《食品綜合大實驗》指導(dǎo)

PAGE《食品綜合大實驗》實驗指導(dǎo)食品安全教研室編二零一五年一實驗室規(guī)則實驗前認真預(yù)習實驗內(nèi)容。實驗時自覺遵守課堂紀律，嚴格按照操作進行操作，既要獨立操作又要與同學(xué)相互配合，不得隨意挪用他人的實驗材料。實驗數(shù)據(jù)和現(xiàn)象應(yīng)隨時記錄在實驗本上，不得記錄在紙片甚至憑印象記憶，試驗結(jié)束后認真寫好實驗報告，實驗報告最遲于實驗課結(jié)束后兩天前交給教師。精心愛護各種實驗器材，實驗所需的一般儀器按規(guī)定借領(lǐng)和歸還，完成試驗后按要求將儀器洗凈放在指定的位置。實驗室儀器、器皿、器械等物品嚴禁攜帶出實驗室。精密貴重儀器每次使用后應(yīng)登記姓名并記錄儀器情況，要隨時保持儀器的清潔。如果發(fā)生故障，應(yīng)立即停止使用并報告老師。節(jié)約用水、電和試劑藥品等。公用儀器、藥品用后放回原處，不要用個人的量取用具量取公用試劑。任何試劑都應(yīng)加蓋，并指明保存者的姓名、班級、日期和內(nèi)容物等。保持墻面、地面、水槽及室內(nèi)整潔，保持安靜，集中精力，不談笑聊天，培養(yǎng)良好的工作習慣和作風。杜絕火災(zāi)、水災(zāi)、盜竊和藥品中毒等事故的發(fā)生，嚴禁用實驗電爐、冰箱等電器做與實驗無關(guān)的事，冰箱內(nèi)不得存放乙醚、石油醚、丙酮等易燃易爆物品，電器周圍不得存入酒精等易燃品，不得用嘴吸取有毒、強酸、強堿類試劑。實行值日生負責制，負責實驗室當天的門、窗、水、電的安全，清理實驗臺面，負責儀器整理檢查、當天實驗室清潔衛(wèi)生等其他服務(wù)性工作。實驗報告規(guī)范原始實驗記錄是科學(xué)研究的檔案。實驗報告是考核學(xué)生實驗技能和水平及實驗動手能力與分析問題能力的重要材料。從學(xué)生時代就應(yīng)該養(yǎng)成良好的習慣，給予重視，注意培養(yǎng)自己的基本功。獲得準確的實驗結(jié)果還不是實驗的結(jié)束，實驗報告的目的是用一種明白易懂的方式向他人傳播結(jié)果和所引出的概念。書寫實驗報告是嚴格地撰寫科學(xué)論文的極好的練習方式。原則要求：規(guī)范、整潔，便于實驗的重復(fù)，保證同行能一目了然；書寫格式：實驗?zāi)康模簩W(xué)生應(yīng)該明確實驗?zāi)康模ㄟ^該實驗預(yù)期達到的目的，簡明扼要；實驗原理：以文字或圖表表示均可；實驗材料（列出主要的儀器）試劑：名稱、級別；儀器：特殊儀器要注明型號；實驗方法（實驗步驟）：應(yīng)盡量的條理化，交代要清楚，能參考，能重復(fù)，提綱式（也可寫見指導(dǎo)書）。實驗結(jié)果：文字要科學(xué)語言化，盡量用圖表示，不用零星的草稿紙，而是來源于原始記錄本。分析與討論：這部分是學(xué)會對實驗結(jié)果進行正確的認識和說判。分析：收獲、問題討論：成功與失敗原因與要求、設(shè)想、預(yù)想的一致性，與前次、他人或他組結(jié)果進行比較，找出差異，并作出相應(yīng)的討論；能對實驗提出改進設(shè)想最好。實驗一實驗前準備一、實驗?zāi)康呐囵B(yǎng)學(xué)生統(tǒng)籌安排實驗，對實驗順利開展的預(yù)判能力。要求學(xué)生能按照實驗指導(dǎo)及國家檢測標準，根據(jù)檢測樣品做出實驗試劑、儀器的安排以及實驗順序的合理調(diào)整。二、實驗原理無。三、試劑和器材原始記錄本。四、實驗步驟根據(jù)實驗指導(dǎo)書及國標，擬定本組實驗開展計劃，認真核算本組實驗開展所需儀器、試劑、器皿的量，做好本組人員的工作分配安排。五、注意事項1、一定要依據(jù)指導(dǎo)和國標進行考量，實驗順序的調(diào)整應(yīng)結(jié)合其它組別的開展情況，盡可能合理避開儀器使用高峰期；2、試劑、器皿的核算務(wù)必認真對待，避免試劑器皿的浪費；實驗二收樣登記及食品描述性實驗一、實驗?zāi)康囊髮W(xué)生掌握收樣登記條目，培養(yǎng)學(xué)生樣品收樣記錄的習慣。掌握用描述法評價樣品感官特性及每種特性的強度。二、實驗原理通過對收樣名稱、收樣時間、收樣人、樣品基本屬性以及收樣環(huán)境等作出詳細記錄，了解樣品初始情況，便于實驗結(jié)果的溯源。品評員通過對樣品在視覺、聽覺、嗅覺、觸覺等方面的感覺，獲取樣品的感官品質(zhì)的完整描述。三、試劑和器材原始記錄本、樣品。四、實驗步驟1.樣品收樣記錄：繪制收樣原始記錄表，詳細記錄所收樣品的基本信息，并按照標準進行入庫保藏；2.本實驗需要至少6名品評員。品評員應(yīng)能對產(chǎn)品的特性進行簡單易懂、準確的描述；3.得出6名品評員的描述詞匯后，進行討論、刪減及整理，得出最終描述結(jié)果。4.每種感官特性要求寫出盡可能多的描述詞匯，在20min內(nèi)完成實驗并完成下表：姓名：產(chǎn)品名稱：產(chǎn)品編號：請使用你認為適宜的詞匯，對產(chǎn)品的下列特性進行描述外觀質(zhì)地氣味風味5.討論：待品評完畢后，先刪掉不符合規(guī)范的描述詞，然后由小組負責人組織品評員進行討論，比較描述同一特性的詞匯，找出最為貼切的詞，合并同義詞，組合近義詞。對這些詞進行反復(fù)的討論，得到對同一感官特性的一致描述。對每種樣品的四種感官特性分別進行討論，最終得到四種感官特性的完整描述。五、思考題在本實驗中要評定的四個特性中，還有沒有更好的描述詞來描述這些特性？實驗三樣品中脂肪的測定一、實驗?zāi)康淖寣W(xué)生掌握索氏提取法測定食品中脂肪的原理，熟悉食品中脂肪測定的方法步驟，使學(xué)生能獲得獨立完成食品中脂肪含量測定的工作能力。二、實驗原理試樣用無水乙醚或石油醚等溶劑抽提后，蒸去溶劑所得的物質(zhì)，稱為粗脂肪。因為除脂肪外，還含色素及揮發(fā)油、蠟、樹脂等物，實驗所測脂肪為樣品中的游離脂肪。三、試劑和器材無水乙醚或石油醚、海砂（取用水洗去泥土的海砂，先用鹽酸（1+1）煮沸0.5h，用水洗至中性，再用氫氧化鈉溶液（240g/L煮沸0.5h，用水洗至中性，經(jīng)100℃±5℃）干燥備用）、索氏提取器、電熱恒溫鼓風干燥箱、干燥器、恒溫水浴箱。四、實驗步驟1．樣品處理

(1)固體樣品

準確稱取均勻樣品2～5g(精確至0.01mg)，必要時拌以海砂，全部裝入濾紙筒內(nèi)。

(2)液體或半固體

準確稱取均勻樣品5～10g(精確至0.01mg)，置于蒸發(fā)皿中，加入海砂約20g，攪勻后于沸水浴上蒸干，然后在95～105℃下干燥。研細后全部轉(zhuǎn)入濾紙筒內(nèi)，用沾有乙醚的脫脂棉擦凈所用器皿，并將棉花也放入濾紙筒內(nèi)。

2．樣品測定

(1)將濾紙筒放入索氏提取器的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加入無水乙醚或石油醚至瓶內(nèi)容積的2／3處。通入冷凝水，將燒瓶浸在水浴中加熱，用一小團脫脂棉輕輕塞入冷凝管上口。

(2)抽提溫度的控制

水浴溫度應(yīng)控制在使提取液每6～8min回流一次為宜。

(3)抽提時間的控制

抽提時間視試樣中粗脂肪含量而定，一般樣品提取6～12h，堅果樣品提取約16h。提取結(jié)束時，用毛玻璃板接取一滴提取液，如無油斑則表明提取完畢。

(4)提取完畢，取下脂肪燒瓶，回收乙醚或石油醚。待燒瓶內(nèi)乙醚僅剩下1～2mL時，在水浴上蒸盡殘留的溶劑，于95～105℃下干燥2h，置于干燥器中冷卻至室溫后稱量。繼續(xù)干燥30min后冷卻稱量，反復(fù)干燥至恒重(前后兩次稱量差不超過2mg)。4.結(jié)果計算樣品中粗脂肪質(zhì)量分數(shù)：式中

X——樣品中粗脂肪的質(zhì)量分數(shù)，％；

m——樣品的質(zhì)量，g；

m0——脂肪燒瓶的質(zhì)量，g；

m1——脂肪和脂肪燒瓶的質(zhì)量，g。

計算結(jié)果表示到小數(shù)點后一位。

五、注意事項1．抽提劑是易燃、易爆物質(zhì)，應(yīng)注意通風且不能有火源。

2．樣品的高度不能超過虹吸管，否則上部脂肪不能提盡而造成誤差。

3．反復(fù)加熱可能會因脂類氧化而增重，質(zhì)量增加時，以增重前的質(zhì)量為恒重。六、思考題：1.簡述索氏提取器的提取原理及應(yīng)用范圍。2.潮濕的樣品可否采用乙醚直接提??？3.使用乙醚作為脂肪提取劑時，應(yīng)注意的事項有哪些？實驗四樣品中蛋白質(zhì)的測定一、實驗?zāi)康淖寣W(xué)生掌握凱氏定氮法測定食品中蛋白質(zhì)的原理，熟悉食品中蛋白質(zhì)測定的方法步驟，使學(xué)生能獲得獨立完成食品中蛋白質(zhì)含量測定的工作能力。二、實驗原理食品中蛋白質(zhì)在加熱催化條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為食品中蛋白質(zhì)的含量。三、試劑和器材硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑、氫氧化鈉、95%乙醇，以上試劑均為分析純。四、實驗步驟1試樣處理：稱取充分混勻的固體試樣0.2g～2g、半固體試樣2g～5g或液體試樣10g～25g（約相當于30mg～40mg氮），精確至0.001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅、6g硫酸鉀及20mL硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h～1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。2測定：裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。3向接收瓶內(nèi)加入10.0mL硼酸溶液及1滴～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根據(jù)試樣中氮含量，準確吸取2.0mL～10.0mL試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室，以10mL水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi)，隨后塞緊棒狀玻塞。將10.0mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸餾10min后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定至終點，其中2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍乙醇溶液指示劑，顏色由紫紅色變成灰色，pH5.4；1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液指示劑，顏色由酒紅色變成綠色，pH5.1。同時作試劑空白。4結(jié)果計算試樣中蛋白質(zhì)的含量按式（1）進行計算?！?）式中：X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克（g/100g）；V1——試液消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，單位為毫升（mL）；V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，單位為毫升（mL）；V3——吸取消化液的體積，單位為毫升（mL）；c——硫酸或鹽酸標準滴定溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；0.0140——1.0mL硫酸[c(1/2H2SO4)＝1.000mol/L]或鹽酸[c(HCl)＝1.000mol/L]標準滴定溶液相當?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g）；m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。一般食物為6.25；純?nèi)榕c純?nèi)橹破窞?.38；面粉為5.70；玉米、高粱為6.24；花生為5.46；大米為5.95；大豆及其粗加工制品為5.71；大豆蛋白制品為6.25；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵為5.30；復(fù)合配方食品為6.25。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，蛋白質(zhì)含量≥1g/100g時，結(jié)果保留三位有效數(shù)字；蛋白質(zhì)含量＜1g/100g時，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。五、注意事項1、一定要依據(jù)指導(dǎo)和國標進行考量，實驗順序的調(diào)整應(yīng)結(jié)合其它組別的開展情況，盡可能合理避開儀器使用高峰期；2、注意實驗結(jié)果的準確性，以精密度為考量，具體而言在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不超過算術(shù)平均值的10%；實驗五樣品中鉛含量的測定一、實驗?zāi)康淖寣W(xué)生掌握食品中金屬鉛含量的測定原理，熟悉食品中鉛含量測定的方法步驟，使學(xué)生能獨立完成食品中鉛含量的測定工作。二、實驗原理試樣經(jīng)灰化或酸消解后，注入原子吸收分光光度計石墨爐中，電熱原子化后吸收283.3nm共振線，在一定濃度范圍，其吸收值與鉛含量成正比，與標準系列比較定量。三、試劑和器材試劑：硝酸：優(yōu)級純。過硫酸銨、過氧化氫（30%）。高氯酸：優(yōu)級純。硝酸（1＋1）：取50mL硝酸慢慢加入50mL水中。硝酸（0.5mol/L）：取3.2mL硝酸加入50mL水中，稀釋至100mL。硝酸（lmo1/L）：取6.4mL硝酸加入50mL水中，稀釋至100mL。磷酸二氫銨溶液（20g/L）：稱取2.0g磷酸二氫銨，以水溶解稀釋至100mL。混合酸：硝酸十高氯酸（9＋1）。取9份硝酸與1份高氯酸混合。鉛標準儲備液：準確稱取1.000g金屬鉛（99.99%），分次加少量硝酸（1＋1），加熱溶解，總量不超過37mL，移入1000mL容量瓶，加水至刻度。混勻。此溶液每毫升含1.0mg鉛。鉛標準使用液：每次吸取鉛標準儲備液1.0mL于100mL容量瓶中，加硝酸（0.5mol/L）至刻度。如此經(jīng)多次稀釋成每毫升含10.0ng，20.0ng，40.0ng，60.0ng，80.0ng鉛的標準使用液。儀器設(shè)備：原子吸收光譜儀，附石墨爐及鉛空心陰極燈。馬弗爐。天平（感量為1mg）。干燥恒溫箱。瓷坩堝。壓力消解器、壓力消解罐或壓力溶彈?？烧{(diào)式電熱板、可調(diào)式電爐。四、實驗步驟1試樣預(yù)處理：在采樣和制備過程中，應(yīng)注意不使試樣污染。糧食、豆類去雜物后，磨碎，過20目篩，儲于塑料瓶中，保存?zhèn)溆谩Ｊ卟?、水果、魚類、肉類及蛋類等水分含量高的鮮樣，用食品加工機或勻漿機打成勻漿，儲于塑料瓶中，保存?zhèn)溆谩?試樣消解：（可根據(jù)實驗室條件選用以下任何一種方法消解）①壓力消解罐消解法：稱取1g～2g試樣（精確到0.001g，干樣、含脂肪高的試樣＜1g,鮮樣＜2g或按壓力消解罐使用說明書稱取試樣）于聚四氟乙烯內(nèi)罐，加硝酸2mL～4mL浸泡過夜。再加過氧化氫2mL～3mL（總量不能超過罐容積的1/3）。蓋好內(nèi)蓋，旋緊不銹鋼外套，放入恒溫干燥箱，120℃～140℃保持3h～4h，在箱內(nèi)自然冷卻至室溫，用滴管將消化液洗入或過濾入（視消化后試樣的鹽分而定）10mL～25mL容量瓶中，用水少量多次洗滌罐，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混勻備用；同時作試劑空白。②干法灰化：稱取1g～5g試樣（精確到0.001g，根據(jù)鉛含量而定）于瓷坩堝中，先小火在可調(diào)式電熱板上炭化至無煙，移入馬弗爐500℃±25℃灰化6h～8h，冷卻。若個別試樣灰化不徹底，則加1mL混合酸在可調(diào)式電爐上小火加熱，反復(fù)多次直到消化完全，放冷，用0.5mol/L硝酸將灰分溶解，用滴管將試樣消化液洗入或過濾入（視消化后試樣的鹽分而定）10mL～25mL容量瓶中，用水少量多次洗滌瓷坩堝，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混勻備用；同時作試劑空白。③過硫酸銨灰化法：稱取1g～5g試樣（精確到0.001g）于瓷坩堝中，加2mL～4mL硝酸浸泡1h以上，先小火炭化，冷卻后加2.00g～3.00g過硫酸銨蓋于上面，繼續(xù)炭化至不冒煙，轉(zhuǎn)入馬弗爐，500℃±25℃恒溫2h,再升至800℃，保持20min，冷卻，加2mL～3mL1mol/L硝酸（4.7），用滴管將試樣消化液洗入或過濾入（視消化后試樣的鹽分而定）10mL～25mL容量瓶中，用水少量多次洗滌瓷坩堝，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混勻備用；同時作試劑空白。④濕式消解法：稱取試樣1g～5g（精確到0.001g）于錐形瓶或高腳燒杯中，放數(shù)粒玻璃珠，加10mL混合酸，加蓋浸泡過夜，加一小漏斗于電爐上消解，若變棕黑色，再加混合酸，直至冒白煙，消化液呈無色透明或略帶黃色，放冷，用滴管將試樣消化液洗入或過濾入（視消化后試樣的鹽分而定）10mL～25mL容量瓶中，用水少量多次洗滌錐形瓶或高腳燒杯，洗液合并于容量瓶中并定容至刻度，混勻備用；同時作試劑空白。3.測定：①儀器條件：：根據(jù)各自儀器性能調(diào)至最佳狀態(tài)。參考條件為波長283.3nm，狹縫0.2nm～1.0nm，燈電流5mA～7mA，干燥溫度120℃，20s；灰化溫度450℃，持續(xù)15s～20s，原子化溫度：1700℃～2300℃，持續(xù)4s～5s，背景校正為氘燈或塞曼效應(yīng)。②標準曲線繪制：吸取上面配制的鉛標準使用液10.0ng/mL（或μg/L），20.0ng/mL（或μg/L），40.0ng/mL（或μg/L），60.0ng/mL（或μg/L），80.0ng/mL（或μg/L）各10μL，注入石墨爐，測得其吸光值并求得吸光值與濃度關(guān)系的一元線性回歸方程。③試樣測定：分別吸取樣液和試劑空白液各10μL，注入石墨爐，測得其吸光值，代入標準系列的一元線性回歸方程中求得樣液中鉛含量。④基體改進劑的使用：對有干擾試樣，則注入適量的基體改進劑磷酸二氫銨溶液（一般為5μL或與試樣同量）消除干擾。繪制鉛標準曲線時也要加入與試樣測定時等量的基體改進劑磷酸二氫銨溶液。4.結(jié)果計算：試樣中鉛含量按式（1）進行計算：……………（1）式中：X——試樣中鉛含量,單位為毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；c1——測定樣液中鉛含量，單位為納克每毫升（ng/mL）；c0——空白液中鉛含量，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——試樣消化液定量總體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量或體積，單位為克或毫升（g或mL）。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。五、注意事項1、一定要依據(jù)指導(dǎo)和國標進行考量，實驗順序的調(diào)整應(yīng)結(jié)合其它組別的開展情況，盡可能合理避開儀器使用高峰期；2、試劑、器皿的核算務(wù)必認真對待，避免試劑器皿的浪費；3、在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的20%。實驗六樣品中砷含量的測定一、實驗?zāi)康淖寣W(xué)生掌握利用氫化物原子熒光光度法測定食品中金屬砷含量的原理，熟悉食品中砷含量測定的方法步驟，使學(xué)生能獨立完成食品中總砷含量的測定工作。二、實驗原理食品試樣經(jīng)濕消解或干灰化后，加入硫脲使五價砷還原為三價砷，再加入硼氫化鈉或硼氫化鉀使還原生成砷化氫，由氬氣載入石英原子化器中分解為原子態(tài)的砷，在制定的砷空心陰極燈的發(fā)射光激發(fā)下產(chǎn)生原子熒光，其熒光強度在固定條件下與被測液中的砷濃度成正比，與標準系列比較定量。三、試劑和器材試劑：氫氧化鈉溶液（2g/L）；硫脲溶液（50g/L）；硫脲溶液（1+9）：量取硫酸100mL，小心倒入水900mL中，混勻；硼氫化鈉溶液（10g/L）：稱取硼氫化鈉10g，溶于2g/L氫氧化鈉溶液100mL中，混勻，此液于冰箱可保存10天，取出后應(yīng)當日使用。氫氧化鈉溶液（10g/L）（供配制砷標準液用，少量即夠）；濕消解試劑：硝酸、硫酸、高氯酸；干灰化試劑：六水硝酸鎂（150g/L）、氯化鎂、鹽酸（1+1）；砷標準液：①砷標準儲備液：含砷0.1mg/mL。精確稱取于100℃干燥2h以上的三氯化二砷0.312g，加入100g/L氫氧化鈉10mL溶解，用適量水轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中，加（1+9）硫酸25mL，用水定容至刻度；②砷使用標準液：含砷1ug/mL，吸取1.0mL砷標準儲備液于100mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，此液應(yīng)當日配制使用。濕消解試劑：硝酸、硫酸、高氯酸干灰化試劑：儀器：原子熒光光度計四、實驗步驟1.濕消解：固體試樣稱樣1g-2.5g，液體試樣稱樣5g-10g（或mL）（精確至小數(shù)點后第二位），置入50mL-100mL錐形瓶中，同時做兩份試劑空白。加硝酸20mL-40mL，硫酸1.25mL，搖勻后放置過夜，置于電熱板上加熱消解。若消解液處理至10mL左右仍有未分解物質(zhì)或色澤變深，取下放冷，補加硝酸5mL-10mL，再消解至10mL左右觀察，如此反復(fù)兩三次，注意避免碳化。如仍不能消解完全，則加入高氯酸1mL-2mL，繼續(xù)加熱至消解完全后，再持續(xù)蒸發(fā)至高氯酸的白煙散盡，硫酸的白煙開始冒出。冷卻，加水25mL，再蒸發(fā)至冒硫酸白煙。冷卻，用水將內(nèi)容物轉(zhuǎn)入25mL容量瓶或比色管中，加入50g/L硫脲2.5mL，補水至刻度并混勻，備測。2.干灰化：一般應(yīng)用于固體試樣。稱取1g-2.5g（精確至小數(shù)點后第二位）于50mL-100mL坩堝中，同時做兩份試樣空白。加入150g/L硝酸鎂10mL混勻，低熱蒸干，將氯化鎂1g仔細覆蓋在干渣上，于電爐上碳化至無黑煙，移入550℃高溫爐灰化4h。取出放冷，小心加入（1+1）鹽酸10mL以中和氯化鎂并溶解灰分，轉(zhuǎn)入25mL容量瓶或比色管中，向容量瓶或比色管中加入50g/L硫脲2.5mL，另用（1+9）硫酸分次涮洗坩堝后轉(zhuǎn)出合并，直至25mL刻度，混勻備測。3.標準系列制備：取25mL容量瓶或比色管6支，依次準確加入1ug/mL砷使用標準液0、0.05、0.2、0.5、2.0、5.0mL（各相當于砷濃度0、2.0、8.0、20.0、80.0、200.0ng/mL）各加入（1+9）硫酸12.5mL，50g/L硫脲2.5mL，補加水至刻度，混勻備測。4.測定：4.1儀器參考條件：光電倍增管電壓400V；砷空心陰極燈電流35mA；原子化器溫度820℃-850℃；高度7mm；氫氣流速600mL/min；測量方式為熒光強度或濃度直接；讀數(shù)方式為峰面積；讀數(shù)延遲時間1s；讀數(shù)時間15s；硼氫化鈉溶液加入時間為5s；標液或樣液加入體積：2mL。4.2濃度方式測量：如直接測熒光強度，則在開機并設(shè)定好儀器條件后，預(yù)熱穩(wěn)定約20min。按“B”鍵進入空白值測量狀態(tài)，連續(xù)用標準系列的“0”管進樣，待讀數(shù)穩(wěn)定后，按空白鍵記錄下空白值（即讓儀器自動扣底）即可開始測量。先依次測標準系列（可不再測“0”管），標準系列測完后應(yīng)仔細清洗進樣器（或更換一支），并再用“0”管測試使讀數(shù)基本回零后，才能測試劑空白和試樣，每次測量不同的試樣前都應(yīng)清洗進樣器，記錄（或打?。y量數(shù)據(jù)。4.3儀器自動方式：利用儀器提供的軟件功能可進行濃度直讀測定，為此在開機、設(shè)定條件和預(yù)熱后，還需要輸入必要的參數(shù)。即：試樣量（g或mL）；稀釋體積（mL）；進樣體積（mL）；結(jié)果的濃度單位；標準系列各點的測量次數(shù)；標準系列的點數(shù)（不計零點），及各點的濃度值。首先進入空白值測量狀態(tài)，連續(xù)用標準系列的“0”管進樣以獲得穩(wěn)定的空白值并執(zhí)行自動扣底后，再依次測標準系列（此時“0”管需要再測一次）在測樣液前，需再進入空白值測定狀態(tài)，先用標準系列“0”管測試使讀數(shù)復(fù)原并穩(wěn)定后，再用兩個試劑空白各進一次樣，讓儀器取其平均值作為扣底的空白值，隨后即可依次測試樣，測定完畢后退回主菜單，選擇“打印報告”即可將測定結(jié)果打出。5.結(jié)果計算如果采用熒光強度測量方式，則需先對標準系列的結(jié)果進行回歸運算（由于測量時“0”管強制為0，故零點值應(yīng)輸入以占據(jù)一個點位），然后根據(jù)回歸方程求出試劑空白液和試樣被測液的砷濃度，再按式（1）計算試樣的砷含量：………………….(1)式中：X——試樣的砷含量，單位為毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；C1——試樣被測液的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；C0——試樣空白液的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；m——試樣的質(zhì)量或體積，單位為克或毫升（g或mL）。計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。6.精密度：濕消解法在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%；干灰化法在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15%。7.準確度：濕消解法測定的回收率為90%-105%；干灰化法測定的回收率為85%-100%。五、注意事項1、應(yīng)盡量選擇優(yōu)級純以上的試劑，以降低空白值；2、硼氫化鉀濃度對砷的測定有較大影響，應(yīng)保證其配制濃度大于等于推薦值，最好現(xiàn)配現(xiàn)用；3、每次工作完畢后必須用清水清洗樣品進樣管和定量管，關(guān)閉蠕動泵、主機和微機電源，關(guān)閉氬氣鋼瓶閥門，倒掉廢液；4、所用玻璃器皿常法洗凈后浸泡在鹽酸或硝酸中24h（可除去Hg、Pb等重金屬雜質(zhì)），再用高純水沖洗干凈晾干備用。做標準曲線的器皿應(yīng)單獨浸泡，避免交叉污染。實驗七樣品中糖精鈉含量的測定一、實驗?zāi)康淖寣W(xué)生掌握利用高效液相色譜法測定食品中添加劑糖精鈉含量的原理，熟悉食品中糖精鈉含量測定的方法步驟，使學(xué)生能獨立完成食品中糖精鈉含量的測定工作。二、實驗原理試樣加溫除去二氧化碳和乙醇，調(diào)pH至近中性，過濾后進高效液相色譜儀，經(jīng)反相色譜分離后，根據(jù)保留時間和峰面積進行定性和定量。三、試劑和器材試劑：甲醇：經(jīng)0.5um濾膜過濾；氨水（1+1）：氨水加等體積水混合；乙酸銨溶液（0.02mol/L）：稱取1.54g乙酸銨，加水至1000mL溶解，經(jīng)0.45um濾膜過濾；糖精鈉標準儲備溶液：準確稱取0.0851g經(jīng)120℃烘干4h后的糖精鈉，加水溶解定容至100mL。糖精鈉含量1.0mg/mL，作為儲備液；糖精鈉標準使用溶液：吸取糖精鈉標準儲備液10mL。放入100mL容量瓶中，加水至刻度，經(jīng)0.45um濾膜過濾，該溶液每毫升相當于0.10mg的糖精鈉。儀器：高效液相色譜儀，紫外檢測器。四、實驗步驟1.試樣處理：汽水：稱取5.00g-10.00g，放入小燒杯中，微溫攪拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）調(diào)pH約7，加水定容至適當?shù)捏w積，經(jīng)0.45um濾膜過濾。果汁類：稱取5.00g-10.00g，用氨水（1+1）調(diào)pH約7，加水定容至適當?shù)捏w積，離心沉淀，上清液經(jīng)0.45um濾膜過濾。配制酒類：稱取10.00g，放小燒杯中，水浴加熱除去乙醇，用氨水（1+1）調(diào)pH約7，加水定容至20mL，經(jīng)0.45um濾膜過濾。2.高效液相色譜參考條件：柱：YWG-C184.6mm×250mm10um不銹鋼柱；流動相：甲醇；乙酸銨溶液（0.02mol/L）（5+95）流速：1mL/min檢測器：紫外檢測器，230nm波長，0.2AUFS。3.測定取處理液和標準使用液各10uL（或相同體積）注入高效液相色譜儀進行分離，以其標準溶液峰的保留時間為依據(jù)進行定性，以其峰面積求出樣液中被測物的含量，共計算。4.結(jié)果計算試樣中糖精鈉含量按式（1）進行計算?！?（1）式中：X——試樣中糖精鈉的含量，單位為克每千克（g/kg）；A——進樣體積中糖精鈉的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；V2——進樣體積，單位為毫升（mL）；V1——試樣稀釋液總體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。5.精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對值不得超過算術(shù)平均值的10%。6.其他應(yīng)用2的高效液相分離條件可以同時測定苯甲酸、山梨酸和糖精鈉，其分離色譜圖如下圖所示：五、注意事項1、本法取樣量為10g，進樣量為10uL時檢出量為1.5ng；2、嚴格控制進樣量，操作仔細小心，注意保護儀器和自身安全；實驗八樣品中山梨酸含量的測定一、實驗?zāi)康淖寣W(xué)生掌握利用氣相色譜法測定食品中添加劑山梨酸含量的原理，熟悉食品中山梨酸含量測定的方法步驟，使學(xué)生能獨立完成食品中山梨酸含量的測定工作。二、實驗原理試樣酸化后，用乙醚提取山梨酸，用附氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀進行分離測定，與標準系列比較定量。三、試劑和器材試劑：乙醚：不含過氧化物；石油醚：沸程30℃-60℃；鹽酸；無水硫酸鈉；鹽酸（1+1）：取100mL鹽酸，加水稀釋至200mL；氯化鈉酸性溶液（40g/L）：于氯化鈉溶液（40g/L）中加少量鹽酸（1+1）酸化；山梨酸標準溶液：準確稱取山梨酸0.2000g，置于100mL容量瓶中，用石油醚-乙醚（3+1）混合溶劑溶解后稀釋至刻度。此溶液每毫升相當于2.0mg山梨酸；山梨酸標準使用液：吸取適量的山梨酸標準溶液，以石油醚-乙醚（3+1）混合溶劑稀釋至每毫升相當于50、100、150、200、25ug山梨酸或苯甲酸。儀器：氣相色譜儀：具有氫火焰離子化檢測器。四、實驗步驟1.試樣提取：稱取2.50g事先混合均勻的試樣，置于25mL帶塞量筒中，加入0.5mL鹽酸（1+1）酸化，用15mL和10mL乙醚提取兩次，每次振搖1min，將上層乙醚提取液吸入另一個25mL帶塞量筒中，合并乙醚提取液。用3mL氯化鈉酸性溶液（40g/L）洗滌兩次，靜置15min，用滴管將乙醚層通過無水硫酸鈉濾入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混勻。準確吸取5mL乙醚提取液于5mL帶塞刻度試管中，置40℃水浴上揮桿，加入2mL石油醚-乙醚（3+1）混合溶劑溶解殘渣，備用。2.色譜參考條件色譜柱：玻璃柱內(nèi)徑3mm，長2m，內(nèi)裝涂以5%DEGS+1%磷酸固定液的60目-80目ChromosorbWAW。氣流速度：載氣為氮氣，50mL/min（氮氣和空氣、氫氣之比按各儀器型號不同選擇各自的最佳比例條件）溫度：進樣口230℃；檢測器230℃；柱溫170℃；3.測定進樣2uL標準系列中各濃度標準使用液于氣相色譜儀中，可測得不同濃度山梨酸的峰高，以濃度為橫坐標，相應(yīng)的峰高值為縱坐標，繪制標準曲線。同時進樣2uL試樣溶液，測得峰高與標準曲線比較定量。4.結(jié)果計算試樣中山梨酸的含量按式（1）進行計算：……..（1）式中：X——試樣中山梨酸的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；A——測定用試樣液中山梨酸的質(zhì)量，單位為微克（ug）；V1——加入石油醚-乙醚（3+1）混合溶劑的體積，單位為毫升（mL）；V2——測定時進樣的體積，單位為微升（uL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）。5——測定時吸取乙醚提取液的體積，單位為毫升（mL）；25——試樣乙醚提取液的總體積，單位為毫升（mL）；計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。五、注意事項1、在重復(fù)條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對值不得超過算術(shù)平均值10%；2、山梨酸保留時間2min53s；3、山梨酸的氣象色譜圖如下圖所示：實驗九樣品中菌落總數(shù)的測定一、實驗?zāi)康膶W(xué)會細菌菌落總數(shù)測定的基本方法及操作技術(shù)，并正確填寫細菌菌落總數(shù)的測定報告。二、實驗原理菌落總數(shù)的測定是指食品檢樣經(jīng)過處理在一定條件下培養(yǎng)后所得的1g或1mL檢樣中所含的細菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。三、試劑和器材除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：3.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃，30℃3.2冰箱：2℃～53.3恒溫水浴箱：46℃±13.4天平：感量為0.1g。3.5均質(zhì)器。3.6振蕩器。3.7無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。3.8無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。3.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。3.10pH計或pH比色管或精密pH試紙。3.11放大鏡或/和菌落計數(shù)器。3.12平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄A中A.1。3.13磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.2。3.14無菌生理鹽水：見附錄A中A.3。四、實驗步驟菌落總數(shù)的檢驗程序見圖1。1樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。1.4按6.1.3操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2~3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。1.6及時將15mL～20mL冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃±2培養(yǎng)2.1待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品30℃±1℃2.2如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按6.2.1條件進行培養(yǎng)。3菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits，CFU）表示。3.1選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。3.2其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。3.3當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。4.結(jié)果與報告4.1菌落總數(shù)的計算方法4.1.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。4.1.2若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（1）計算：示例：稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）菌落數(shù)（CFU）232，24433，35上述數(shù)據(jù)按4.2.2數(shù)字修約后，表示為25000或2.5×104。4.1.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。4.1.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。4.1.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。4.1.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。4.2菌落總數(shù)的報告4.2.1菌落數(shù)小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。4.2.2菌落數(shù)大于或等于100CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。4.2.3若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。4.2.4若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。4.2.5稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。原始記錄本。附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1平板計數(shù)瓊脂（platecountagar，PCA）培養(yǎng)基A.1.1成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mLpH7.0±0.2A.1.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15min。A.2磷酸鹽緩沖液A.2.1成分磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水500mLpH7.2A.2.2制法貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。A.3無菌生理鹽水A.3.1成分氯化鈉8.5g蒸餾水1000mLA.3.2制法稱取8.5ｇ氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min七、思考題1、菌落總數(shù)采用的是什么培養(yǎng)基進行計數(shù)，是哪些類型的微生物在其上能生長？2、平板菌落計數(shù)法對微生物進行計數(shù)的優(yōu)缺點是什么？實驗十食品中大腸菌群的檢驗一、實驗?zāi)康牧私獯竽c菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛(wèi)生檢驗中的意義。練習并掌握大腸菌群的檢驗方法

。二、實驗原理1、大腸菌群大腸菌群系指一群在37℃、24小時能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。2、測定的意義該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數(shù)系以每1g（或mL）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN（the

most

probable

number-簡稱MPN）表示三、試劑與儀器1.培養(yǎng)基或試劑：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA)、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH)、1mol/L鹽酸（HCI)。2.儀器或其它用具：接種環(huán)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿等。四、實驗步驟第一法大腸菌群MPN計數(shù)法：1.樣品的稀釋（1）固體和半固體樣品稱取25g樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min-10000r/min均質(zhì)1min-2min，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min-2min，制成1:10的樣品勻液。（2）液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10的樣品勻液。（3）樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5-7.5之間，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L鹽酸（HCI）調(diào)節(jié)。（4）用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。（5）根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。2.初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）,36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進行復(fù)發(fā)酵試驗。3.復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從所有48h±2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB）肉湯管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h4、大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN表（見附錄B)，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。注意：當檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內(nèi)的數(shù)也應(yīng)相應(yīng)減少或增加。第二法平板計數(shù)法檢驗流程1.稀釋法：同第一法。2.平板計數(shù)（1）選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿每皿1mL。同時分別取1mL生理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照。（2）及時將15mL-20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL-4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±l℃培養(yǎng)18h-24h。（3）平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15-150之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。（4）證實試驗

從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h-48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。（5）大腸菌群平板計數(shù)的報告

經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。五、思考題1.食品中大腸菌群測定為什么要進行兩次發(fā)酵試驗？2.食品中大腸菌群的檢測實驗步驟中注意的事項有哪些？注1：本表采用3個稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個稀釋度接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用lg（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。實驗十一樣品中沙門氏菌的測定一、實驗?zāi)康牧私馍抽T氏菌的定義及食品中沙門氏菌測定在食品衛(wèi)生檢驗中的意義。練習并掌握沙門氏菌的檢驗方法

。二、設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、均質(zhì)器、振蕩器、電子天平、無菌錐形瓶（500mL\250mL）、無菌吸管、無菌培養(yǎng)皿（90mm）、無菌試管（3mm*50mm、10mm*75mm）、無菌毛細管、pH計或pH比色管或精密pH試紙、全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。緩沖蛋白胨水、四硫磺酸鈉煌綠TTB增菌液、亞希酸鹽胱氨酸增菌液、亞硫酸鉍瓊脂、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂、蛋白胨水-靛基質(zhì)試劑、尿素瓊脂、氰化鉀培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管、鄰硝基酚β-D半乳糖苷培養(yǎng)基、半固體瓊脂、丙二酸鈉培養(yǎng)基、沙門氏菌O和H診斷血清、生化鑒定試劑盒三、實驗步驟按照沙門氏菌檢驗程序進行，如圖所示：前增菌稱取25g（mL）樣品放入盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH值，用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進行培養(yǎng)，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。如為冷凍產(chǎn)品,應(yīng)在45℃以下不超過15min,或2℃～5℃不超過18h解凍。增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個平板上生長的菌落,各個平板上的菌落特征見表1。表1沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征生化試驗4.1自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表2。表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果4.2接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時,可直接接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結(jié)果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，必要時可延長至48h，按表3判定結(jié)果。將已挑菌落的平板儲存于2℃～5℃或室溫至少保留24h，以備必要時復(fù)查。表3沙門氏菌屬生化反應(yīng)初步鑒別表4.2.2反應(yīng)序號A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項試驗結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進行判定。4.2.3反應(yīng)序號A3：補做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫羧酶陽性,甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。4.2.4必要時按表5進行沙門氏菌生化群的鑒別。表5沙門氏菌屬各生化群的鑒別4.3如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)5.4.1的初步判斷結(jié)果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳乙?，使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。5血清學(xué)鑒定5.1抗原的準備一般采用1.2％～1.5％瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2％～3％）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.55％～0.65％半固體瓊脂平板的中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0.3％～0.4％半固體瓊脂的小玻管1次～2次，自遠端取菌培養(yǎng)后再檢查。5.2多價菌體抗原（O）鑒定在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區(qū)域，挑取1環(huán)待測菌，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體（O）抗血清，在另一區(qū)域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內(nèi)的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1min，并對著黑暗背景進行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應(yīng)。5.3多價鞭毛抗原（H）鑒定同5.5.2。5.4血清學(xué)分型（選做項目）5.4.1O抗原的鑒定用A～F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。被A～F多價O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集試驗。根據(jù)試驗結(jié)果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19單因子血清做凝集試驗，判定E1、E2、E3、E4各亞群，每一個O抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)O單因子血清的檢查結(jié)果，沒有O單因子血清的要用兩個O復(fù)合因子血清進行核對。不被A～F多價O血清凝集者，先用9種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。每種多價O血清所包括的O因子如下：O多價1A，B，C，D，E，F(xiàn)，群（并包括6,14群）O多價213，16，17，18，21群O多價328，30，35，38，39群O多價440，41，42，43群O多價544，45，47，48群O多價650，51，52，53群O多價755，56，57，58群O多價859，60，61，62群O多價963，65，66，67群5.4.2H抗原的鑒定屬于A～F各O群的常見菌型，依次用表6所述H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。表6A～F群常見菌型H抗原表不常見的菌型，先用8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以第1相和第2項的H抗原。8種多價H血清所包括的H因子如下：H多價1a，b，c，d，iH多價2eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51H多價3k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40H多價41,2；1,5；1,6；1,7；z6H多價5z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38H多價6z39，z41，z42，z44H多價7z52，z53，z54，z55H多價8z56，z57，z60，z61，z62每一個H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單因子血清的要用兩個H復(fù)合因子血清進行核對。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的,可在瓊脂斜面上移種1～2代后再檢查。如仍只檢出一個相的H抗原，要用位相變異的方法檢查其另一個相。單相菌不必做位相變異檢查。位相變異試驗方法如下：小玻管法：將半固體管（每管約1mL～2mL）在酒精燈上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05mL～0.1mL，加入于溶化的半固體內(nèi)，混勻后，用毛細吸管吸取分裝于供位相變異試驗的小玻管內(nèi)，俟凝固后，用接種針挑取待檢菌，接種于一端。將小玻管平放在平皿內(nèi)，并在其旁放一團濕棉花，以防瓊脂中水分蒸發(fā)而干縮，每天檢查結(jié)果，待另一相細菌解離后，可以從另一端挑取細菌進行檢查。培養(yǎng)基內(nèi)血清的濃度應(yīng)有適當?shù)谋壤^高時細菌不能生長，過低時同一相細菌的動力不能抑制。一般按原血清1：200～1：800的量加入。小倒管法：將兩端開口的小玻管（下端開口要留一個缺口，不要平齊）放在半固體管內(nèi),小玻管的上端應(yīng)高出于培養(yǎng)基的表面，滅菌后備用。臨用時在酒精燈上加熱溶化，冷至50℃，挑取因子血清1環(huán)，加入小套管中的半固體內(nèi)，略加攪動，使其混勻，俟凝固后，將待檢菌株接種于小套管中的半固體表層內(nèi)，每天檢查結(jié)果，待另一相細菌解離后，可從套管外的半固體表面取菌檢查，或轉(zhuǎn)種1％軟瓊脂斜面，于37℃培養(yǎng)后再做凝集試驗。簡易平板法：將0.35％～0.4％半固體瓊脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1環(huán)，滴在半固體平板表面，放置片刻，待血清吸收到瓊脂內(nèi)，在血清部位的中央點種待檢菌株，培養(yǎng)后，在形成蔓延生長的菌苔邊緣取菌檢查。5.4.3Vi抗原的鑒定用Vi因子血清檢查。已知具有Vi抗原的菌型有：傷寒沙門氏菌，丙型副傷寒沙門氏菌,都柏林沙門氏菌。5.4.4菌型的判定根據(jù)血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果，按照附錄B（GB4789.4-2010）或有關(guān)沙門氏菌屬抗原表判定菌型。6結(jié)果與報告綜合以上生化試驗和血清學(xué)鑒定的結(jié)果，報告25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。附錄A（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑A.1緩沖蛋白胨水（BPW）A.1.1成分蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、磷酸氫二鈉（含12個結(jié)晶水）9.0g、磷酸二氫鉀1.5g、蒸餾水1000mL、pH7.2±0.2A.1.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10min，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，高壓滅菌121℃，15min。A.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液A.2.1基礎(chǔ)液蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化鈉3.0g、碳酸鈣45.0g、蒸餾水1000mL、pH7.0±0.2除碳酸鈣外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，再加入碳酸鈣，調(diào)節(jié)pH，高壓滅菌121℃，20min。A.2.2硫代硫酸鈉溶液硫代硫酸鈉（含5個結(jié)晶水）50.0g、蒸餾水加至100mL、高壓滅菌121℃，20min。A.2.3碘溶液碘片20.0g、碘化鉀25.0g、蒸餾水加至100mL、將碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中，再投入碘片，振搖玻瓶至碘片全部溶解為止，然后加蒸餾水至規(guī)定的總量，貯存于棕色瓶內(nèi)，塞緊瓶蓋備用。A.2.40.5％煌綠水溶液煌綠0.5g、蒸餾水100mL溶解后，存放暗處，不少于1d，使其自然滅菌。A.2.5牛膽鹽溶液牛膽鹽10.0g、蒸餾水100mL加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121℃，20min。A.2.6制法基礎(chǔ)液900mL、硫代硫酸鈉溶液100mL、碘溶液20.0mL、煌綠水溶液2.0mL牛膽鹽溶液50.0mL臨用前，按上列順序，以無菌操作依次加入基礎(chǔ)液中，每加入一種成分，均應(yīng)搖勻后再加入另一種成分。A.3亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液A.3.1成分蛋白胨5.0g、乳糖4.0g、磷酸氫二鈉10.0g、亞硒酸氫鈉4.0g、L-胱氨酸0.01g蒸餾水1000mL、pH7.0±0.2A.3.2制法除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，冷至55℃以下，以無菌操作加入亞硒酸氫鈉和1g/LL-胱氨酸溶液10mL（稱取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氫氧化鈉溶液15mL，使溶解，再加無菌蒸餾水至100mL即成，如為DL-胱氨酸，用量應(yīng)加倍）。搖勻，調(diào)節(jié)pH。A.4亞硫酸鉍（BS）瓊脂A.4.1成分蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、葡萄糖5.0g、硫酸亞鐵0.3g、磷酸氫二鈉4.0g、煌綠0.025g或5.0g／L水溶液5.0mL、檸檬酸鉍銨2.0g、亞硫酸鈉6.0g、瓊脂18.0g～20g蒸餾水1000mL、pH7.5±0.2A.4.2制法將前三種成分加入300mL蒸餾水（制作基礎(chǔ)液），硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入20mL和30mL蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20mL和30mL蒸餾水中，瓊脂加入600mL蒸餾水中。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。冷至80℃左右時，先將硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，混勻。將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎(chǔ)液中，再混勻。調(diào)節(jié)pH，隨即傾入瓊脂液中，混合均勻，冷至50℃～55℃。加入煌綠溶液，充分混勻后立即傾注平皿。注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性，貯于室溫暗處，超過48h會降低其選擇性，本培養(yǎng)基宜于當天制備，第二天使用。A.5HE瓊脂（HektoenEntericAgar）A.5.1成分蛋白胨12.0g、牛肉膏3.0g、乳糖12.0g、蔗糖12.0g、水楊素2.0g、膽鹽20.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂18.0g～20.0g、蒸餾水1000mL、0.4％溴麝香草酚藍溶液16.0mL、Andrade指示劑20.0mL、甲液20.0mL、乙液20.0mL、pH7.5±0.2A.5.2制法將前面七種成分溶解于400mL蒸餾水內(nèi)作為基礎(chǔ)液;將瓊脂加入于600mL蒸餾水內(nèi)。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基礎(chǔ)液內(nèi),調(diào)節(jié)pH。再加入指示劑,并與瓊脂液合并,待冷至50℃～55℃傾注平皿。注:①本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性。②甲液的配制硫代硫酸鈉34.0g、檸檬酸鐵銨4.0g、蒸餾水100mL③乙液的配制去氧膽酸鈉10.0g、蒸餾水100mL④Andrade指示劑酸性復(fù)紅0.5g、1mol/L氫氧化鈉溶液16.0mL、蒸餾水100mL將復(fù)紅溶解于蒸餾水中,加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時后如復(fù)紅褪色不全,再加氫氧化鈉溶液1mL～2mL。A.6木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂A.6.1成分酵母膏3.0g、L-賴氨酸5.0g、木糖3.75g、乳糖7.5g、蔗糖7.5g、去氧膽酸鈉2.5g、檸檬酸鐵銨0.8g、硫代硫酸鈉6.8g、氯化鈉5.0g、瓊脂15.0g、酚紅0.08g、蒸餾水1000mL、pH7.4±0.2A.6.2制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，待冷至50℃～55℃傾注平皿。注:本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性，貯于室溫暗處。本培養(yǎng)基宜于當天制備，第二天使用。A.7三糖鐵（TSI）瓊脂A.7.1成分蛋白胨20.0g、牛肉膏5.0g、乳糖10.0g、蔗糖10.0g、葡萄糖1.0g、硫酸亞鐵銨（含6個結(jié)晶水）0.2g、酚紅0.025g或5.0g/L溶液5.0mL、氯化鈉5.0g、硫代硫酸鈉0.2g瓊脂12.0g、蒸餾水1000mL、pH7.4±0.2A.7.2制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，混勻，分裝試管，每管約2mL～4mL，高壓滅菌121℃10min或115℃15min，滅菌后置成高層斜面，呈桔紅色。A.8蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑A.8.1蛋白胨水蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g、氯化鈉5.0g、蒸餾水1000mL、pH7.4±0.2將上述成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝小試管,121℃高壓滅菌15min。A.8.2靛基質(zhì)試劑A.8.2.1柯凡克試劑：將5g對二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后緩慢加入濃鹽酸25mL。A.8.2.2歐-波試劑：將1g對二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95％乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸20mL。A.8.3試驗方法挑取小量培養(yǎng)物接種,在36℃±1℃培養(yǎng)1d～2d，必要時可培養(yǎng)4d～5d。加入柯凡克試劑約0.5mL，輕搖試管,陽性者于試劑層呈深紅色；或加入歐-波試劑約0.5mL，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面,陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。注：蛋白胨中應(yīng)含有豐富的色氯酸。每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。A.9尿素瓊脂（pH7.2）A.9.1成分蛋白胨1.0g、氯化鈉5.0g、葡萄糖1.0g、磷酸二氫鉀2.0g、0.4％酚紅3.0mL、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL、20%尿素溶液100mL、pH7.2±0.2A.9.2制法除尿素、瓊脂和酚紅外，將其他成分加入400mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。另將瓊脂加入600mL蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑后分裝，121℃高壓滅菌15min。冷至50℃～55℃,加入經(jīng)除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2％。分裝于無菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆?。A.9.3試驗方法挑取瓊脂培養(yǎng)物接種,在36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。尿素酶陽性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。A.10氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基A.10.1成分蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、磷酸二氫鉀0.225g、磷酸氫二鈉5.64g、蒸餾水1000mL0.5％氰化鉀20.0mLA.10.2制法將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，分裝后121℃高壓滅菌15min。放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻。每100mL培養(yǎng)基加入0.5％氰化鉀溶液2.0mL（最后濃度為1:10000），分裝于無菌試管內(nèi),每管約4mL,立刻用無菌橡皮塞塞緊,放在4℃冰箱內(nèi),至少可保存兩個月。同時，將不加氰化鉀的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基,分裝試管備用。A.10.3試驗方法將瓊脂培養(yǎng)物接種于蛋白胨水內(nèi)成為稀釋菌液，挑取1環(huán)接種于氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基。并另挑取1環(huán)接種于對照培養(yǎng)基。在36℃±1℃培養(yǎng)1d～2d，觀察結(jié)果。如有細菌生長即為陽性（不抑制），經(jīng)2d細菌不生長為陰性（抑制）。注:氰化鉀是劇毒藥,使用時應(yīng)小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應(yīng)在冰箱內(nèi)進行。試驗失敗的主要原因是封口不嚴,氰化鉀逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長，因而造成假陽性反應(yīng)。試驗時對每一環(huán)節(jié)都要特別注意。A.11賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基A.11.1成分蛋白胨5.0g、酵母浸膏3.0g、葡萄糖1.0g、蒸餾水1000mL、1.6％溴甲酚紫-乙醇溶液1.0mL、L-賴氨酸或DL-賴氨酸0.5g/100mL或1.0g/100mL、pH6.8±0.2A.11.2制法除賴氨酸以外的成分加熱溶解后,分裝每瓶100mL，分別加入賴氨酸。L-賴氨酸按0.5％加入，DL-賴氨酸按1％加入。調(diào)節(jié)pH。對照培養(yǎng)基不加賴氨酸。分裝于無菌的小試管內(nèi)，每管0.5mL，上面滴加一層液體石蠟，115℃高壓滅菌10min。A.11.3試驗方法從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。氨基酸脫羧酶陽性者由于產(chǎn)堿，培養(yǎng)基應(yīng)呈紫色。陰性者無堿性產(chǎn)物，但因葡萄糖產(chǎn)酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對照管應(yīng)為黃色。A.12糖發(fā)酵管A.12.1成分牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉3.0g、磷酸氫二鈉（含12個結(jié)晶水）2.0g、0.2％溴麝香草酚藍溶液12.0mL、蒸餾水1000mL、pH7.4±0.2A.12.2制法A.12.2.1葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，調(diào)節(jié)pH。按0.5％加入葡萄糖，分裝于有一個倒置小管的小試管內(nèi)，121℃高壓滅菌15min。A.12.2.2其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后,分裝每瓶100mL，121℃高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好10％溶液，同時高壓滅菌。將5mL糖溶液加入于100mL培養(yǎng)基內(nèi)，以無菌操作分裝小試管。注：蔗糖不純,加熱后會自行水解者，應(yīng)采用過濾法除菌。A.12.3試驗方法:從瓊脂斜面上挑取小量培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng),一般2d～3d。遲緩反應(yīng)需觀察14d～30d。A.13ONPG培養(yǎng)基A.13.1成分鄰硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）、（O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）60.0mg、0.01mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5）10.0mL、1％蛋白胨水（pH7.5）30.0mLA.13.2制法將ONPG溶于緩沖液內(nèi)，加入蛋白胨水，以過濾法除菌，分裝于無菌的小試管內(nèi)，每管0.5mL，用橡皮塞塞緊。A.13.3試驗方法自瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物1滿環(huán)接種于36℃±1℃培養(yǎng)1h～3h和24h觀察結(jié)果。如果β-半乳糖苷酶產(chǎn)生，則于1h～3h變黃色，如無此酶則24h不變色。A.14半固體瓊脂A.14.1成分牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化鈉0.5g、瓊脂0.35g～0.4g、蒸餾水100mL、pH7.4±0.2A.14.2制法按以上成分配好,煮沸溶解,調(diào)節(jié)pH。分裝小試管。121℃高壓滅菌15min。直立凝固備用。注:供動力觀察、菌種保存、H抗原位相變異試驗等用。A.15丙二酸鈉培養(yǎng)基A.15.1成分酵母浸膏1.0g、硫酸銨2.0g、磷酸氫二鉀0.6g、磷酸二氫鉀0.4g、氯化鈉2.0g、丙二酸鈉3.0g、0.2％溴麝香草酚藍溶液12.0mL、蒸餾水1000mL、pH6.8±0.2A.15.2制法除指示劑以外的成分溶解于水，調(diào)節(jié)pH，再加入指示劑，分裝試管，121℃高壓滅菌15min。A.15.3試驗方法用新鮮的瓊脂培養(yǎng)物接種，于36℃±1℃培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。陽性者由綠色變?yōu)樗{色。實驗十二樣品中志賀氏菌的測定一、實驗?zāi)康牧私庵举R氏菌的定義及食品中沙門氏菌測定在食品衛(wèi)生檢驗中的意義。練習并掌握志賀氏菌的檢驗方法

。二、試劑和器材除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃；2.2冰箱：2℃～5℃；2.3膜過濾系統(tǒng)；2.4厭氧培養(yǎng)裝置：41.5℃1℃；2.5電子天平：感量0.1g；2.6顯微鏡：10×～