砧用南瓜種質資源形態(tài)學性狀與SSR標記分析

園藝學報2014，41（7）：1379–1390ActaHorticulturaeSinicaE-mail:yuanyixuebao@126.com收稿日期：2014–02–26；修回日期：2014–06–13基金項目：國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金項目（CARS-25-C-03）；江蘇省農業(yè)三新工程項目（SXGC[2012]391）*通信作者Authorforcorrespondence（E-mail：jinsun@）砧用南瓜種質資源形態(tài)學性狀與SSR標記分析李鶴1，郭世榮1,2，束勝1，徐揚1，孫錦1,2,*（1南京農業(yè)大學園藝學院，農業(yè)部南方蔬菜遺傳改良重點開放實驗室，江蘇省現代設施農業(yè)技術與裝備工程實驗室，南京210095；2南京農業(yè)大學（宿遷）設施園藝研究院，江蘇宿遷223800）摘要：搜集了設施黃瓜嫁接栽培中常用的47份砧用南瓜種質資源，利用63個形態(tài)標記和40對南瓜SSR標記，對其進行遺傳多樣性及親緣關系鑒定。結果表明，砧用南瓜的8個質量性狀（嫩瓜皮色、瓜形、主蔓色、瓜面斑紋、葉面白斑、葉形、嫩瓜斑紋和嫩瓜斑紋色）和23個數量性狀的多樣性指數大于1.00；SSR標記共檢測到167個等位變異，平均每個SSR位點的等位基因數為4.18個，變幅2~8個，平均多樣性指數為0.62，變化范圍0.16~1.18。非加權算術平均法（UPGMA）聚類分析表明，砧用南瓜63個形態(tài)學性狀將47份種質劃分為4個類群，大部分品種集中于一個類群中；40對多態(tài)性SSR標記將所有種質劃分為3個類群，大部分品種的分子標記與形態(tài)學標記的聚類結果相似。已搜集的47份砧用南瓜種質資源遺傳多樣性并不豐富，親緣關系較近；SSR標記CMTm11具有極高的多態(tài)性，可用于砧用南瓜種質分子標記輔助選擇；嫩瓜皮色等8個質量性狀和大部分數量性狀都可以作為形態(tài)標記輔助種質資源評價及新品種選育。關鍵詞：南瓜；砧木；形態(tài)學；SSR中圖分類號：S642.1文獻標志碼：A文章編號：0513-353X（2014）07-1379-12GermplasmResourcesAnalysisofRootstock-usedPumpkinsbyPhenotypeandSSRLIHe1，GUOShi-rong1,2，SHUSheng1，XUYang1，andSUNJin1,2,*（1CollegeofHorticulture，NanjingAgriculturalUniversity，KeyLaboratoryofSouthernVegetablesGeneticImprovementofMinistryofAgriculture，Nanjing210095，China；2FacilityHorticultureInstitute，NanjingAgriculturalUniversity，Suqian，Jiangsu223800，China）Abstract：Forty-sevenaccessionsofrootstock-usedpumpkinwerecollectedinthisresearch.Analysesofgeneticdiversityandrelationshipsweredonewith63phenotypesand40SSRmarkers.ItwasobservedthatH’>1.00witheightqualitativecharacters（tendergourdskincolor，fruitshape，mainvinecolor，skinspeckle，foliagewhitespotting，leafshape，tendergourdspeckleandcolor）and23quantitativecharacters.Onehundredandsixty-sevenpolymorphicbandsweregenerated.Anaverageof4.18polymorphicbandsweredetectedfromonepairSSRprimers，andtheyrangedfrom2to8.H’rangedfrom0.16to1.18，anditsaveragewas0.62.Forty-sevengermplasmsweredividedintofourgroupsby63morphologicaltraits，andmostofthegermplasmswereclusteredintoonegroup.Threegroupsweredividedby40higherpolymorphicSSRprimers，similartotheresultofourpreviousmorphologicalstudy.1380園藝學報41卷Thegeneticdiversityofcollectedrootstock-usedpumpkingermplasmswaslow，andthegeneticrelationshipwasclose.SSRmarkerCMTm11，withahighpolymorphism，couldbeusedinmolecularmarkerassistedselection.Eightqualitytraitsandmostofthequantitativetraitscouldbeusedasmorphologicalmarkers，asanauxiliarymeansofrootstock-usedpumpkingermplasmsevaluationandbreedingofnewvarieties.Keywords：pumpkin；rootstock；phenotype；SSR研究表明，南瓜（CucurbitaL.）砧木的選擇對于嫁接黃瓜栽培中抵抗土傳病害和土壤鹽漬化危害十分重要（曾義安等，2005；李萍萍，2011）。南瓜目前在世界各地廣泛栽培（林德佩，2000）。中國南瓜（Cucurbitamoschata）、印度南瓜（C.maxima）、美洲南瓜（C.pepo）、灰籽南瓜（C.mixta）和黑籽南瓜（C.ficifolia）是中國常見的5個栽培種，每一個栽培種又有許多的類型和品種（王鳴，2002），使南瓜成為生物多樣性最為豐富的植物（Esquinas-Alcázar&Gulick，1983）。然而，生產中能夠應用于黃瓜嫁接的南瓜砧木品種并不多，并且砧木品種選育的基礎研究也較薄弱（李國強等，2008）。種質資源是進行育種工作的基礎，狹窄的遺傳基礎難以培育出突破性品種（賴勇等，2013）。因此，開展砧用南瓜種質資源評價研究，對優(yōu)良砧木的選擇利用和新品種選育具有重要意義。袁建民等（2012）對國內外37份南瓜種質通過調查30個變異系數較大的形態(tài)學性狀進行遺傳多樣性分析，發(fā)現不同性狀在不同的材料之間表現出不同程度的形態(tài)學多樣性。Ahamed等（2012）對20份南瓜種質的評價中發(fā)現，有7個品種可用于今后的育種工作，并提出不同基因型南瓜的葉片長、葉片厚度、分枝數、單瓜質量、果皮色、果肉色等具有顯著差異。杜曉華等（2010）調查的8個性狀（葉長、葉寬、葉面積、蔓長、蔓粗、節(jié)間長、第一雄花節(jié)位和第一雌花節(jié)位）在50份南瓜自交系間差異顯著。Ferriol等（2004）通過SRAP和AFLP標記對來自中美洲、南美洲及西班牙地區(qū)的47份南瓜資源進行了分子多樣性分析，將不同種質分成2個類群。Gwanama等（2000）通過RAPD技術，將非洲的31份基因型的南瓜分為3類。然而，相對于RAPD、AFLP、RFLP等分子標記技術，SSR標記具有技術簡單、多態(tài)性高、重復性好等特點，已逐漸成為研究遺傳多樣性的理想工具（趙慶勇等，2010）。Gong等（2012）利用134對SSR引物分析了104個美洲南瓜品種的親緣關系，在20個連鎖群中共檢測到418對等位基因。值得關注的是，Liu等（2013）認為，基于形態(tài)學特征與分子標記的親緣關系分析將提高籽用南瓜種質資源分類的準確性，并且二者的聚類分析結果具有顯著相關性（劉超，2012）。而且，目前對南瓜種質資源的研究大多集中在食用南瓜、觀賞南瓜和籽用南瓜上，關于砧用南瓜種質資源遺傳多樣性的研究鮮有報道。本研究中通過對中國生產和市場進行調研，搜集了設施黃瓜嫁接栽培中常用的47份砧用南瓜種質資源，利用63個形態(tài)標記和已公開發(fā)表的144對南瓜SSR標記，共同進行遺傳多樣性分析，較全面地評價了砧用南瓜種質資源，將有利于了解生產中常用的砧用南瓜之間的親緣關系，為砧用南瓜種質資源創(chuàng)新和品種選育提供理論基礎。1材料與方法1.1試驗材料及其形態(tài)學性狀調查供試材料為中國設施黃瓜嫁接栽培中常用的砧用南瓜種質，共47份（表1），種子均購自砧木繁育單位。幼苗期試驗于2013年3—4月在南京農業(yè)大學牌樓試驗基地的塑料大棚內進行。種子經浸種、催芽后，播于15孔穴盤中基質育苗，每穴1粒，每個品種播種2盤共30株。育苗基質為蔬7期李鶴等：砧用南瓜種質資源形態(tài)學性狀與SSR標記分析1381菜專用育苗基質，由鎮(zhèn)江培蕾基質科技發(fā)展有限公司提供。成熟期試驗于2013年4—9月在南京農業(yè)大學江浦試驗基地進行。將幼苗定植于江浦農場的塑料大棚內，隨機區(qū)組設計，雙行定植，小區(qū)面積18.0m2，每小區(qū)種植10株，株距0.9m，行距2.0m，2次重復，吊蔓栽培，常規(guī)管理。共測定63個形態(tài)學性狀，其中質量性狀40個（表2），數量性狀23個（表3）。所有形態(tài)學性狀參照《南瓜種質資源描述規(guī)范和數據標準》（李錫香，2007）及相關標準進行統計。質量性狀按照表2的標準賦值，以0~12級進行記錄；數量性狀用直尺或游標卡尺測量長度、電子秤測量質量。表1材料名稱及來源Table1Originsandnamesofmaterials編號Accession品種Cultivar產地Origin植物學分類Botanicalclassification1寶爾砧木Baoer中國北京Beijing，China中國南瓜Cucurbitamaxima2昌砧鐵龍ChangzhenTielong中國山東Shandong，China白籽南瓜C.moschata×C.maxima3大維10號Dawei10中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima4大維17號Dawei17中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima5大維3號Dawei3中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima6大佐臺木Dazuo中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima7東方正大旗艦DongfangZhengdaQijian中國甘肅Gansu，China白籽南瓜C.moschata×C.maxima8東洋神力DongyangShenli中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima9豐億真亮FengyiZhenliang中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima10奉煌一號Fenghuang1印尼Indonesia中國南瓜C.maxima11荷蘭速騰HelanSuteng荷蘭Holland中國南瓜C.maxima12黑南瓜籽Heinanguazi中國山東Shandong，China黑籽南瓜C.ficifolia13佳合臺木JiaheTaimu日本Japan中國南瓜C.maxima14金剛1號Jingang1中國北京Beijing，China中國南瓜C.maxima15金優(yōu)臺木JinyouTaimu中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima16京欣砧5號Jingxin5中國甘肅Gansu，China中國南瓜C.maxima17昆侖Kunlun日本Japan中國南瓜C.maxima18力王臺木LiwangTaimu中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima19亮光黃瓜專用砧木Great中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima20強力冠軍QiangliGuanjun日本Japan中國南瓜C.maxima21強力一閃QiangliYishan日本Japan中國南瓜C.maxima22強勢臺木QiangshiTaimu中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima23日本根力神Genlishen中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima24日本金秀臺木Jinxiu日本Japan中國南瓜C.maxima25日本井田臺木Jingtian中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima26日本綠霸Lüba日本Japan中國南瓜C.maxima27日本強力士Qianglishi日本Japan中國南瓜C.maxima28日本青藤臺木Qingteng中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima29日本秀麗Xiuli日本Japan中國南瓜C.maxima30日本雪松Xuesong日本Japan白籽南瓜C.moschata×C.maxima31日本砧木王Zhenmuwang日本Japan中國南瓜C.maxima32神力1號Shenli1中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima33神砧Shenzhen中國河北Hebei，China中國南瓜C.maxima34勝利（黃）Victory（yellow）日本Japan白籽南瓜C.moschata×C.maxima35勝利（白）Victory（white）日本Japan中國南瓜C.maxima36臺丈夫F1TaizhangfuF1中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima37臥底龍Wodilong中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima38一輝F1（強力土佐）YihuiF1中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima39戰(zhàn)神砧木F1ZhanshenF1中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima40正大魔力ZhengdaMoli印尼Indonesia中國南瓜C.maxima41子木川秀ZimuChuanxiu中國山東Shandong，China中國南瓜C.maxima42中原冬生ZhongyuanDongsheng中國新疆Xinjiang，China中國南瓜C.maxima43中原強生ZhongyuanQiangsheng中國新疆Xinjiang，China中國南瓜C.maxima44中原共生新一代ZhongyuanGongsheng中國新疆Xinjiang，China白籽南瓜C.moschata×C.maxima45JAP魔根砧木F1MogenF1中國遼寧Liaoning，China中國南瓜C.maxima46鴛鴦藤Yuanyangteng印尼Indonesia中國南瓜C.maxima47黑籽南瓜HeiziNangua中國山東Shandong，China黑籽南瓜C.ficifolia1382園藝學報41卷1.2植物基因組DNA的提取與PCR擴增2013年9月，在南京農業(yè)大學生科樓的塑料拱棚內進行穴盤基質育苗，每個品種30株。幼苗一葉一心時取第一片真葉，每品種取樣10株。樣品液氮速凍后，貯存于–80℃冰箱內待用。采用植物基因組DNA提取試劑盒DP305-03（天根生化科技有限公司）提取葉片總DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，epporfBioPhotometerplus核酸分析儀測定樣品DNA濃度，稀釋至50ng·μL-1備用。選取144對SSR引物（由Oligo公司合成）進行特異性引物篩選（Gongetal.，2008；王冬杰，2013），選用5個差異較大品種的DNA作模板。選擇條帶清晰、有差異帶和重復性好的引物，用于全部砧用南瓜樣本的分析。PCR反應體系為20μL，包括：50ng·μL-1DNA模板1.0μL，10×ExTaqBuffer（Mg2+free）2.0μL，25mmol·L-1MgCl21.5μL，2.5mmol·L-1dNTPMixture1.6μL，10μmol·L-1正反向引物各1.0μL，2.5U·μL-1的rTaq0.2μL，以及ddH2O11.6μL。溶液分裝在eppendorfepMotion5070移液工作站上進行。PCR擴增在BiorerLifeExpressPCR儀內進行，程序為：95℃預變性5min，94℃變性1min，退火（溫度隨引物的不同而改變）1min，72℃延伸1min，38個循環(huán)，72℃延伸10min后立即置于冰水混合物中，冷卻后置于4℃冰箱中保存待測。采用JY-JX7垂直電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司制造），在8%非變性聚丙乙烯酰胺凝膠中對擴增產物進行電泳分離。電泳結束后銀染，用GEImageScannerⅢ圖像掃描系統（德國）觀察并照相記錄。1.3譜帶統計及數據分析記錄易于辨認的多態(tài)性位點。擴增產物按同一遷移位置上條帶在各個材料中的有（記為1）、無（記為0）進行統計（不具多態(tài)性的條帶不予統計），建立數據矩陣。SSR標記的變異的多樣性指數（H’），是根據所有材料中等位基因出現的頻率計算的（劉超，2012）：H’=–ΣPilnPi。其中，Pi表示第i個等位基因出現的頻率。利用NTSYS-pc2.11軟件，計算材料間的遺傳相似性系數，根據非加權算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，構建系統進化樹。形態(tài)學性狀的數據分析參照尚建立等（2012）的方法，數量性狀根據平均值（X）和標準差（δ）分為10級，1級<X–2δ，10級≥X+2δ，中間每級相差0.5δ。各性狀的遺傳多樣性采用Shannon’s信息指數（H’）進行評價：H’=–ΣPilnPi，Pi表示第i種變異類型出現頻率，用所有相應的各個性狀H’的平均值表示一組或所有種質的遺傳多樣性程度。采用Excel計算各性狀的最大值、最小值、平均值、極差和變異系數，采用SPSS20.0進行方差分析和顯著性測驗，采用NTSYS-pc2.11軟件進行UPGMA聚類。2結果與分析2.1形態(tài)學性狀遺傳多樣性分析47份砧用南瓜種質資源質量性狀分布及多樣性情況見表2，多樣性指數的變化范圍為0.18~1.45，平均值0.79。其中，多樣性指數最高的質量性狀為嫩瓜皮色，主要以淺綠色（頻率31.91%）、綠色（21.28%）、深綠色（19.15%）為主。共有8個質量性狀的多樣性指數大于1.00，包括嫩瓜皮色、瓜形、主蔓色、瓜面斑紋、葉面白斑、葉形、嫩瓜斑紋、嫩瓜斑紋色。瓜形的多樣性指數為1.44，主要為扁圓形（19.79%）、近圓形（25.53%）和梨形（17.02%）。40.43%的種質的主蔓顏色為深綠色。瓜面斑紋以塊狀為主，占所有種質的48.94%。50%以上種質（51.06%）沒有葉面白斑。大部分種質7期李鶴等：砧用南瓜種質資源形態(tài)學性狀與SSR標記分析1383（63.83%）的葉片為掌狀五角形。子葉色為多樣性指數最低（0.18）的質量性狀，95.74%種質的子葉色為深綠色。表2砧用南瓜種質資源質量性狀分布及多樣性Table2Frequencydistributionanddiversityindexofrootstock-usedpumpkingermplasmsonqualitativecharacters頻率/%Frequency性狀Trait賦值標準Criteria012345789101112H’種皮色Seedcolor1白White；3黃白Yellowish-white；7黑Black10.6485.114.260.51種皮光澤Seedluster0無Mat；1有Glossy85.1114.890.42種緣表面特征Seedsurface1平滑Smooth；2粗糙Rough14.8985.110.42種子周緣Seedmargin0無隆起Flat；1隆起Ridgy；2狹邊Narrow10.6485.114.260.51種子周緣色Seedmargincolor1淺Light；2與種皮相近Similartoseedcoat；3深Dark2.1310.6487.230.44種喙特征Seedbeakcharacters1圓鈍，不傾斜O(jiān)btuse；2平直，不傾斜Flat；3平直，傾斜Flat&tilt29.7955.3214.890.97子葉色Cotyledoncolor2綠Green；3深綠Darkgreen4.2695.740.18花冠色Corollacolor1淺黃LightYellow；2黃Yellow；3橙黃Orange-yellow12.7772.3410.640.74花筒形狀Floraltubeshape1鐘形Bell-shaped；2圓筒形Cylindrical；3廣平開杈Open87.236.382.130.38花瓣先端形狀Petalshape1銳角Acute；2鈍角Obtuse；3圓形Round82.988.514.260.50花萼片Sepals1小、細Small&thin；2大、常呈葉狀Big&leafy70.2125.530.60花梗刺毛Pedicelbristle0無Without；1有With44.6851.060.70主蔓色Mainvinecolor1黃綠Yellow-green；2淺綠Lightgreen；3綠Green；4深綠Darkgreen10.6421.2827.6640.431.29主蔓刺毛Mainvinebristle1少Less；2中More；3多Most40.4348.9410.640.95主蔓橫切面形狀Mainvinesectionshape1五棱形Fiveprismatic；2圓形Round4.2695.740.18葉形Leafshape1掌狀Palmate；2掌狀五角Palmate&pentagonal；3心臟形Heartshaped；4心臟五角Heartshaped&pentagonal；5近圓Nearround6.3863.834.268.5117.021.11葉色Leafcolor1淺綠Lightgreen；2綠Green；3深綠Darkgreen19.1565.9614.890.87葉緣Leafmargin1全緣Entire；2波狀Wave；3鋸齒Jagged36.1757.456.380.86葉裂刻Typeoflobedleaf0無None；1淺Light；2中Deeper；3深Deepest29.7963.832.134.260.86葉面白斑Foliagewhitespotting0無None；1少Less；2中More；3多Most51.0619.1525.534.261.14葉背刺毛Bladebackbristle1硬Hard；2軟Soft68.0931.910.63瓜梗基部Stalkbasal0無變化Straight；1基部稍膨大Slightlyenlarged；2基部膨大Baseenlarged；3均勻膨大Enlarged2.136.3829.7948.940.971384園藝學報41卷續(xù)表2頻率/%Frequency性狀Trait賦值標準Criteria012345789101112H’瓜?；颗虼笮螤頢talkbasalenlargementshape1五角形Pentagonal；2圓弧狀Arcshaped57.4529.790.68瓜梗橫切面形狀Stalktransversesectionshape1圓形Round；2五棱形Fiveprismatic；3橢圓形Oval53.1931.912.130.78嫩瓜皮色Tendergourdskincolor1白White；5淺黃Lightgreen；10淺綠Lightgreen；11綠Green；12深綠Darkgreen；13墨綠Mossygreen6.384.2631.9121.2819.151.45嫩瓜斑紋Tendergourdspeckle2條Strip；3塊Massive；4網Mesh27.6634.0425.531.07嫩瓜斑紋色Tendergourdspecklecolor1淺綠Lightgreen；4橙黃Orange-yellow；5橙Orange；7橙紅Orange-red48.9419.1517.022.131.05瓜面特征Gourdskincharacters1平滑Flat；3皺縮Shrinking；4瘤突Bulged12.776.3868.090.70棱溝深淺Edgeandditch0無Without；1淺Shallow；2中Deeper；3深Deepest6.3859.5717.024.260.92瓜瘤大小Gourdtumorsize0小Smallest；1較小Smaller；2中Middle2.1370.2114.890.61瓜瘤多少Gourdtumorquantity1少Less；2中More；3多Most72.3412.772.130.58瓜面蠟粉Gourdskinwaxpowders0無None；1少Less；2中More2.1357.4527.660.76近瓜蒂瓜面形狀Shapeofskinnearpedicel1凹Concave；2平Flat；3凸Convex31.9151.064.260.84瓜頂形狀Shapeofthetopofgourd1凹Concave；2平Flat；3凸Convex25.5357.454.260.80瓜形Fruitshape1盤形Disc；2扁圓Oval；3近圓Nearround；4橢圓Elliptical；7長筒Barrel-shaped；8梨形Pear-shaped8.5129.7925.534.262.1317.021.44皮色Skincolor2紅Red；3橙紅Orange-red；4橙黃Orange-yellow；5黃Yellow；8深綠Darkgreen；9墨綠Mossygreen2.1363.8314.830.90瓜面斑紋Skinspeckle0無None；1點Dot；2條Strip；3塊Massive；4網Mesh6.3810.646.3848.9414.891.22斑紋色Specklecolor1淺紅Lightred；3深紅Darkred；4淺黃Lightyellow；7淺綠Lightgreen63.832.137瓜肉色Fleshcolor1淺黃Lightyellow；2黃Yellow；4橙黃Orang-yellow31.9144.6810.640.96橫切面形狀Transversesectionshape1圓形Round；3有均勻的凹陷Uniformhollow；4不規(guī)則形狀Irregular12.7768.096.380.70砧用南瓜種質資源數量性狀的多樣性指數均大于1.00（表3），變化范圍為1.14~1.91，平均值1.64，顯著高于質量性狀的多樣性指數，說明數量性狀更豐富。各數量性狀的變異系數變化范圍為6.20%~96.04%。其中，種子活力指數的最大值為294.66，最小值為0，即沒有發(fā)芽，變異系數為96.04%。單瓜質量、壯苗指數、種子百粒質量的變異系數均大于40%，分別為57.64%、40.29%、40.27%。在所有性狀中，幼苗期（種子萌發(fā)到三葉一心時）的多樣性指數和變異系數是最小的，分別為1.14和6.20%。種子活力指數和壯苗指數與南瓜作為砧木的要求比較密切，在47份砧木資源中種子活力指數的最大的是13號品種‘佳合臺木’，壯苗指數最大的是25號品種‘日本井田臺木’。7期李鶴等：砧用南瓜種質資源形態(tài)學性狀與SSR標記分析1385表3砧用南瓜種質資源數量性狀變異統計Table3Variationanalysisofquantitativecharactersforrootstock-usedpumpkingermplasms性狀Trait均值Mean標準差SD極小值Minimum極大值Maximum極差Range變異系數/%CV多樣性指數H’種子長度/cmSeedlength1.600.9011.811.76種子寬度/cmSeedwidth0.850.130.601.200.6014.721.68種子厚度/cmSeedthickness0.250.060.160.520.3626.351.48種子百粒質量/gHundredseedweight10.674.306.1024.2018.1040.271.45發(fā)芽率/%Germinationrate7127010010037.691.79種子活力指數Seedvigorindex48.6346.710294.66294.6696.041.74子葉長/cmCotyledonlength4.820.633.706.602.9013.051.78子葉寬/cmCotyledonwidth3.380.422.404.902.5012.471.83出苗率/%Emergencerate8120191008124.721.28幼苗期/dSeedlingstage20.751.2916.0024.008.006.201.14壯苗指數Seedlingindex0.380.150.080.890.8140.291.91首雄花節(jié)位Firstmaleflowerposition4.281.602.008.006.0037.451.74主蔓粗/mmMainstemwidth9.511.775.2115.3510.1418.611.78葉片長/cmLeaflength32.324.5223.4047.4024.0013.981.76葉片寬/cmLeafwidth32.184.5220.8045.7024.9014.041.86葉柄長/cmPetiolelength29.305.4618.9045.5026.6018.651.81葉柄粗/mmPetiolewidth10.862.077.1218.0910.9719.041.71瓜梗長/cmStalklength015.5011.3021.341.69瓜梗橫徑/mmStalkwidth12.072.058.5324.0015.4717.001.54瓜肉厚/cmFleshthickness2.530.691.004.503.5027.091.69老瓜縱徑/cmFruitverticaldiameter11.803.596.9035.2028.3030.401.24老瓜橫徑/cmFruitlongitudinaldiameter14.102.858.0021.9013.9020.181.66單瓜質量/gSinglefruitweight1.350.780.415.465.0557.641.332.2SSR標記分析以144對SSR引物對5份差異較大的砧用南瓜材料進行擴增，發(fā)現有40對引物能夠得到清晰、穩(wěn)定、具有多態(tài)性的擴增條帶。40對多態(tài)性SSR標記共檢測到167個等位變異（表4），變幅2~8個，平均每個標記4.18個。其中標記CMTp148、CMTm11、CMTm63檢測到的標記最多，標記CMTp107、CMTp125、CMTp177、CMTp191、CMTp224、CMTm181、CMTm181、CMTm221、CMTmC30檢測到的標記最少。多態(tài)性SSR標記的多樣性指數的變化范圍為0.16~1.18，平均值0.62。其中多樣性指數最低的SSR標記為CMTp177，最高的為CMTm11（圖1）。圖1中共有8條多態(tài)性條帶，其中12、47號種質具有兩條其他種質都沒有的條帶，同時又缺失兩條其他種質共有的條帶。表4多態(tài)性SSR標記的基本信息Table4BasicinformationofpolymorphicSSRprimers序列Sequence編號No.SSR引物SSRprimer正向引物Forwardprimer（5′–3′）反向引物Reverseprimer（5′–3′）多態(tài)帶數Polymorphicfragments多樣性指數H’1CMTp47AAACGGTTGAGGAGGATGACAGGTCATTTGGCGTGATAACT40.952CMTp53ACAACCATCACAACGCTTTCTTGGAATCAGTTCCAGTTCG30.623CMTp55GCATTTCACTCCCGATTCTCGTCTCGGAAATCCAATCCAC60.864CMTp62GTGCCCGTCAGTCGGAATTGTCGACGAAGATAGCAATAGCA40.435CMTp91TTTGGATTGAGTGTTCATCGCGGACAACATACCCAAAATAG30.616CMTp97CCACACACCAATCGTTGAAGCGCAGAATCTCGAAACACAA70.747CMTp107CGATGATGAACAGGAAGACGTCACATCCATTCCCCTCTCT20.288CMTp125CTTGTTCCGCAGCATCAGAGTGAGAGGGAGACGCAAAG20.389CMTp130GCCCATTTCTGGAGAGATAGTAGAGGAGAGATGCAGAGCAAC40.5510CMTp138AAAGGTTTCCACATCCTTGGAAAAGGAAAAAGTGTTCAAAG40.4611CMTp148TGAAGACAGCAAGCAGGAAGGCTTGGTTGGTTTCTTTGCT81.1512CMTpl69TGCAGTGAATGGAAACCTGTTCCGGCATTATAATCAGAACC40.6313CMTpl77AGCCAAACCAGCATCGAAATCGACGATGTCAAACCTCCAC20.1614CMTp191AAAGGGTACCTCGCTGTGTGTTTGCAGTACGCTGCAGAAC20.5215CMTp201AGGAGTGGTGGGCTAATACGTGAAATTGAGGGAGGGAGAG60.8916CMTp224CACCGACGACTCCATCATCCTTCTTGTCCCCAAAATCACA20.241386園藝學報41卷續(xù)表4序列Sequence編號No.SSR引物SSRprimer正向引物Forwardprimer（5′–3′）反向引物Reverseprimer（5′–3′）多態(tài)帶數Polymorphicfragments多樣性指數H’17CMTp263CAGGCTATTCGCACCCTCTACCTCATGCATTTTGCGTGTA50.5618CMTm5TTTCTCGAGCCTCACATGGACAATTTGGATATTA50.9519CMTm11TGGAAGGATTCTCCCACAGTTACAATTTGACGTCCGCAAG81.1820CMTm19GCATGGGAGATGAAGGTTAGATTTCCTGGTGGTATGAGATTC50.7221CMTm20GTGGGCCATATCGATTCACTCGAAAGTCGCAGAGAACACA50.7922CMTm50CAGTGTTCCTCTCCCCATTCTCGGACTCTGAACTTGACCA30.4323CMTm62AGTGAGGGAGGCGACAACTGAACGTGTCCATGTCATTGC30.3224CMTm63GCAGAAGATACCGTCGGAGTAAGGTGAACGGGAATGTGAG80.6325CMTm66ACGCGTTGTTGTTAGTGTGGGGGGATTTATGAACCCAACAT30.5126CMTm90TGAAGCATTAAAAATGGGTGTGACACATTGCCCACTAATTCTAGG50.8427CMTm121CCCAAATTCAAAAGAAAATCCCAGTTAAATCAGACCGAAT30.4428CMTm133CGACGTATGATCGAGCCTCTTGCTAAGCCGTTGTCATCTCT40.6029CMTm144ACATGGGCATACCTCGAATCCACCTGGCTGTTTTGTCTGA30.2930CMTm158CCCAGCTATGAAGGTCTCTGAAAAGCACAAAAGAAACACCA50.8231CMTm165TTCCAGACCCAATTCCCTTATCCATGGAGATGGGAGGTAG50.9732CMTm170TCAGACCCACTCCCATGAACAGCGAACACGTGAAAACGTC50.9733CMTm181CCCTTAAGGTCTCGCAGCTTTATTAGGCGGACGGACAGG20.6034CMTm183CTTTGCATTGCCACTCTTCTTGAGGGAAATTGAATGTGGT40.6835CMTm209ATTAGAATCCCTTGGAGAACGGCAATCGTTTTTCTGTTGGT60.5936CMTm214TGCTTTGATCAGTGAGCAGTGGATGTACTCTCCGGACTTTC40.5637CMTm221CAATAAGATAGCTCTCACGTTGCTGCCTAGTTATCGCGACTTC20.4338CMTm248TGATCATGAAAGGGGGAGAGCCACTTCAAGCTTGCCTTCT40.3439CMTmC1AACGTCCTTACTGGCACACCTTCCACAAGTTGTTTTGGTCAC50.8540CMTmC30TCAAACACTTTCTTTGGAAGGATTTCATTGAACTGGGTCAAGCG20.24圖1引物CMTm11在47份砧用南瓜材料上的PCR擴增圖Fig.1PCRamplificationprofilein47varietiesbyprimerCMTm11inrootstock-usedpumpkins2.3聚類分析依據歐式距離，對47份砧用南瓜種質資源的所有形態(tài)學性狀進行UPGMA聚類分析，繪制聚類樹狀圖（圖2）。當閾值為1.02時，47份材料劃分為4個類群。其中，第Ⅰ類群中包含了大部分的品種，共有40份種質，占85.11%；類群Ⅱ只有1個品種（34號）；第Ⅲ類群中有4個品種，分別為2、7、30、44號材料；類群Ⅳ中為12和47號材料。類群Ⅰ全部為中國南瓜，類群Ⅱ和Ⅲ為白籽南瓜，類群Ⅳ為黑籽南瓜。在4個類群中，根據對形態(tài)性狀的測量和觀察（具體數據未列出），類群Ⅰ種子均無光澤、多數質量較輕，能結實，植株長勢中等；類群Ⅱ種子白色、有光澤，能結實，植株長勢較強；類群Ⅲ種子均為白色、有光澤，雄蕊敗育，未結實，植株長勢較強；類群Ⅳ少雌花，結實率極低，植株長勢前期強后期弱。在3個類型的南瓜中，白籽南瓜（類群Ⅱ、Ⅲ）的植株長勢7期李鶴等：砧用南瓜種質資源形態(tài)學性狀與SSR標記分析1387最強，暗示其作為砧木嫁接，可能會增強嫁接苗的長勢。當閾值為0.90時，第Ⅰ類群還可以劃分為3個亞類群：亞類群Ⅰ-i包括37個品種，亞類群Ⅰ-ii中有2份材料（23、24號），亞類群Ⅰ-iii中只有25號材料。第Ⅲ類群又劃分為兩個亞類群：亞類群Ⅲ-i中包括2號和7號材料，亞類群Ⅲ-ii中有30號和44號材料。類群Ⅱ和Ⅳ沒有劃分出亞類群。圖2砧用南瓜種質形態(tài)學性狀聚類樹狀圖Fig.2Dendrogrambyclusteranalysisbasedonphenotypeofrootstock-usedpumpkingermplasms利用SSR標記，將47份砧用南瓜種質的遺傳相似系數按UPGMA法進行聚類分析，得到聚類樹狀圖（圖3）。在GS=0.83水平上聚為3類。類群Ⅰ同樣包含40個品種（與形態(tài)學性狀聚類結果相同），類群Ⅱ中有5個品種（包括了圖1中的類群Ⅱ和Ⅲ），類群Ⅲ中含有2個品種（同圖1中的類群Ⅳ）。類群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為中國南瓜、白籽南瓜和黑籽南瓜。當GS=0.90時，類群Ⅰ分為兩個亞類群：亞類群Ⅰ-i包括39個品種，亞類群Ⅰ-ii中只有8號1份材料；類群Ⅱ分為4個亞類群：亞類群Ⅱ-i中有2個品種（2號和30號），44、34、7號分別歸屬于亞類群Ⅱ-ii、iii、iv；類群Ⅲ分為兩個亞類群，亞類群Ⅲ-i（12號）和Ⅲ-ii（47號）。在統計的167個條帶中，類群Ⅱ、Ⅲ分別有30、42個特異性條帶，占總條帶數的18.0%和25.1%。中國南瓜的分類中，形態(tài)標記將23、24號分為一類，25號分為一類，其他的37個品種分為一類；分子標記將8號分為一類，其他的39個品種分為一類。白籽南瓜的分類中，形態(tài)標記將34號分為一類，2、7號分為一類；30、44號分為一類；分子標記將2、30號分為一類，44號、34號、7號各成一類。黑籽南瓜的分類中，形態(tài)標記仍將12、47號分為一類，而分子標記將這兩個品種分成兩類?？梢钥闯?，對于中國南瓜來說，分子標記比形態(tài)標記少劃分出3個品種；對于白籽及黑籽南瓜來說，分子標記比形態(tài)標記都多劃分出1個品種。也許是因為選用的SSR標記對于黑籽及白籽南1388園藝學報41卷瓜比中國南瓜具有更強的分辨能力。總之，形態(tài)標記與分子標記的聚類結果對于大部分品種是一致的，只有個別品種的聚類結果不同。圖3砧用南瓜種質SSR標記聚類樹狀圖Fig.3DendrogrambyclusteranalysisbasedonSSRmarkersofrootstock-usedpumpkingermplasms3討論形態(tài)性狀的鑒定和描述是種質資源研究最基本的方法和途徑，是種以上或種內分類不可缺少的重要依據之一（Horejsi&Staub，1999）。南瓜具有極其豐富的多樣性（王鳴，2002；張巖等，2010）。本研究中，數量性狀的變異系數變化范圍為6.20%~96.04%，變異系數大于40%的性狀有種子活力指數、單瓜質量、壯苗指數和種子百粒質量。質量性狀多樣性指數的變化范圍為0.18~1.45，其中，嫩瓜皮色、瓜形、主蔓色、瓜面斑紋、葉面白斑、葉形、嫩瓜斑紋、嫩瓜斑紋色的多樣性指數大于1.00?？梢钥闯?，在諸多質量性狀中，果實相關性狀的變異幅度較大，這與劉超（2012）的結論一致。63個形態(tài)學性狀多樣性指數變異范圍為0.18~1.14，平均1.10，數量性狀的多樣性指數普遍高于質量性狀，前人關于黃瓜（Szamosietal.，2010）及甜瓜（胡建斌等，2013）的報道中也有類似的結論。由于嫁接是在砧木苗期完成的，因此在形態(tài)學性狀中更加關注的是種子活力指數、壯苗指數、幼苗期、發(fā)芽率、出苗率等與種子發(fā)芽和幼苗生長有關的性狀，但幼苗期、發(fā)芽率、出苗率的變異系數較小，在實際砧木篩選利用中難以用來區(qū)分品種優(yōu)劣，而種子活力指數、壯苗指數的變異系數大于40%，可作為砧木篩選利用的參考指標。種子活力指數高表明種子發(fā)芽能力強，砧木壯苗指數大表明幼苗健壯，是嫁接苗健壯生長的保障。本試驗中種子活力指數最大的是13號品種，壯苗指數最大的是25號品種，但還不能判定這2個品種就是適于黃瓜嫁接中優(yōu)良的砧木品種，還要考察其與黃瓜的親和性以及嫁接后對植株生長、產量、品質的影響等。本研究從144對SSR引物中篩選出40對多態(tài)性引物，每對引物平均擴增出4.18條多態(tài)性條帶，7期李鶴等：砧用南瓜種質資源形態(tài)學性狀與SSR標記分析1389高于劉超（2012）及向成鋼等（2013）在南瓜親緣關系分析中檢測到的平均每個位點2.48個及3.4個等位基因。類群Ⅱ、Ⅲ分別有18.0%和25.1%的特異性條帶，可見類群Ⅱ、Ⅲ與類群Ⅰ親緣關系較遠。8號種質有8條不同于類群Ⅰ中其他種質的特異性條帶，所以8號種質與類群Ⅰ中的其他39份種質被劃分成兩個亞類群。前人根據不同作物的特點，對資源多樣性評價和分類研究時發(fā)現，從形態(tài)和分子水平對資源劃分類別不盡相同（Lahozetal.，2011）。然而，以往從分子水平與形態(tài)水平對南瓜資源進行分析，發(fā)現形態(tài)水平與分子水平對資源的分類雖然并不完全相同，但都具有極高的相關性（劉超，2012）。本研究中也發(fā)現，在形態(tài)學標記與SSR標記進行大類劃分時，其結果幾乎沒有差別（只有1個品種有差別），即黑籽南瓜、白籽南瓜和中國南瓜都被歸入不同類群；當進一步進行分類時，差別才逐步顯現。此外，根據前期試驗結果，對非生物脅迫（高溫、低溫、鹽堿）抗性較強的砧用南瓜品種在各大類群中均有分布，在亞類群中的分布并未發(fā)現規(guī)律。從形態(tài)學性狀和SSR標記分析的結果綜合來看，本研究中收集的砧用南瓜種質的遺傳基礎相對狹窄，主要集中在同一個大的類群（中國南瓜）中，親緣關系較近，遺傳多樣性較低。也許是因為在育種過程中不同栽培品種因其共同的育種目標，多樣性逐漸降低（Montillaetal.，2013），今后應擴大種質資源的收集范圍。不過，仍有一小部分品種與大部分品種親緣關系較遠或具有獨特、優(yōu)秀的性狀，可進行有針對性的保存和利用。同時本研究中發(fā)現SSR標記CMTm11具有極高的多態(tài)性，可用于今后砧用南瓜種質分子標記輔助選擇；并發(fā)現嫩瓜皮色等8個質量性狀和大部分數量性狀都可以作為形態(tài)標記，輔助砧用南瓜的種質評價及新品種的選育。ReferencesAhamedKU，AkhterB，IslamMR，AraN，HumanuanMR.2012.Anassessmentofmorphologyandyieldcharacteristicsofpumpkin（Cucurbitamoschata）genotypesinnorthernBangladesh.TropicalAgriculturalResearchandExtension，14(1)：7–11.DuXiao-hua，LiXin-zheng，LiuHai-ni，ChenHui-na.2010.Principalcomponentanalysisonprophaseagronomictraitsofpumpkin.ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica，19(2)：168–171.(inChinese)杜曉華，李新崢，劉海妮，陳會娜.2010.南瓜前期農藝性狀的主成分分析.西北農業(yè)學報，19(2)：168–171.Esquinas-AlcázarTJ，GulickJP.1983.GeneticresourcesofCucurbitaceae.AGlobalReport.IBPGRSecretariat，1：1–7.FerriolM，PicoB，deCórdovaPF，NuezF.2004.Moleculardiversityofagermplasmcollectionofsquash（Cucurbitamoschata）determinedbySRAPandAFLPmarkers.CropScience，44(2)：653–664.GongL，ParisHS，NeeMH，StiftG，PachnerM，VollmannJ，LelleyT.2012.GeneticrelationshipsandevolutioninCucurbitapepo（pumpkin，squash，gourd）asrevealedbysimplesequencerepeat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