蛋白質(zhì)組學proteomicswxj教學課件

蛋白質(zhì)組學proteomicswxj幻燈片PPT本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！蛋白質(zhì)組學proteomicswxj幻燈片PPT本課Proteome&Proteomics定義Proteome：1994年，由澳大利亞Macguarie大學的Wilkins等首先提出：“蛋白質(zhì)組指由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)”“proteome”是由蛋白質(zhì)一詞的前幾個字母“prote”和基因組一詞的后幾個字母“ome”拼接而成Proteome&Proteomics定義ProteoProteome&Proteomics定義Proteomics：蛋白質(zhì)組學是從整體水平細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、功能及其動態(tài)變化規(guī)律的科學。研究內(nèi)容包括分析蛋白質(zhì)組所有組分及它們的表達水平，確定各種組分的空間定位、修飾方法、互作機制、生物活性及相應(yīng)特定功能等。由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識Proteome&Proteomics定義ProteoGenome&ProteomeGenome&ProteomeGenomicsTranscriptomics&ProteomicsGenomicsTranscriptomics&ProProteomics&StructuralGenomicsProteomics&StructuralGenomiProteomics&FunctionalGenomicsProteomics&FunctionalGenomi特點之一∶整體性特點之一∶整體性特點之二∶系統(tǒng)性特點之二∶系統(tǒng)性特點之三∶動態(tài)性特點之三∶動態(tài)性StructuralProteomics結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學FunctionalProteomics功能蛋白質(zhì)組學分類StructuralProteomics分類StructuralProteomicsSeparationIdentificationPTM(post-translationalmodification)IdentificationComparison&SubtractionAnalysisStructuralProteomicsSeparatioFunctionalProteomicsLocalizationProteinComplexDeterminationProtein-ProteinInteraction/InteractionNetworkFunctionofProtein(MetabolicandRegulatoryPathway;SignalTransductionPathway)FunctionalProteomicsLocaliza蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合生物質(zhì)譜、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)，對蛋白質(zhì)進行全面的鑒定研究。翻譯后修飾的鑒定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等過程。蛋白質(zhì)功能確定：包括蛋白質(zhì)定位研究，蛋白質(zhì)活性，蛋白質(zhì)相互作用，酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析，配基-受體結(jié)合分析等。蛋白質(zhì)組學的主要任務(wù)蛋白質(zhì)組學的主要任務(wù)蛋白質(zhì)組學研究思路與方法策略、技術(shù)、工具蛋白質(zhì)組學研究思路與方法策略、技術(shù)、工具主要專業(yè)術(shù)語及其英文對照和縮寫IPG-IEF：固相pH梯度等電聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）2-DE：雙向電泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC：高效液相色譜（HighperformanceLiquidChromatography）MALDI-TOFMS：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)主要專業(yè)術(shù)語及其英文對照和縮寫IPG-IEF：固相pH梯度等蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列數(shù)據(jù)庫（Genbank，/EMBL；http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式數(shù)據(jù)庫（Prosite；http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白質(zhì)二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫、蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，/；FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫（O-GLYCBASE，http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）蛋白質(zhì)組學研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http研究策略兩條互補的實驗流程基于凝膠的工作流程 （Gel-basedworkflow）基于液相色譜的工作流程 （LC-basedworkflow）研究策略兩條互補的實驗流程ClassicalGE&LCtoProteinIDGapelo(2010)JProteomicsHPLC-MSClassicalGE&LCtoProteinI蛋白質(zhì)組學proteomicswxj教學課件蛋白質(zhì)組研究的主要手段雙向電泳（twodimensionalgelelectrophoresis,2D-GE）差示電泳（differentialgelelectrophoresis,DIGE

）毛細管電泳

(capillaryelectrophoresis,CE)高效液相色譜

(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分子篩柱層析反向柱層析質(zhì)譜分析(massspectrometryMS)

基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdisorptionionization-timeofflight/tandemMS,MALDI-TOF/MS/MS)

電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（electrosprayionizationESI-MS）生物信息學蛋白質(zhì)組研究的主要手段雙向電泳（twodimensiona蛋白質(zhì)組學實驗室所需的條件蛋白質(zhì)組學實驗室所需的條件蛋白質(zhì)組學研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳或HPLC圖像分析凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白翻譯后修飾的鑒定酶解蛋白質(zhì)組學研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳或HPLSampleProteinPreparationUsuallythecomplexityoftheproteinand/orpeptidemixtureliesbeyondthetheoreticalseparationspaceofanyseparationmethod.ProteomeComplexity.

Genomictranscriptionindiversity;post-transcriptionprocessing;post-translationalmodification;constitutionofcombinatorialcomplex.Itrequiresquitealongtimeforanalysisofproteincomplex.Samplerecoverylowthroughseparation:moresteps,lessoverallrecovery.Theconc.oftheproteinswitharangeof6-ordermagnitude:intissues,proteinconcentrationsspanadynamicrangeofsixordersofmagnitudes(forregulatoryproteinorTFsafewmoleculespercell,forhousekeepingproteinsmillioncopiespercell).So,itisdifficulttodetectverylowconcentratedproteinsinthepresenceofhighlyabundantproteins.Thecomplexproteinsampleswithlimitedstabilityduetoexistenceofenzymesandproteases,enzymeinhibitorscanonlypartlystabilizethesample.SampleProteinPreparationUsuaManyparametersinfluencethecompositionofproteomebetweeninducedandinherentbiologicalvariations,suchasgeneticdifferences,genderandageofpatientsandcellgrowthconditions.Thisrequiressamplereplicates.(statisticianswoulddemandatleastfivereplicates,inmanycasesthreereplicatescandeliverhighlyconfidentresults.Inclinicalthenumberofrequiredproteinsaremuchhigh).Membraneproteinsareverydifficulttosolubilize,andeasytolossduringsamplepreparationandseparationbystickingtoasurfaceoraggregation.Post-translationalmodifications(PTMs)likephosphorylationandglycosylationrequiresophisticatedanalysistoolslikeMSn,wherethepeptideionsgeneratedseveraltimesfragmented.SampleProteinPreparationManyparametersinfluencethe蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)樣品預(yù)分離樣品的制備（預(yù)處理）：組織細胞細胞器（線粒體、葉綠體、細胞核）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)樣品預(yù)分離樣品的制備（預(yù)處理）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取重要性：在制備時丟失的蛋白永遠不能在后面實驗中彌補原則：使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取重要性：蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取步驟：破碎沉淀蛋白去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取步驟：蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程破碎

盡可能減少蛋白水解/其它形式蛋白降解原則機械法（超聲波法、高壓法、機械勻漿法）化學法（去污劑法、酶裂解法）物理法（液氮研磨法、反復凍融法、滲透 法、玻璃珠破碎法）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程沉淀蛋白

去雜濃縮后蛋白可溶性是關(guān)鍵

三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法

TCA沉淀法–引起降解/修飾丙酮沉淀法硫酸銨沉淀法–影響IEF醋酸銨沉淀法–步驟繁瑣

蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程2D電泳結(jié)果影響因素分析2D電泳結(jié)果影響因素分析蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程去除雜質(zhì)

關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾

核酸的清除（DNase/RNase）多糖的清除（超離心、TCA沉淀等）去污劑的清除（丙酮沉淀法等）鹽離子和外源帶電小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：TCA殘留致使Pr丟失2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備注意事項：蛋白質(zhì)水解蛋白酶抑制劑(PMSF等)特殊樣品的制備(低豐度、強堿性蛋白質(zhì)（核糖體）、極端分子量)樣品定量重復性蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備注意事項：TwoDimensionalGelElectrophoresis(2D-GE)DifferentialGelElectrophoresis(DIGE)GelElectrophoresisTwoDimensionalGelElectrophoWorkflowforTwo-DimensionalElectrophoresis(2-DE)GE(2004)2-DElectrophoresisWorkflowforTwo-DimensionalEtwodimensionalgelelectrophoresis(2D-GE)twodimensionalgelelectrophoIsoelectricFocusingElectrophoresis(IEF)IEFmainlyappliedforthefollowingpurposes:1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-DelectrophoresisPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargeFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptidesinsteadofstrongcationexchangechromatographyinMDLC-MSIPGimmobilizedpHgradientIPGStripforIEFpH10.0Cathode(-)pH3.0Anode(+)pH10→3IsoelectricFocusingElectrophIEFisperformedinapHgradientgel.ProteinsChargedwithAnion(-)orCation(+)

dependon(i)theirmoleculartraitsduetotheiracidicandbasicgroups,and(ii)theenvironmentalpH.EnvironmentalpH:inbasicbuffer,theacidicgroupsofproteinswithnegativecharge;inacidicbuffer,thebasicgroupswithpositivecharge.ProteinIsoelectricPoint(pI):AtapHvalue,thenetchargeofaproteiniszero.39IEFTheoreticalBackground

IEFisperformedinapHgradi40ThePrincipleofIsoelectricFocusingElectrophoresis40ThePrincipleofIsoelectricIEFPrincipleAmpholytestoCreateApHGradient:AHeterogeneousMixtureofIsomersofaliphaticoligoamino-oligocarboxylicacidsunderelectricityfieldcouldalignthemselvesduetoindividualmoleculetrait&createapHgradientalongcathodewithhigh-pHtoanodewithlow-pH.AmpholyteProperties:(i)highbufferingandsolubilityinitspI(ii)goodandregularelectricconductivityatitspI(iii)absenceofbiologicaleffect(iv)lowmolecularweightTheAmpholyte-Gel:theampholyte2%(w/v),thegel4%(T)&3%(C)ImmobilepHGradientStripforProteinsSeparation(IPG):(i)proteinsappliedtoapositionontheIPGstripcouldbechargedwithanion,cationandzero(ii)protein-cationmovesforwardcathodeandstopthesitewherethepHvalueisequaltothepIofprotein-cation;similarityforprotein-aniontomoveforwardanodeandstop;protein-zerotobenaivetomove.41IEFPrincipleAmpholytestoCre42ImmobilizedpHGradientPolyacrylamideTheGeneralStructureofImmobiline(Ampholyte)42ImmobilizedpHGradientPoly蛋白質(zhì)組學proteomicswxj教學課件雙向凝膠電泳（2-DE）是等電聚焦電泳和SDS的組合即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離）然后再進行SDS（按照分子大?。┠z經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)圖雙向凝膠電泳（2-DE）是等電聚焦電泳和SDS的組蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS：樣品制備第一向IPG-IEF電泳IPG平衡第二向SDS電泳染色（銀染）及圖譜分析目標蛋白獲取及其鑒定（MC分析）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS：蛋白質(zhì)組學proteomicswxj教學課件2-DE第一向IPG-IEF電泳IEF是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶從而得知其等電點信息2-DE第一向IPG-IEF電泳IPG-IEF電泳IPG-IEF電泳2-DE第二向垂直SDS電泳聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。SDS與蛋白質(zhì)形成雪茄狀帶負電荷復合物，從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異，電泳速度僅與分子量有關(guān)

從而得知其分子量信息2-DE第二向垂直SDS電泳第二向垂直SDS電泳凝膠濃度與其對應(yīng)的分離范圍膠濃度分離范圍(KD)5%36-2007.5%24-200

10%14-20012.5%14-10015%14-60第二向垂直SDS電泳凝膠濃度與其對應(yīng)的分離范圍第二向垂直SDS電泳EttanDalttwelve電泳系統(tǒng)第二向垂直SDS電泳EttanDalttwel第二向垂直SDS電泳EttanDaltsix電泳系統(tǒng)第二向垂直SDS電泳EttanDaltsix電2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點的檢測染色：

1）考馬斯亮蘭染色法；

2）銀染法；3）負染法；4）熒光染色法；5）放射性同位素標記法等2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點的檢測染色：安全（safety）靈敏（sensitivity）簡單（simplicity）特異性（specificity）快速（speed）穩(wěn)定（stability）兼容性（synergy）理想顯色劑的7S理想顯色劑的7S有機染料和銀染考馬斯亮藍染色靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；硝酸銀染色的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍染色技術(shù)可實現(xiàn)PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會對蛋白質(zhì)進行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。氨基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點是：對某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對其后的蛋白質(zhì)測序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩類染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

有機染料和銀染考馬斯亮藍染色靈敏度為30~100ng，線性范CoomassieBrilliantBlue&SilverStain

CoomassieBrilliantBlue&Silv負染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。負染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用膠體擴散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括麗春紅、印度墨水染料、膠體金染料等。

膠體擴散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF有機熒光團染料包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合的熒光團染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標準的實驗室300nm紫外透射儀進行照像保存，其線性范圍為3個數(shù)量級。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過SAGE所獲得的基因表達水平的動態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進行免疫染色或Edman測序來鑒定蛋白質(zhì)。有機熒光團染料包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合的熒光團染料兩類。后者熒光染色熒光染色金屬螯合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學研究相兼容的、相對較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計專門與常用微量化學表征過程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學平臺（包括自動化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合。其中SYPRORuby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。金屬螯合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學研究相兼容的、相對較新的同位素標記，放射自顯影靈敏度~20pg同位素標記，放射自顯影靈敏度~20pg2DE重復性Thesameprotocolandsample,howevernotthesameresultsRec:similar;cir:different2DE重復性ThesameprotocolandsaDIGE&ProteinsLabeledwithCyDyesProteinslabeledwithCyDyes:

withdyescyanine(Cy2blue,Cy3red,Cy5green),thedyescannotinfluenceproteinpropertyaswellasitsmolecularweightmuch.TheMixedRunon2-DE:

themixedratioat1:1,runonthesame2-DE,thesamekindofproteinswithdifferentdyesfromdifferentsamplescanco-migrate.TheMixedGelScanned:

withlaserscannertoscanthemixedrangelatdifferentwavelengthsaccordingtoCyDyeTheResultReadout:thepositionandthecoloroftheproteinspotsonDIGEimage,thepositiontorepresenttheproteinID,thecolor,accordingtostandardcolorcalibratortoinfereachdyetheproportiontothedyemix,torepresenttherelativeamountofthesamekindofproteinamongdifferentsamples.64DIGE&ProteinsLabeledwithC650Cx30minGE(2004)2-DElectrophoresisLysineLabeling(minimallabeling)Inpractice400pmolofdyeisaddedto50ugofprotein.Inthiswayonly3-5%oftheproteinswillreceiveatag(95-97%remainunlabeled)Labelingreaction:noIPGbuffer,noreductant,pH8.5,37℃,30minwithdye,theepsilon-aminosidegroupoflysineislabeledwithdye.650Cx30minGE(2004)2-DEle66CysteineLabeling(saturationlabeling)Thehighsensitivity,downto1000humancells(around2.5ugprotein)couldprovidegood2-DELabelingreaction:noIPGbuffer;TCEPreductantpH8.0,37℃,1h;dyeaddedpH8.0,37℃30min;thethiogroupofcysteinelabeledwithdyes(Cy3orCy5).66CysteineLabeling(saturatio67Workflowfor2-DEofProteinsLabeledwithCyDyes67Workflowfor2-DEofProtein68WorkflowforDIGEofProteinsLabeledwithCyDyesGE(2004)2-DElectrophoresis68WorkflowforDIGEofProtein69ProteinsLabeledwithCyDyesMixLabeledProteins2-DELaserScannerwithDifferentWavelengthsIndividual&OverlapImageAnalysis(ProteinSpotLocation&Color)IdentificationofProteinID&Abundance1stIEF(pI)2ndSDS(Mw)69ProteinsLabeledwithCyDyesExampleforDIGEImagesScannedwithDifferenceWavelength

ProteomicsinPracticep6970ExampleforDIGEImagesScanne2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點的檢測圖像掃描和分析——ImageScannerII2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點的檢測圖像掃描和分析——Image2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點的檢測全自動斑點切取系統(tǒng)（EttanSpotPicker）

2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點的檢測全自動斑點切取系統(tǒng)（Ettan質(zhì)譜分析(MS)質(zhì)譜原理：樣本分子離子化后,根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比(m/e)差異,分離樣本,確定分子量2-DE凝膠蛋白質(zhì)斑點的檢測質(zhì)譜分析(MS)質(zhì)譜原理：樣本分子離子化后,根據(jù)不同離子PrincipleforMassSpectrometry74SchematicofQuadrupoleTOFHybridAnalyzerWestermeier(2008)ProteomicsinPracticePrincipleforMassSpectrometr電噴霧質(zhì)譜電噴霧質(zhì)譜樣品溶于固定的底物中形成晶體，用激光脈沖使其離子化，離子被加速后通過飛行管時分離，所有離子均可被檢測，常用來測蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子MALDI-TOFMS樣品溶于固定的底物中形成晶體，用激光脈沖使其離子化，離子被加通過質(zhì)譜分析，可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中同位素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)等多方面的信息SARS病毒N蛋白整體分子量通過質(zhì)譜分析，可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中同位素蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解成肽段后，獲得所有肽段的分子質(zhì)量，形成一個特異的肽質(zhì)量指紋圖譜（peptidemassfingerprinting，PMF），通過數(shù)據(jù)庫搜索與比對，便可確定待分析蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。PeptideMassFingerprinting(PMF)蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解成肽段后，獲得所有肽段的分子質(zhì)量，形成一個特異PeptideMassFingerprinting(PMF)PeptideMassFingerprinting(PPeptideMassFingerprinting(PMF)PeptideMassFingerprinting(P用PMF方法未能鑒定的蛋白質(zhì)可通過質(zhì)譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或數(shù)段多肽的串連質(zhì)譜信息（氨基酸序列）并通過數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定該蛋白質(zhì)?；旌系鞍踪|(zhì)酶解后的多肽混合物直接通過（多維）液相色譜分離，然后進入質(zhì)譜進行分析。用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）鑒定蛋白質(zhì)用PMF方法未能鑒定的蛋白質(zhì)可通過質(zhì)譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）鑒定蛋白質(zhì)用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）鑒定蛋白質(zhì)多肽氨基酸序列分析串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem-MS）,第一級質(zhì)譜得到肽的分子離子,選取目標肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，即N端碎片離子系列（B系列）和C端碎片離子系列（Y系列），將這些碎片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列?！皃roteinladdersequencing”的方法，通過對Edman降解法的修改，產(chǎn)生一系列截去N端殘基的肽段，用MALDI-MS測得這些肽段的質(zhì)量，從而推測N端序列。

多肽氨基酸序列分析串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem-MS）,第一級質(zhì)譜84Theprotonatedtotalpeptidemassis1410.6.ThepeptidetobeionizedintoN-terminalions(b-ions)andC-terminalions(y-ions).Thealignmentoftheseionsofthepeptidefromsmalltolargeaccordingtotheirm/z,auniquemassspectrumforthepeptide.Thesignalintensity(theheight)ofeachionrepresentstheabundanceofthefragmentioninsystem.Contrastofb-ionstoy-ionscouldinferthepeptidesequence.多肽氨基酸序列分析84Theprotonatedtotalpeptide多肽氨基酸序列分析多肽氨基酸序列分析IsotopeLabelingProteinSamplesviaMetabolism

Campbell(2002)Discoveringp189

86DifferentIsotopestolabeldifferentsamplesviametabolism.Combinethesamplesataratioofonetoonefromdiffsourcesandtosubjecttoseparation,anddigestion.AnalysisbyMStoproducecharacteristicmassspectrum(1)ateverym/zpoint,twopeaksalwaysoccurredincouple,representingthesamemoleculewithdiffmassisotopes:thefrontwithlightisotopeandthefollowingwithheavyone.(2)ateverym/zpoint,theratiooftwopeakstorepresentthesamemoleculerelativeabundancefromdiffsources.IsotopeLabelingProteinSampIsotopeTagICATforLabelingofProteinSamplesinvitro

87ICATconsistsofthreeparts(i)biotinaffinitytag,bindreversiblytoavidin(ii)alinker,contain8stableisotopes(iii)thiolgroup,bindtocysteineofproteinInICATmolecule,ifXgroupspresentwithH(=1),theICATisthelightisotopetag.IfXgroupspresentwithD(deuterium=2),theICATistheheavyisotopetag.ThemassdifferencebetweenHandDinICATcouldbediscriminatedbyMS.IsotopeTagICATforLabeling88WorkflowofProteinTaggedwithICATforLC-MSCampbell(2002)Discovering88WorkflowofProteinTaggedwProteinsLabeledwithICATinvitro,AnalyzedbyMS

Campbell(2002)Discoveringp19189InvitroproteinsfromdiffsourcestobelabeledwithdifferentICAT,lightandheavymass.Combinethesamples(thelightwiththeheavy)anddigestit.WithaffinitypurificationagainstICATtoisolateproteinfragmentslabeledwithICAT.TheICAT-labelfragmentstobeanalyzedbyMS,similartothatoflabeledwithN14andN15.

Atam/zpoint,therearetwomasspeaks,thesamemolecule,fromdifferentsources,labeledwiththelightandtheheavyICAT.Thepeakratiorepresentsthesamemoleculewithrelativeabundanceaccordingtodiffsources.ProteinsLabeledwithICATin90QuantificationandIdentificationProteinsbyICATCampbell(2002)Discovering90QuantificationandIdentific蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)功能蛋白質(zhì)組學蛋白質(zhì)功能研究技術(shù)功能蛋白質(zhì)組學TechniquesforStudyofProtein-ProteinInteractionsProteinMicroarrayPulldownImmunoprecipitation（Co-IP）&WesternBlottingY2HSystem(yeasttwo-hybridsystem)FluorescenceResonanceEnergyTransferthroughtheproteincomplex(FRET)TechniquesforStudyofProteiPulldownPulldownCo-IPCo-IPYeasttwo-hybridsystemYeasttwo-hybridsystem蛋白質(zhì)組在醫(yī)學研究中

的現(xiàn)狀和前景蛋白質(zhì)組在醫(yī)學研究中

的現(xiàn)狀和前景蛋白質(zhì)組在醫(yī)學研究中的現(xiàn)狀和前景人類疾病的蛋白質(zhì)組研究直腸癌： Sanchez等對15例結(jié)腸癌和13例正常人的結(jié)腸上皮進行2-DE。建立了包括882和861個斑點的結(jié)腸癌及正常人結(jié)腸粘膜的標準膠圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分子量為13kD和pI值為5.6處的蛋白質(zhì)僅出現(xiàn)在結(jié)腸癌的組織中。經(jīng)鑒定為：鈣粒蛋白B（calgranulinB）及鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin）

蛋白質(zhì)組在醫(yī)學研究中的現(xiàn)狀和前景人類疾病的蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)組在醫(yī)學研究中的現(xiàn)狀和前景致病微生物的蛋白質(zhì)組研究檢測博氏疏螺旋體與免疫有關(guān)的蛋白質(zhì)弓形體抗原的檢測白色念珠菌對真菌細胞壁蛋白分析篩選抗藥真菌藥物蛋白質(zhì)組在醫(yī)學研究中的現(xiàn)狀和前景致病微生物的蛋白質(zhì)組研究蛋白質(zhì)組學研究趨勢蛋白質(zhì)組學研究趨勢蛋白質(zhì)組學研究趨勢在應(yīng)用研究方面 蛋白質(zhì)組學將成為尋找疾病分子標記和藥物靶標最有效的方法之一在技術(shù)發(fā)展方面研究方法將更強調(diào)各種方法間的整合和互補，以適應(yīng)不同蛋白質(zhì)的不同特征蛋白質(zhì)組學與其它學科的交叉互動蛋白質(zhì)組學研究趨勢在應(yīng)用研究方面 蛋白質(zhì)組學proteomicswxj幻燈片PPT本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！本課件PPT僅供大家學習使用學習完請自行刪除，謝謝！蛋白質(zhì)組學proteomicswxj幻燈片PPT本課Proteome&Proteomics定義Proteome：1994年，由澳大利亞Macguarie大學的Wilkins等首先提出：“蛋白質(zhì)組指由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)”“proteome”是由蛋白質(zhì)一詞的前幾個字母“prote”和基因組一詞的后幾個字母“ome”拼接而成Proteome&Proteomics定義ProteoProteome&Proteomics定義Proteomics：蛋白質(zhì)組學是從整體水平細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、功能及其動態(tài)變化規(guī)律的科學。研究內(nèi)容包括分析蛋白質(zhì)組所有組分及它們的表達水平，確定各種組分的空間定位、修飾方法、互作機制、生物活性及相應(yīng)特定功能等。由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識Proteome&Proteomics定義ProteoGenome&ProteomeGenome&ProteomeGenomicsTranscriptomics&ProteomicsGenomicsTranscriptomics&ProProteomics&StructuralGenomicsProteomics&StructuralGenomiProteomics&FunctionalGenomicsProteomics&FunctionalGenomi特點之一∶整體性特點之一∶整體性特點之二∶系統(tǒng)性特點之二∶系統(tǒng)性特點之三∶動態(tài)性特點之三∶動態(tài)性StructuralProteomics結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學FunctionalProteomics功能蛋白質(zhì)組學分類StructuralProteomics分類StructuralProteomicsSeparationIdentificationPTM(post-translationalmodification)IdentificationComparison&SubtractionAnalysisStructuralProteomicsSeparatioFunctionalProteomicsLocalizationProteinComplexDeterminationProtein-ProteinInteraction/InteractionNetworkFunctionofProtein(MetabolicandRegulatoryPathway;SignalTransductionPathway)FunctionalProteomicsLocaliza蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合生物質(zhì)譜、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)，對蛋白質(zhì)進行全面的鑒定研究。翻譯后修飾的鑒定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等過程。蛋白質(zhì)功能確定：包括蛋白質(zhì)定位研究，蛋白質(zhì)活性，蛋白質(zhì)相互作用，酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析，配基-受體結(jié)合分析等。蛋白質(zhì)組學的主要任務(wù)蛋白質(zhì)組學的主要任務(wù)蛋白質(zhì)組學研究思路與方法策略、技術(shù)、工具蛋白質(zhì)組學研究思路與方法策略、技術(shù)、工具主要專業(yè)術(shù)語及其英文對照和縮寫IPG-IEF：固相pH梯度等電聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）2-DE：雙向電泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC：高效液相色譜（HighperformanceLiquidChromatography）MALDI-TOFMS：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)主要專業(yè)術(shù)語及其英文對照和縮寫IPG-IEF：固相pH梯度等蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列數(shù)據(jù)庫（Genbank，/EMBL；http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式數(shù)據(jù)庫（Prosite；http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白質(zhì)二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫、蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，/；FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫（O-GLYCBASE，http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）蛋白質(zhì)組學研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫蛋白序列數(shù)據(jù)庫（SWISS-PROT/TrEMBL；http研究策略兩條互補的實驗流程基于凝膠的工作流程 （Gel-basedworkflow）基于液相色譜的工作流程 （LC-basedworkflow）研究策略兩條互補的實驗流程ClassicalGE&LCtoProteinIDGapelo(2010)JProteomicsHPLC-MSClassicalGE&LCtoProteinI蛋白質(zhì)組學proteomicswxj教學課件蛋白質(zhì)組研究的主要手段雙向電泳（twodimensionalgelelectrophoresis,2D-GE）差示電泳（differentialgelelectrophoresis,DIGE

）毛細管電泳

(capillaryelectrophoresis,CE)高效液相色譜

(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分子篩柱層析反向柱層析質(zhì)譜分析(massspectrometryMS)

基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdisorptionionization-timeofflight/tandemMS,MALDI-TOF/MS/MS)

電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（electrosprayionizationESI-MS）生物信息學蛋白質(zhì)組研究的主要手段雙向電泳（twodimensiona蛋白質(zhì)組學實驗室所需的條件蛋白質(zhì)組學實驗室所需的條件蛋白質(zhì)組學研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳或HPLC圖像分析凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白翻譯后修飾的鑒定酶解蛋白質(zhì)組學研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳或HPLSampleProteinPreparationUsuallythecomplexityoftheproteinand/orpeptidemixtureliesbeyondthetheoreticalseparationspaceofanyseparationmethod.ProteomeComplexity.

Genomictranscriptionindiversity;post-transcriptionprocessing;post-translationalmodification;constitutionofcombinatorialcomplex.Itrequiresquitealongtimeforanalysisofproteincomplex.Samplerecoverylowthroughseparation:moresteps,lessoverallrecovery.Theconc.oftheproteinswitharangeof6-ordermagnitude:intissues,proteinconcentrationsspanadynamicrangeofsixordersofmagnitudes(forregulatoryproteinorTFsafewmoleculespercell,forhousekeepingproteinsmillioncopiespercell).So,itisdifficulttodetectverylowconcentratedproteinsinthepresenceofhighlyabundantproteins.Thecomplexproteinsampleswithlimitedstabilityduetoexistenceofenzymesandproteases,enzymeinhibitorscanonlypartlystabilizethesample.SampleProteinPreparationUsuaManyparametersinfluencethecompositionofproteomebetweeninducedandinherentbiologicalvariations,suchasgeneticdifferences,genderandageofpatientsandcellgrowthconditions.Thisrequiressamplereplicates.(statisticianswoulddemandatleastfivereplicates,inmanycasesthreereplicatescandeliverhighlyconfidentresults.Inclinicalthenumberofrequiredproteinsaremuchhigh).Membraneproteinsareverydifficulttosolubilize,andeasytolossduringsamplepreparationandseparationbystickingtoasurfaceoraggregation.Post-translationalmodifications(PTMs)likephosphorylationandglycosylationrequiresophisticatedanalysistoolslikeMSn,wherethepeptideionsgeneratedseveraltimesfragmented.SampleProteinPreparationManyparametersinfluencethe蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)樣品預(yù)分離樣品的制備（預(yù)處理）：組織細胞細胞器（線粒體、葉綠體、細胞核）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)樣品預(yù)分離樣品的制備（預(yù)處理）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取重要性：在制備時丟失的蛋白永遠不能在后面實驗中彌補原則：使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取重要性：蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取步驟：破碎沉淀蛋白去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取步驟：蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程破碎

盡可能減少蛋白水解/其它形式蛋白降解原則機械法（超聲波法、高壓法、機械勻漿法）化學法（去污劑法、酶裂解法）物理法（液氮研磨法、反復凍融法、滲透 法、玻璃珠破碎法）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程沉淀蛋白

去雜濃縮后蛋白可溶性是關(guān)鍵

三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法

TCA沉淀法–引起降解/修飾丙酮沉淀法硫酸銨沉淀法–影響IEF醋酸銨沉淀法–步驟繁瑣

蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程2D電泳結(jié)果影響因素分析2D電泳結(jié)果影響因素分析蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程去除雜質(zhì)

關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾

核酸的清除（DNase/RNase）多糖的清除（超離心、TCA沉淀等）去污劑的清除（丙酮沉淀法等）鹽離子和外源帶電小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備流程2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：TCA殘留致使Pr丟失2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備注意事項：蛋白質(zhì)水解蛋白酶抑制劑(PMSF等)特殊樣品的制備(低豐度、強堿性蛋白質(zhì)（核糖體）、極端分子量)樣品定量重復性蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)蛋白提取樣品制備注意事項：TwoDimensionalGelElectrophoresis(2D-GE)DifferentialGelElectrophoresis(DIGE)GelElectrophoresisTwoDimensionalGelElectrophoWorkflowforTwo-DimensionalElectrophoresis(2-DE)GE(2004)2-DElectrophoresisWorkflowforTwo-DimensionalEtwodimensionalgelelectrophoresis(2D-GE)twodimensionalgelelectrophoIsoelectricFocusingElectrophoresis(IEF)IEFmainlyappliedforthefollowingpurposes:1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-DelectrophoresisPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargeFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptidesinsteadofstrongcationexchangechromatographyinMDLC-MSIPGimmobilizedpHgradientIPGStripforIEFpH10.0Cathode(-)pH3.0Anode(+)pH10→3IsoelectricFocusingElectrophIEFisperformedinapHgradientgel.ProteinsChargedwithAnion(-)orCation(+)

dependon(i)theirmoleculartraitsduetotheiracidicandbasicgroups,and(ii)theenvironmentalpH.EnvironmentalpH:inbasicbuffer,theacidicgroupsofproteinswithnegativecharge;inacidicbuffer,thebasicgroupswithpositivecharge.ProteinIsoelectricPoint(pI):AtapHvalue,thenetchargeofaproteiniszero.139IEFTheoreticalBackground

IEFisperformedinapHgradi140ThePrincipleofIsoelectricFocusingElectrophoresis40ThePrincipleofIsoelectricIEFPrincipleAmpholytestoCreateApHGradient:AHeterogeneousMixtureofIsomersofaliphaticoligoamino-oligocarboxylicacidsunderelectricityfieldcouldalignthemselvesduetoindividualmoleculetrait&createapHgradientalongcathodewithhigh-pHtoanodewithlow-pH.AmpholyteProperties:(i)highbufferingandsolubilityinitspI(ii)goodandregularelectricconductivityatitspI(iii)absenceofbiologicaleffect(iv)lowmolecularweightTheAmpholyte-Gel:theampholyte2%(w/v),thegel4%(T)&3%(C)ImmobilepHGradientStripforProteinsSeparation(IPG):(i)proteinsappliedtoapositionontheIPGstripcouldbechargedwithanion,cationandzero(ii)protein-cationmovesforwardcathodeandstopthesitewherethepHvalueisequaltothepIofprotein-cation;similarityforprotein-aniontomoveforwardanodeandstop;protein-zerotobenaivetomove.141IEFPrincipleAmpholytestoCre142ImmobilizedpHGradientPolyacrylamideTheGeneralStructureofImmobiline(Ampholyte)42ImmobilizedpHGradientPoly蛋白質(zhì)組學proteomicswxj教學課件雙向凝膠電泳（2-DE）是等電聚焦電泳和SDS的組合即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離）然后再進行SDS（按照分子大?。┠z經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)圖雙向凝膠電泳（2-DE）是等電聚焦電泳和SDS的組蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS：樣品制備第一向IPG-IEF電泳IPG平衡第二向SDS電泳染色（銀染）及圖譜分析目標蛋白獲取及其鑒定（MC分析）蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS：蛋白質(zhì)組學proteomicswxj教學課件2-DE第一向IPG-IEF電泳IEF是一種根據(jù)樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶從而得知其等電點信息2-DE第一向IPG-I