基因功能的基本策略課件

第十二章基因功能分析的基本策略轉(zhuǎn)基因模型是研究基因功能的主要手段轉(zhuǎn)基因生物：外源基因?qū)肷矬w表達(dá)。基因打靶：外源基因替換內(nèi)源基因?；蚯贸；蚯萌??；虺聊簩?dǎo)入特定基因，抑制內(nèi)源性基因表達(dá)。第一節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenictechnology)：將外源基因?qū)爰?xì)胞，隨機(jī)整合到受體基因組內(nèi)，并隨細(xì)胞分裂而遺傳給后代。細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因植物。一.轉(zhuǎn)基因生物的意義20世紀(jì)80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)，金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)大鼠生長激素基因表達(dá)。轉(zhuǎn)基因生物的用途：研究手段：疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。改良動(dòng)物性狀：抗病性、耐寒性等。生產(chǎn)產(chǎn)品：抗體、疫苗等的生產(chǎn)。二、基本原理構(gòu)建攜帶目的基因的載體。外源基因?qū)耄簩⒛康幕蛲ㄟ^顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中。使目的基因整合到基因組中。將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動(dòng)物的輸卵管或子宮中。使其發(fā)育成攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。基本原理供體基因受體的受精卵基本原理轉(zhuǎn)基因的受精卵基本原理轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基本過程上游—基因改造和載體構(gòu)建中游—基因轉(zhuǎn)移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達(dá)的檢測與細(xì)胞篩選1.上上游游——基基因因改改造造和和載載體體構(gòu)構(gòu)建建外源源基基因因:完完整整的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄單單位位,由由順順式式作作用用元元件件、、結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)基基因因和和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄終終止止信信號號組組成成。。報(bào)告告基基因因(reportergene):在在表表達(dá)達(dá)載載體體中中引引入入易易于于檢檢測測的的提提示示重重組組體體存存在在的的基基因因。。GFP、、LacZ、、AP、、LUC。。融合合基基因因(fusiongene):將將特特定定的的目目的的基基因因與與報(bào)報(bào)告告基基因因拼拼接接成成融融合合基基因因，，并并與與順順式式作作用用元元件件拼拼接接成成完完整整的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄單單位位。。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因常常用的載體腺病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載載體非病毒類載體體：如質(zhì)粒等等。2.中游游—基因轉(zhuǎn)移移、胚胎移植植與建系基因?qū)爰夹g(shù)術(shù)：物理、化化學(xué)和生物學(xué)學(xué)方法1)顯微注注射法（microinjection)2)胚胎干干細(xì)胞法（embryonicstemcells,ES細(xì)胞胞）3)逆轉(zhuǎn)錄錄病毒感染法法4)精子載載體法1)DNA顯微注射射法制備超量受精精卵。DNA顯微微注射。轉(zhuǎn)移注射卵到到輸卵管或子子宮。轉(zhuǎn)基因鼠的鑒鑒定及鼠系建建立。DNA顯微微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核DNA顯微微注射DNA顯微微注射到尚未未發(fā)生核融合合的受精卵的的精原核。顯顯微鏡下觀察察，精原核比比卵原核大，，容易辨別。。線性DNA整合效率率比超螺旋DNA高高出數(shù)倍，因因而用于顯微微注射的轉(zhuǎn)入入基因通常是是去除載體序序列的線狀DNA。DNA顯微微注射法的特特點(diǎn)DNA大小小無限制，最最大可達(dá)250Kb。。隨機(jī)整合：在在染色體上整整合的位點(diǎn)是是隨機(jī)的，整整合的拷貝數(shù)數(shù)也不一定。。轉(zhuǎn)入的基基因有可可能碰巧巧整合到到具有重重要功能能的基因因之中，，干擾該該基因的的正常表表達(dá)，影影響轉(zhuǎn)基基因動(dòng)物物的正常常發(fā)育和和代謝。?？傂瘦^較低(實(shí)實(shí)際成功功率1/1000)。。提高顯微微注射DNA表達(dá)達(dá)的成功功率轉(zhuǎn)入的外外源基因因要能夠夠高效表表達(dá)，最最好是可可以誘導(dǎo)導(dǎo)表達(dá)。。轉(zhuǎn)入基因因中應(yīng)該該包含有有幫助提提高整合合效率的的序列，，如微衛(wèi)衛(wèi)星序列列。微衛(wèi)星序序列微衛(wèi)星序序列誘導(dǎo)表達(dá)達(dá)啟動(dòng)子子外源基因因2)胚胚胎干細(xì)細(xì)胞法胚胎干細(xì)細(xì)胞(embryostemcells,ES細(xì)細(xì)胞)：可人工培培養(yǎng)增殖殖的小鼠鼠胚泡發(fā)發(fā)育期胚胚胎細(xì)胞胞，當(dāng)把把這種胚胚胎細(xì)胞胞重新導(dǎo)導(dǎo)入另一一胚泡期期的胚胎胎之后，，它仍然然保持著著分化成成其他類類型細(xì)胞胞的能力力。ES細(xì)細(xì)胞具有有與胚胎胎細(xì)胞相相似的形形態(tài)特征征和分化化特性。。胚胎干細(xì)細(xì)胞法分離和培培養(yǎng)ES細(xì)細(xì)胞。外源基因因?qū)隕S細(xì)細(xì)胞。。導(dǎo)入外源源基因的的ES細(xì)胞胞的子宮宮轉(zhuǎn)移。。轉(zhuǎn)基因鼠鼠的鑒定定及鼠系系建立。。胚胎干細(xì)細(xì)胞的分分離和培培養(yǎng)胚泡培養(yǎng)皿中中分離胚胚泡內(nèi)層層細(xì)胞胰蛋白酶酶消化解解離加飼養(yǎng)層層細(xì)胞培培養(yǎng)胚胎干細(xì)細(xì)胞胚胎干細(xì)細(xì)胞的分分離和培培養(yǎng)胚胎干細(xì)細(xì)胞外源源DNA的的導(dǎo)入DNA胚胎干細(xì)細(xì)胞囊胚原原囊胚胚轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因動(dòng)物磷酸鈣-DNA共沉沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病病毒感染染法電穿孔法法微注射外源DNA的的整合合用于ES細(xì)細(xì)胞的DNA載體體一般帶帶有定點(diǎn)點(diǎn)整合元元件,避避免了了隨機(jī)整整合。定點(diǎn)整合合位點(diǎn)應(yīng)應(yīng)選擇在在基因組組內(nèi)編碼碼非必需需產(chǎn)物的的地方，，以減少少整合對對細(xì)胞正正常功能能的影響響。定點(diǎn)整合合位點(diǎn)必必須在基基因組的的可以進(jìn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄錄的地方方。胚胎干細(xì)細(xì)胞法的的特點(diǎn)定點(diǎn)整合合。ES細(xì)細(xì)胞胞在在體體外外培培養(yǎng)養(yǎng)，，外外源源DNA導(dǎo)導(dǎo)入入后后可可用用正正-負(fù)負(fù)選選擇擇法法篩篩選選擇擇正正確確整整合合的的ES細(xì)細(xì)胞胞,相相對對較較簡簡單單。。目前前只只在在小小鼠鼠身身上上獲獲得得成成功功。3））逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄病病毒毒感感染染法法逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄病病毒毒載載體體的的構(gòu)構(gòu)建建獲得得四四/八八細(xì)細(xì)胞胞胚胚胎胎/囊囊胚胚/原原腸腸胚胚外源源DNA導(dǎo)導(dǎo)入入早早期期胚胚胎胎：：獲得得病病毒毒顆顆粒粒感感染染早早期期胚胚胎胎包裝裝細(xì)細(xì)胞胞與與早早期期胚胚胎胎共共培培養(yǎng)養(yǎng)感染染后后的的胚胚胎胎植植入入受受體體動(dòng)動(dòng)物物子子宮宮，，發(fā)發(fā)育育成成攜攜帶帶外外源源基基因因的的動(dòng)動(dòng)物物。。逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄病病毒毒感感染染法法外源源基基因因逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄病病毒毒載載體體逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄病病毒毒感感染染四/八八細(xì)細(xì)胞胞胚胚胎胎/囊囊胚胚/原原腸腸胚胚嵌合合小小鼠鼠純合體小鼠鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒毒感染法的的特點(diǎn)通過病毒DNA插插入宿主主DNA的機(jī)制制，將外源源目的基因因整合到宿宿主基因組組，整合效效率高。反轉(zhuǎn)錄病毒毒載體容量量有限，只只能轉(zhuǎn)移小小片段DNA(＜10kb)。對家禽類的的轉(zhuǎn)基因研研究有重要要意義。4）精子載載體法外源DNA精子卵卵細(xì)胞受受精卵轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因動(dòng)物共育法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染染法電穿孔法DNA精子受精卵DNA卵細(xì)胞DNA胚胎干細(xì)胞DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法電穿孔法四細(xì)胞胚胎囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動(dòng)物微注射顯微注射3.下游—基因因整合與表表達(dá)檢測及及篩選染色體基因因水平：是是否整合了了外源基因因以及整合合的位點(diǎn)和和拷貝數(shù)。。轉(zhuǎn)錄水平：：轉(zhuǎn)基因的的mRNA的存存在與否以以及表達(dá)水水平。蛋白水平：：轉(zhuǎn)基因的的蛋白質(zhì)的的表達(dá)以及及功能檢測測。鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot基因轉(zhuǎn)移鼠鼠純合鼠系系的建立×轉(zhuǎn)基因雜合鼠未轉(zhuǎn)基因鼠生殖系細(xì)胞中不含轉(zhuǎn)入基因生殖系細(xì)胞中含轉(zhuǎn)入基因子代多次交配可得到純合轉(zhuǎn)基因鼠系三、轉(zhuǎn)基因因動(dòng)物的應(yīng)應(yīng)用分析動(dòng)物表表型與外源源基因的關(guān)關(guān)系，揭示示外源基因因的功能。。建立人類疾疾病的轉(zhuǎn)基基因動(dòng)物模模型?；虍a(chǎn)品的的制備：乳乳腺、膀胱胱生物反應(yīng)應(yīng)器。人類疾病的的轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物模型完整的動(dòng)物物模型可以以模擬人類類疾病的起起始和發(fā)展展，幫助了了解疾病的的病因和發(fā)發(fā)展過程。。為測試各種種可能的治治療方案提提供一個(gè)統(tǒng)統(tǒng)一有效的的系統(tǒng)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物物模型提供供了人類疾疾病的研究究手段。人類疾病的的轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物模型各種人類遺遺傳病的鼠鼠模型，如如：老年性癡呆呆癥(Alzheimer’’sdisease)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、肌肉營養(yǎng)缺缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)退行性性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內(nèi)分泌功能能障礙(endocrinologicaldisfunction)、、動(dòng)脈硬化化癥及其其他很多多疾病。。利用轉(zhuǎn)基基因動(dòng)物物反應(yīng)器器生產(chǎn)藥藥用蛋白白轉(zhuǎn)基因動(dòng)動(dòng)物反應(yīng)應(yīng)器：乳乳腺、膀膀胱、血血液生物物反應(yīng)器器等?？鼓该窱II：轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因綿綿羊的乳乳汁中。。β乳球蛋白白紅細(xì)胞生成成素凝血因子VIII凝血因子IX生長激素轉(zhuǎn)基因改良良移植器官官改造異種來來源器官的的遺傳性狀狀，使之適適應(yīng)于人體體器官或組組織的移植植。1997年年起，利利用遺傳改改良的轉(zhuǎn)基基因豬肝做做為嚴(yán)重肝肝病患者的的離體生命命支持物。。動(dòng)物的克隆隆1996年年，首次次實(shí)現(xiàn)動(dòng)物物的無性生生殖。由綿羊的乳乳腺細(xì)胞提提供細(xì)胞核核，卵細(xì)胞胞提供細(xì)胞胞質(zhì)發(fā)育而而來。核移植技術(shù)術(shù)（NuclearTransfer)核移植技術(shù)術(shù)（NuclearTransfer)第二節(jié)基基因打靶靶基因打靶(GeneTargeting)：通過DNA定定點(diǎn)同源重重組，改變變基因組中中的某一特特定基因，，在生物活活體內(nèi)研究究此基因的的功能?；蚯贸?geneknockout):將將某個(gè)基基因定向去去除?；蚯萌?geneknockin):定定向?qū)⒁欢味位蛐蛄辛刑娲硪灰欢位蛐蛐蛄?。一、基因打打靶的基本本程序打靶載體的的構(gòu)建。打靶載體導(dǎo)導(dǎo)入ES細(xì)胞及及其鑒定。?；蚯贸鼸S細(xì)細(xì)胞注射入入胚泡。胚泡植入假假孕小鼠的的子宮。嵌合體的雜雜交建立基基因打靶的的純合鼠系系。1.打靶載體的的構(gòu)建同源基因片片段質(zhì)粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因2.打靶靶載體導(dǎo)入入ES細(xì)胞胞磷酸鈣-DNA共共沉淀法逆轉(zhuǎn)錄病毒毒感染法電穿孔法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染染法顯微注射法法打靶載體的的正-負(fù)選選擇與整合位點(diǎn)點(diǎn)兩端區(qū)域域同源的兩兩段DNA序列列(HB1和HB2)。目的基因。。編碼抗G418的的新霉素素磷酸轉(zhuǎn)移移酶基因（（neor基因）。。2個(gè)不同同的胸苷苷激酶基基因（HSV-tk1和HSV-tk2）），分別別來自I型II型單單純皰疹疹病毒。。打靶載體體的正篩篩選

tk1HB1neorHB2tk2載體載體同源重組組neorG418正篩選選，細(xì)胞胞存活染色體染色體打靶載體體的負(fù)篩篩選

tk1HB1neorHB2tk2染色體染色體非特異性性整合GCV負(fù)負(fù)篩選，，細(xì)胞死死亡PCR鑒鑒定在打靶載載體的HB1和HB2之間間，加上上一個(gè)載載體和鼠鼠的基因因組中都都沒有的的獨(dú)特DNA序序列（（US））。如發(fā)生隨隨機(jī)整合合，PCR無無法擴(kuò)增增出預(yù)期期的DNA片片段。如果整合合于特定定位點(diǎn)時(shí)時(shí)，則PCR可以以擴(kuò)增出出預(yù)期大大小的片片段。PCR鑒鑒定：：特異異整合合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反應(yīng)應(yīng)有特特異條條帶特異整整合基因敲敲除小小鼠的的獲得得基因敲敲除ES細(xì)細(xì)胞注注射入入胚泡泡胚泡植植入假假孕小小鼠的的子宮宮嵌合體的雜交交育種：同源源重組只發(fā)生生在一條染色色體上，因而而同源重組后后只能得到嵌嵌合體，將嵌嵌合體雜交，，即可得到純純合子?！粱蚯贸蚏NA干干擾基因敲除是在在基因水平將將某個(gè)基因定定點(diǎn)去除，動(dòng)動(dòng)物整體水平平。RNA干擾擾不是敲除基基因，而是誘誘導(dǎo)RNA的特異性性降解，干擾擾基因的表達(dá)達(dá)。一般是在在細(xì)胞水平。。第三節(jié)RNA干擾1990年年，Jorgense等等通過轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因改造牽牽?；伾?。外源基因不但但不能加深花花的顏色，反反而造成內(nèi)源源基因表達(dá)的的降低。RNA干擾擾是dsRNA導(dǎo)致的的基因沉默1998年年，F(xiàn)ire等在C.elegans中用antisenseRNA抑抑制基因表達(dá)達(dá)。dsRNA比sense或antisenseRNA都都好。注射甚至口服服dsRNA都能誘誘發(fā)基因沉默默。很少量的雙鏈鏈RNA就就能誘發(fā)C.elegans整體的基基因沉默，甚甚至能傳遞到到子一代。RNA干擾擾：RNAinterference(RNAi)RNAi是是真核生物中中廣泛存在的的現(xiàn)象植物：干擾因因素自葉脈向向外擴(kuò)散，綠綠色熒光蛋白白(GFP)基因被抑制，顯露露出紅色。線蟲：左側(cè)為為GFP轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因線蟲蟲；右側(cè)線蟲蟲則經(jīng)GFPdsRNA處理。部分細(xì)細(xì)胞RNAi相關(guān)蛋蛋白表達(dá)較低低，仍有綠色色熒光。Hela細(xì)細(xì)胞：經(jīng)ORC6siRNA作作用后，細(xì)細(xì)胞出現(xiàn)多核核現(xiàn)象。綠色為tubulin，紅色為DNA。ORC6細(xì)胞分分裂調(diào)控蛋白白。果蠅：右側(cè)果果蠅為野生型型，左側(cè)為shRNA造成的色素缺缺乏的缺陷型。RNA干擾擾RNA干擾擾：雙鏈RNA誘導(dǎo)的的同源mRNA降解解。RNA干擾擾技術(shù)可以用用于基因敲除除，選擇性關(guān)關(guān)閉特定細(xì)胞胞基因。siRNA的的產(chǎn)生Dicer：：RNaseIII的的一種，可可降解dsRNA成成siRNA。ShortinterferingRNA(siRNA)：21~23ntsiRNA誘導(dǎo)同同源序列的的降解RNA-InducedSilencingComplex產(chǎn)生兩種后后果：同源mRNA的的降解。同源mRNA翻翻譯受阻。。基因沉默的的機(jī)制是多多方面的dsRNA造成的的mRNA降解解。Post-translationalgenesilencingdsRNA造成同同源性基因因的甲基化化和表達(dá)關(guān)關(guān)閉。dsRNA造成染染色質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)變化。dsRNA對蛋白白質(zhì)的合成成產(chǎn)生影響響。RNAi和和基因敲敲除在基因組DNA上上，通過過同源重組組進(jìn)行的基基因敲除。。在mRNA水平平進(jìn)行的基基因敲除：：AntisenseoligonucleotidesRibozymeRNAinterference：：dsRNA；siRNA；；shRNAdsRNA能夠誘誘發(fā)細(xì)胞的的抗病毒反反應(yīng)在哺乳動(dòng)物物存在干擾擾素相關(guān)的的抗病毒體體系。dsRNA激活dsRNA-dependentproteinkinase(PKR)，進(jìn)一步步誘導(dǎo)非序序列依賴的的內(nèi)源性RNA降降解。在胚胎期細(xì)細(xì)胞，上述述非特異的的抗病毒體體系尚未形形成。通過過dsRNA可可以誘導(dǎo)序序列特異的的RNAi。siRNA與shRNA<30bpsiRNA可可以誘導(dǎo)導(dǎo)RNAi，并克克服哺乳細(xì)細(xì)胞的障礙礙。ShorthairpinRNA：(shRNA)可達(dá)成穩(wěn)定定的基因敲敲除。shRNA表達(dá)載載體系統(tǒng)miRNA表達(dá)載載體系統(tǒng)siRNA設(shè)計(jì)原原則siRNAantisense鏈鏈5’端端穩(wěn)定性性較低時(shí)具具有更好的的效率。必要時(shí)采用專業(yè)軟軟件進(jìn)行設(shè)設(shè)計(jì)。采用多個(gè)siRNA片段段，并篩選其其中最有效效的。有時(shí)siRNA的的干擾效效果只表現(xiàn)現(xiàn)在蛋白水水平。盡可能使用用較低的siRNA濃度度，以保證證其特異性性。設(shè)立補(bǔ)救試試驗(yàn)可進(jìn)一一步確認(rèn)RNAi與效果果之間的關(guān)關(guān)系。shRNA與siRNA應(yīng)用的的局限在某些細(xì)胞胞的特定狀狀態(tài)下，shRNA或siRNA仍能夠夠誘發(fā)細(xì)胞胞的抗病毒毒反應(yīng)。miRNA在與其其靶基因mRNA不完全全匹配的情情況下仍能能夠誘發(fā)RNAi。在有14bp匹匹配的情況況下就能夠夠誘發(fā)干擾擾。siRNA可在翻翻譯水平發(fā)發(fā)揮作用，，有研究發(fā)發(fā)現(xiàn)，它能能夠造成大大量蛋白翻翻譯的降低低。shRNA與siRNA的比較較siRNA應(yīng)用非常常方便，，干擾效效力往往往比較高高。只能進(jìn)行行達(dá)成瞬時(shí)的基因表表達(dá)抑制制。在線蟲和和植物，，siRNA可可擴(kuò)增增，但哺哺乳細(xì)胞胞不能。。shRNA前期工作作比較復(fù)復(fù)雜?？梢赃M(jìn)行行穩(wěn)定的基因表表達(dá)抑制制。9、靜夜四無鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。12月-2212月-22Friday,December23,202210、雨中黃葉樹樹，燈下白頭頭人。。05:53:0505:53:0505:5312/23/20225:53:05AM11、以我獨(dú)沈久久，愧君相見見頻。。12月-2205:53:0505:53Dec-2223-Dec-2212、故人江江海別，，幾度隔隔山川。。。05:53:0505:53:0505:53Friday,December23,202213、乍見翻翻疑夢，，相悲各各問年。。。12月月-2212月月-2205:53:0505:53:05December23,202214、他鄉(xiāng)生生白發(fā)，，舊國見見青山。。。23十十二月20225:53:05上午午05:53:0512月-2215、比不了得就就不比，得不不到的就不要要。。。十二月225:53上上午12月-2205:53December23,202216、行動(dòng)出成成果，工作作出財(cái)富。。。2022/12/235:53:0505:53:0523December202217、做前，能能夠環(huán)視四四周；做時(shí)時(shí)，你只能能或者最好好沿著以腳腳為起點(diǎn)的的射線向前前。。5:53:05上上午5:53上上午05:53:0512月-229、沒有失敗敗，只有暫暫時(shí)停止成成功！。12月-2212月-22Friday,December23,202210、很多事情情努力了未未必有結(jié)果果，但是不不努力卻什什么改變也也沒有。。。05:53:0505:53:0505:5312/23/20225:53:05AM11、成功就就是日復(fù)復(fù)一日那那一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小努努力的積積累。。。12月-2205:53:0505:53Dec-2223-Dec-2212、世間成成事，不不求其絕絕對圓滿滿，留一一份不足足，可得得無限完完美。。。05:53:0505:53:0505:53Friday,December23,202213、不知香積寺寺，數(shù)里入云云峰。。12月-2212月-2205:53:0505:53:05December23,202214、意志堅(jiān)強(qiáng)的的人能把世界界放在手中像像泥塊一樣任任意揉捏。23十二月月20225:53:05上午05:53:0512月-2215、楚塞三三湘接，，荊門九九派通。。。。十二月月225:53上上午午12月月-2205:53December23,202216、少年十五五二十時(shí)，，步行奪得得胡馬騎。。。2022/12/235:53:0505:53:0523December202217、空山新雨雨后，天氣氣晚來秋。。。5:53: