.MS+0.5mg/LIBA圖3.MS+1.0mg/LNAA 圖4.MS+0.2mg/LNAA英語(yǔ)文獻(xiàn)一種用紫外線直接照射毛細(xì)管電泳定量測(cè)定兩種糖醛酸的新方法Yong-gangXia,JunLiang,Bing-youYang,Qiu-hongWangandHai-xueKuang*摘要：利用16分鐘之內(nèi)的堿性背景電解質(zhì)的逆轉(zhuǎn)電滲流（EOF），開(kāi)發(fā)出了一種用毛細(xì)管區(qū)帶電泳快速測(cè)定兩種糖醛酸，半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的新方法。該方法依賴于毛細(xì)管反應(yīng)和波長(zhǎng)270nm的紫外線檢測(cè)。最佳電解質(zhì)溶液配比為130mM氫氧化鈉，磷酸氫二鈉36mM和0.5mM十六烷基三甲基溴化銨。電滲流逆轉(zhuǎn)可以檢測(cè)糖醛酸并且提高中性糖的分離效率。所建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，線性度好，精度高且具有可觀的靈敏度。新開(kāi)發(fā)的方法已成功地應(yīng)用于分析包含于連翹多糖中的半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。該方法快速因?yàn)闃悠分苽溥^(guò)程中只需要水解和稀釋兩步。?版權(quán)2010約翰威利父子公司關(guān)鍵詞：毛細(xì)管區(qū)帶電泳；直接紫外檢測(cè)；糖醛酸；半乳糖醛酸；葡糖醛酸前言：半乳糖醛酸組成的糖醛酸為果膠質(zhì)的主要成分的，果膠質(zhì)包括所有植物的初期細(xì)胞壁中的一系列混合多糖，并且是存在于自然界中的最為復(fù)雜的大分子。（約翰等人，2006；趙等人，2006；斯拉沃夫等人，2009；清原等人，2010；朗德等人，2010）。細(xì)胞壁中也檢測(cè)到了少量的葡萄糖醛酸（杜安等人，2010；清原等人，2010）。有報(bào)道說(shuō)，從植物的果膠提取的多糖有很多藥理活性比如免疫活性抑制，免疫調(diào)節(jié)，抗炎活性和抗?jié)儯ㄉ教锏热耍?991；Schepetkin和奎因，2006；Inngjerdingen等人，2007；Ovodova等人，2009；段等人，2010）。除了果膠，，越來(lái)越多的具有生物活性的酸性多糖從草本植物中分離出來(lái)。比如說(shuō)，從桑黃，腸滸苔，人參提取出的酸性多糖顯示出了抗癌活性（Shin等人，2004；焦等人，2009）。酸漿多糖，由阿糖胞苷，半乳糖，葡萄糖和半乳糖醛酸組成，可顯著降低由四氧嘧啶催生的糖尿病小鼠的血糖水平和水的攝入量，并增加身體重量（佟等人，2008）。從白籽南瓜中提取的酸性多糖顯示出顯著細(xì)胞保護(hù)作用和對(duì)過(guò)氧化氫損傷體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的抗氧化作用（楊等人，2007）。研究表明，酸性多糖具有較高的生理活性，這是與糖醛酸的水平密切相關(guān)，特別是對(duì)于多糖天然植物（楊等人，2009；余等人，2009）。由于這些原因，開(kāi)發(fā)一種新的方法來(lái)測(cè)定酸性植物多糖的糖醛酸含量意義重大，以期更好的發(fā)現(xiàn)它們的功能特性，可以在制藥和食品工業(yè)更好地應(yīng)用。（包等人，2001；黃等人，2007）。糖醛酸定量測(cè)量通常是這樣做，在第一次硫酸水解多糖后采用比色法測(cè)定（艾哈邁德等人，1977；Selvendran等人，1979）。然而，舊方法有一個(gè)主要問(wèn)題，中性糖和其降解產(chǎn)物的酸水解可以干涉比色法測(cè)定糖醛酸（Filisetti科齊和卡比塔，1991）。氣相色譜（GC）是一個(gè)經(jīng)典的方法分析多糖的單糖組成。中性單糖可以被甲硅烷基化或乙?；镅苌?，而如酸性單糖葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸都不能（郭等人，2006；陳等人，2009）。糖醛酸含量可以通過(guò)反應(yīng)前后的多糖的羧基還原的差異量來(lái)獲得（佩里等人，2007）。因此氣相色譜法測(cè)定糖醛酸非常費(fèi)力的計(jì)算。在同時(shí)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮或1-（2-萘基）-碳水化合物3-甲基-吡唑啉酮衍生物已用高效液相色譜法（HPLC）和高效毛細(xì)管電泳（CE）間接紫外檢測(cè)從糖醛酸成功分離（本田等人，1989和2003；稻田和羅杰，1995；張等人，2003；佑等人，2008；LV等人，2009）。雖然衍生的碳水化合物會(huì)提高靈敏度和分辨率，但衍生的復(fù)雜性有缺點(diǎn)，如在定量恢復(fù)問(wèn)題方面。紫外探測(cè)器，這是HPCE的中心，已只是偶爾使用的非衍生的碳水化合物含量。這種方法的主要缺點(diǎn)是有限的靈敏度具有大分子碳水化合物的固有的低的摩爾吸光系數(shù)的。最近，直接紫外檢測(cè)中性碳水化合物的毛細(xì)管電泳非衍生化法通常被通過(guò)在毛細(xì)管反應(yīng)和直接紫外檢測(cè)波長(zhǎng)270nm（Rovioet等人，2007，2008）。該方法是基于陰離子碳水化合物五碳烯二醇化物形成通過(guò)對(duì)電解液的堿性的伴隨動(dòng)作溶液和所施加的電場(chǎng)。空氣干燥的連翹果實(shí)在中國(guó)藥典已經(jīng)是一種重要的傳統(tǒng)中藥。連翹是國(guó)內(nèi)為數(shù)不多已被醫(yī)學(xué)專家證實(shí)具有抗炎、抗菌、抗病毒作用的的草藥的一種（匡等人，2009）。一個(gè)系列的木脂素類化合物，苯乙醇苷和黃酮類化合物有很長(zhǎng)一段時(shí)間被認(rèn)為是藥理學(xué)F.葉用于治療各種活性成分疾病和癥狀（樸等人，2008；夏等人，2009），但他們不能解釋所有的上述作用該多糖可能是一個(gè)主要的生物活性成分。這項(xiàng)工作的目的是開(kāi)發(fā)一個(gè)簡(jiǎn)單的和快速的毛細(xì)管區(qū)帶電泳用于基于一個(gè)反轉(zhuǎn)EOF未衍生堿性背景電解質(zhì)利用半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的量化方法。新開(kāi)發(fā)的方法已成功地應(yīng)用于分析半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的連翹多糖。這是第一個(gè)報(bào)告在五碳烯二醇化物陰離子的形成利用植物多糖的糖醛酸含量測(cè)定。該方法也可用于量化在其他植物多糖的糖醛酸。實(shí)驗(yàn)材料與試劑D-（+）-葡萄糖醛酸，D-（+）-半乳糖醛酸，D-（+）-木糖，L-（-）-阿拉伯糖，D-（+）-葡萄糖，D-（+）-半乳糖和氫氧化鈉由西格瑪提供（St路易斯，衛(wèi)生官員，美國(guó)）。三氟乙酸（TFA）和磷酸氫二鈉（磷酸氫二鈉·2H2O）獲得于默克公司（達(dá)姆施塔特，德國(guó)）。從Milli-Q水凈化系統(tǒng)得到水（米利波爾，貝德福德，MA，USA）。電解液的PH值是用帶有薩特雷斯PH/ATC電極SartoriusPB-20pH測(cè)量?jī)x（薩特雷斯，德國(guó)）在pH7的緩沖區(qū)的10和12的商業(yè)校準(zhǔn)，（titrisol，默克公司，德國(guó)）。所有的其他化學(xué)品的最高級(jí)別的。表1給出了分子式和權(quán)重，解離常數(shù)和化學(xué)單糖的結(jié)構(gòu)表1.分子式，摩爾質(zhì)量，pkavalues和化學(xué)結(jié)構(gòu)的單糖的研究連翹果實(shí)在2008三月收集于中國(guó)河南，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振越教授鑒定，憑證標(biāo)本（2008009）被存放在中國(guó)哈爾濱黑龍江大學(xué)中醫(yī)標(biāo)本館。連翹多糖的提取連翹果實(shí)藥材粉（200克）。萃取三次用2000毫升蒸餾水在100°C2小時(shí)的濾液得到的提取物濃縮為真空糖漿（ca300毫升）和用五倍體積的95%乙醇沉淀（約1500毫升）。粗多糖部分沉淀從酒精白酒類，在隨后的站在4°C過(guò)夜。沉淀收集離心后再?zèng)_分別依次較小少量的乙醇，丙酮，乙醚。拖布思描述沉淀溶解在600毫升的水和脫蛋白的五倍，與200毫升5:1三氯甲烷-n-丁醇（1965）。由此產(chǎn)生的水溶性組分進(jìn)行了廣泛的透析（cut-offMw3500Da）對(duì)自來(lái)水48h和蒸餾水48小時(shí)，再通過(guò)沉淀增加5倍量的乙醇。離心后，沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌，然后溶解在水中凍干得粗多糖（1.5克），這是收集通過(guò)離心（3000轉(zhuǎn)，10分鐘，20°C）連翹多糖的水解藥材20毫克的樣品的多糖樣品溶解在2毫升的200萬(wàn)TFA在安瓿（5毫升）。安瓿被密封在一個(gè)氮?dú)夥眨旁诜兴≈械亩嗵浅煞炙獬蓡翁潜焕鋮s到10h后室溫下，反應(yīng)混合物以1000rpm離心5分鐘后，取上清液減壓下干燥。水解和干燥的樣品溶液中加入1毫升蒸餾水，然后準(zhǔn)備接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備個(gè)人標(biāo)準(zhǔn)單糖（1毫摩爾每升）和混合單糖的解決方案（1毫摩爾每升）和去離子水的制備。通過(guò)適當(dāng)?shù)慕M合的單糖的樣品溶液稀釋去離子進(jìn)一步工作標(biāo)準(zhǔn)溶液水。在信噪比=3測(cè)定的檢測(cè)限所有被分析物。樣品溶液通過(guò)0.22lmsyringe過(guò)濾和脫氣使用超聲波浴2分鐘前使用。所有制備的溶液被存儲(chǔ)在黑暗中在4°C直到使用之前。CZE步驟在P/ACEMDQ毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行了單糖的分析（貝克曼科爾特，富勒頓，美國(guó)認(rèn)證中心）。一個(gè)集成的P/ACE的32克拉的站（軟件版本4）被用來(lái)完成數(shù)據(jù)采集和控制的操作變量系統(tǒng)。分離是在未改性的石英進(jìn)行了毛細(xì)管（48.5厘米×50m微米，有效長(zhǎng)度40厘米）。兩個(gè)毛細(xì)管樣品恒溫15°C.樣品注射4秒分離電壓線性升高0.5psi的壓力在2分鐘內(nèi)從0到12伏。檢測(cè)了在270nm波長(zhǎng)處用二極管陣列檢測(cè)器直接紫外檢測(cè)從永年光學(xué)纖維廠毛細(xì)管（河北省，中國(guó)）是與每0.1M磷酸酸洗連續(xù)活性（15分鐘），水（10分鐘），0.1M氫氧化鈉（15分鐘）和水（10分鐘）。在每個(gè)工作日的開(kāi)始，毛細(xì)管對(duì)于與0.1M磷酸（2分鐘），水（2分鐘），0.1MNaOH2分鐘，水（2分鐘）和運(yùn)行緩沖液（2分鐘）。載體電解質(zhì)溶液的制備通過(guò)混合36mM磷酸氫二鈉130mM氫氧化鈉與0.5毫米脫水制備的電解質(zhì)溶液十六烷基三甲基溴化銨。電解質(zhì)溶液的過(guò)濾通過(guò)0.22微型注射過(guò)濾和脫氣使用超聲波5分鐘前，用浴。所有的電解質(zhì)溶液的制備存儲(chǔ)在黑暗中在4°C直到使用結(jié)果與討論毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離條件的優(yōu)化最近，高堿性電解質(zhì)溶液如鋰，在pH值大于12是氫氧化鈉或氫氧化鉀示出在非糖類的分離是有用的毛細(xì)管區(qū)帶電泳（Colón等人，1993）。在高堿性pH的糖類可電離由于羥基產(chǎn)生負(fù)帶電物種稱為醇化物（倫德?tīng)柭?971）。pKa一些典型的糖值列于表1（倫德?tīng)柭?971我和索爾，2000）。表1中的一個(gè)重要特點(diǎn)是這糖醛酸有更大的酸度比醛糖。鈰離子物種是根據(jù)它們的電荷和大小分離；因此電解液的pH值可以在優(yōu)化分辨率的重要因素，它影響分析物的電荷。由于pKa評(píng)估的中性單糖很高（表1），強(qiáng)堿性的條件必須確保使用電離（卡瓦略等，2003；李和陳，2004）。在高堿性溶液分析通常，在氫氧化鈉的濃度為10–100mM（O'shea等人，1993；EL拉斯，1999）研究表明，中性單糖可以通過(guò)在波長(zhǎng)270nm紫外光直接檢測(cè)鑒定，依賴對(duì)毛細(xì)管反應(yīng)在強(qiáng)堿性溶液（拉維奧等，2007，2008）。采用的反應(yīng)在文獻(xiàn)中詳細(xì)表述。如在堿性水溶液溶液中性碳水化合物，參與反應(yīng)的級(jí)聯(lián)電離，變旋，烯醇化和異構(gòu)化反應(yīng)，導(dǎo)致在UV吸收負(fù)離子的形成。的建議紫外吸收陰離子是碳水化合物五碳烯二醇化物，這是一個(gè)反應(yīng)中間體的碳水化合物的氧化。此外，我們的實(shí)驗(yàn)（圖1A）證實(shí)，只有中性單糖可以在強(qiáng)堿性溶液中觀察到，包括130mM氫氧化鈉和36mM磷酸鈉帶有直到60分鐘（數(shù)據(jù)未顯示），這是協(xié)議與以前的研究，（拉維奧等，2007）基地有一個(gè)可能的解釋，是很容易電離的糖醛酸更多的負(fù)電荷，電泳速度可大于電滲流（EOF）引起的糖醛酸酸是無(wú)法通過(guò)探測(cè)器到達(dá)陰極。因此，糖醛酸不能定性和定量分析，在這種情況下（圖1A）。我們認(rèn)為，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸應(yīng)該發(fā)生在半縮醛的網(wǎng)站相同的反應(yīng)為中性單糖在高堿性解決方案，包括電離，變旋，烯醇化和異構(gòu)化。為形成初步的反應(yīng)機(jī)理圖2給出了。EOF的方向也對(duì)糖醛酸的測(cè)定效果顯著（索加和索爾，2000）。因此，它是要添加陽(yáng)離子表面活性劑的堿性電解質(zhì)溶液中，這個(gè)實(shí)驗(yàn)修改毛細(xì)血管壁。十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）通常被用來(lái)作為陽(yáng)離子表面活性劑可用于高效毛細(xì)管電泳的反轉(zhuǎn)EOF（管等，1996）。圖1。碳水化合物的測(cè)定比較通過(guò)（A）+12kV正常的EOF分析和（B）-12KV逆轉(zhuǎn)的EOF。峰值代表：1，葡萄糖醛酸；2，半乳糖醛酸；3，木糖；4，果膠糖；5，葡萄糖；6，半乳糖。分離條件：檢測(cè)，270nm直接模式；注射壓力，0.5磅4s；石英毛細(xì)管，40/48.5厘米（ldet/LTOT）；分離溫度，15°C；電解質(zhì)溶液，(A)130mMNaOH+36mMNa2HPO4·12H2O(217.3mA,pH12.30),(B)130mMNaOH+36mMNa2HPO4·12H2O+0.5mMCTAB(217.5mA,pH12.28)糖醛酸可以容易被檢測(cè)檢測(cè)和紫外吸收峰值D-（+）-半乳糖醛酸或者D-（+）-在葡糖醛酸270nm的具有約10摩爾吸光系數(shù)（圖3），具有相同的吸收波長(zhǎng)和吸收強(qiáng)度中性碳水化合物（拉維奧等人，2007）。雖然所有的單糖的遷移順序是顛倒的逆轉(zhuǎn)的EOF的條件下，峰的形狀進(jìn)行了改進(jìn)，很好獲得的每一個(gè)部分的分辨率（圖1b）。此外，中性和酸性單糖可以在這種條件下同時(shí)測(cè)定。不同濃度的CTAB（0.