【2】蛋白質(zhì)的電泳分離(分子醫(yī)學(xué)實驗)

《分子生物學(xué)實驗》實驗報告實驗名稱：蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜技術(shù)姓名：陳杰學(xué)號：3140104666組別：同組同學(xué)：唐陳曦帶教教師：劉偉俞萍實驗日期：2015年9月22日目錄1.原理： 31.1聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì) 31.2SDS測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量 31.3轉(zhuǎn)膜技術(shù) 42.操作步驟 42.1SDS測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量 42.1.1安裝垂直板型電泳裝置 42.1.2凝膠的制備 52.1.3蛋白質(zhì)樣品的處理 62.1.4加樣 62.1.5電泳 62.1.6剝膠與染色 62.1.7脫色 62.2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜技術(shù) 63、實驗結(jié)果 73.1原始照片記錄 73.2數(shù)據(jù)處理 84.討論： 91.原理：1.1聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳，具有機械強度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡單、樣品用量小、分辨率高等優(yōu)點，并可通過控制單體濃度或與交聯(lián)劑的比例聚合成不同孔徑大小的凝膠。可用于蛋白質(zhì)、核酸等分子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析；還可結(jié)合解離劑十二烷基硫酸鈉以測定蛋白質(zhì)亞基的相對分子質(zhì)量。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺與交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺在催化劑的作用下，經(jīng)過聚合交聯(lián)形成含有親水性的酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過亞甲基橋交聯(lián)起來的三位網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有兩種：化學(xué)聚合和光聚合?；瘜W(xué)聚合通過采用過硫酸銨為催化劑，四甲基乙二胺為加速劑。在TEMED催化下，過硫酸胺形成自由基SO4·，后者可使丙烯酰胺單體的雙鍵打開、活化形成自由基丙烯酰胺，從而引發(fā)聚合反應(yīng)。而光反應(yīng)形成的凝膠孔徑較大，而且隨時間延長而逐漸變小，不太穩(wěn)定。所以一般采用化學(xué)聚合。凝膠的濃度決定了凝膠孔徑的大小，交聯(lián)劑的濃度對電泳泳動率也有影響。選擇緩沖劑時主要從pH范圍、離子種類和離子強度來考慮。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠有三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。（1）濃縮效應(yīng)：由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷量不同、相對分子質(zhì)量不同，泳動的速率也不同，于是各種不同的蛋白質(zhì)離子在高電壓區(qū)中分別被壓縮成狹窄的區(qū)帶。這種濃縮效應(yīng)可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。（2）分子篩效應(yīng)：由于分離膠的凝膠孔徑較小，各種蛋白質(zhì)根據(jù)其表面電荷多少、相對分子質(zhì)量大小和分子構(gòu)象的不同，在分離膠中所受的阻力不同而進行分離，表現(xiàn)為分子篩效應(yīng)。（3）電荷效應(yīng)：在整個電泳體系中，電荷效應(yīng)始終是促進蛋白質(zhì)樣品移動的主要因素，電荷效應(yīng)在濃縮膠和分離膠中都存在。1.2SDS測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量在聚丙烯酰胺凝膠中加入十二烷基磺酸鈉（SDS）后，與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)帶有一致的負電荷，電泳時其遷移速率主要取決于它的Mr（相對分子質(zhì)量），而與所帶電荷和形狀無關(guān)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的Mr在15000~20000之間時，蛋白質(zhì)的Mr與電泳遷移率間的關(guān)系可用下式表示：lgMr=K-bm，式中，Mr為蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量；m為遷移率；b為斜率；K為截距。在一定條件下，b和K均為常數(shù)。將已知相對分子質(zhì)量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對Mr的對數(shù)作圖，可得一條標準曲線。將未知的蛋白質(zhì)樣品，在相同的條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率可在標準曲線上差得它的相對分子質(zhì)量。SDS是一種陰離子型去污劑，在蛋白質(zhì)溶解液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的非共價鍵（氫鍵、疏水鍵）打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)上，形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。由于SDS帶有大量負電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷的量大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。長軸與蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的大小成正比。這樣的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率只與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的函數(shù)有關(guān)。SDS緩沖系統(tǒng)有連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。不連續(xù)系統(tǒng)有較好的濃縮效應(yīng)。1.3轉(zhuǎn)膜技術(shù)將經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的蛋白質(zhì)的相對位置不變。2.操作步驟2.1SDS測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量2.1.1安裝垂直板型電泳裝置1.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干2.把玻璃板在灌膠支架上固定好。固定玻璃板時，兩邊用力一定要均勻，防止夾壞玻璃板。2.1.2凝膠的制備1.分離膠的制備：在一個干凈的小燒杯中，按下表所列的試劑用量配置。根據(jù)室溫來調(diào)節(jié)TEMED的加入量。12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠配制用量表30%stockacrylamide（凝膠貯液）4.0mL3mol/LTris-HCl緩沖液，pH8.8（分離膠緩沖液）1.25mL10%SDS0.1mLddH2O4.0mL10%Ammoniumpersulfate0.07mL2%TEMED0.6mL將所配置的凝膠液沿著凝膠的長玻璃片的內(nèi)面用1000uL取液槍加至長、短玻璃片的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品槽模板下緣約1cm。沿玻璃片內(nèi)壁加一層異丙醇（用于隔絕空氣，使膠面平整）。凝膠配置過程要迅速，加速劑TEMED要在注膠前再加入，否則會提前凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。2.濃縮膠的制備：在另一干凈的小燒杯中，按表配置濃縮膠，應(yīng)根據(jù)室溫來調(diào)節(jié)TEMED的加入量。混勻后用細長頭的滴管或1000uL取液槍將凝膠溶液加到已聚合的分離膠上方，直至加滿，輕輕將“梳子”插入濃縮膠內(nèi)（插入“梳子”的目的是使膠液聚合后，在凝膠頂部形成數(shù)個相互隔開的凹槽）。約30min后凝膠聚合，再放置30min。小心拔去“梳子”，用窄條濾紙吸去樣品凹槽內(nèi)多余的水分。4.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠配制用量表30%stockacrylamide（凝膠貯液）0.75mL3mol/LTris-HCl緩沖液，pH8.8（分離膠緩沖液）0.83mL10%SDS0.1mLddH2O3.0mL10%Ammoniumpersulfate0.05mL2%TEMED0.3mL2.1.3蛋白質(zhì)樣品的處理取小數(shù)肝臟蛋提取白質(zhì)樣品80uL至一eppendorf管中，加入上樣緩沖液20uL，在100℃沸水浴中保溫5-10min，取出冷至室溫。2.1.4加樣將電極緩沖液倒入上下貯槽中，應(yīng)沒過短玻璃片。在同一塊凝膠上分別按下表加入蛋白質(zhì)樣本和混合標準蛋白質(zhì)樣本。由于樣品溶解液中含有比重較大的甘油，古樣品溶液會自動沉降到凝膠表面形成樣品層。第一塊膠樣品1樣品1蛋白質(zhì)marker樣品2樣品210uL15uL15uL15uL10uL第二塊膠牛血清樣品1蛋白質(zhì)marker樣品2牛血清15uL15uL15uL15uL15uL2.1.5電泳將上槽接負極，下槽接正極，打開電源，開始時將電流控制在60V，待樣品進入分離膠后，改為100-120V，待藍色染料遷移至下端約1-1.5cm時，停止電泳，約需1-2h。2.1.6剝膠與染色將一個電泳槽中的兩塊凝膠板取出，其中有牛血清對照的一塊板用于染色，將凝膠切至合適的大小，放入一大培養(yǎng)皿內(nèi)，加入染色液，染色45min。另一塊凝膠板中的凝膠用于轉(zhuǎn)膜。2.1.7脫色染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。20-30min換一次脫色液，均勻晃動，2-3次后脫色過夜，直至背景清晰。2.2蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜技術(shù)帶上手套，在去離子水中切割電泳好的凝膠至合適的大小，轉(zhuǎn)移到3張轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕的濾紙上，蓋上一張經(jīng)甲醇激活15s-30s的PVDF膜，排除氣泡后，蓋上另3張同樣處理的濾紙，排除氣泡。按照順序：負極-海綿-3層濾紙-凝膠-膜-3層濾紙-海綿-正極。用塑料夾夾緊后放入轉(zhuǎn)移電泳裝置，將電泳槽擱置冰上。90V恒壓1h。取下膜用濾紙兩面夾好后上交。3、實驗結(jié)果3.1原始照片記錄3.2數(shù)據(jù)處理電泳中蛋白質(zhì)的相對分子量與相對遷移率的關(guān)系組別1.02.03.04.05.06.07.08.09.010.0相對分子量（kd)170.0130.0100.070.055.040.035.025.015.010.0遷移距離39.060.0100.0136.0178.0231.0281.0338.0469.0564.0相對遷移率0.10.10.20.20.30.40.50.60.81.0相對分子質(zhì)量對數(shù)2.22.12.01.81.71.61.51.41.21.0由圖表可知，函數(shù)為y=-1.27x+2.21,代入牛血清蛋白的遷移率0.25得，y==-1.27*0.26+2.21=1.87，即相對分子量為M=10^1.87=74.16kd。4.討論：這次實驗里利用SDS測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和轉(zhuǎn)膜操作是實驗室中最常見和最基礎(chǔ)的兩種操作。就這次最終得到的膠而言，底端邊緣較模糊；肉眼觀察無法確定染色帶中心位置，所以導(dǎo)致長度測量存在一定誤差，使最終得到的74.16與準確值66.43存在較大誤差。所以制備膠時要把握好時機，尤其在加入過硫酸胺和TEMED后，迅速搖勻并注膠，防止膠凝結(jié)。實驗過程中有幾處地方需要嚴格密封，否則將影響大大實驗結(jié)果。制膠時長短玻璃底部要保持對齊，且與膠條緊密接觸。同時膠板制作完成后，需要用加樣針把不同的樣品加入濃縮膠的凹槽內(nèi)。由于操作不熟練，有一部分的蛋白質(zhì)樣品逸出凹槽或飄到的隔壁的凹槽內(nèi)。樣品的混合可能給測定帶來了一定的誤差。為解決此問題，今后的實驗中如情況允許，可以間隔加樣，這樣在很大程度上可以避免相鄰格子樣品在加樣時的污染和電泳時的干擾。在電泳時，樣品經(jīng)過濃縮膠將要進入分離膠時，觀察到所有樣品在濃縮膠的底部連成一條藍色的線，這時可能會產(chǎn)生混合污染。同時，由于距離比較近，在電泳時兩條條帶的邊緣部分會相互影響。最后牛血清蛋白染色帶很模糊且顏色較淡，可能是注樣時操縱不標準導(dǎo)致。注樣時要注意將移液槍槍頭插入分離槽底部，緩慢地注液，防止反沖使樣品沖散，而且往往無法完全注完全部樣品，會有少量遺留在管尖。而最后的測量是在照片上測量，