3物理圖繪制匯總課件

第三章物理圖繪制第三章物理圖繪制1用遺傳學(xué)技術(shù)作圖對于指導(dǎo)基因組計劃的測序階段還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因為遺傳圖譜的局限性：遺傳圖的分辨率有限：依賴于所得到的交換數(shù)目。遺傳圖的覆蓋面較低：重組熱點、極少重組區(qū)段的存在。遺傳圖的準(zhǔn)確率有限：環(huán)境因素和取樣誤差，分子標(biāo)記的排列有時會出現(xiàn)差錯。用遺傳學(xué)技術(shù)作圖對于指導(dǎo)基因組計劃的測序2物理圖譜是以物理距離來表示各遺傳標(biāo)記之間或DNA序列兩點之間在DNA分子上的位置，以實際的堿基對長度來度量其物理距離。物理圖譜是以物理距離來表示各遺傳標(biāo)記之間或DNA序列兩點之間31）限制性作圖（Restrictionmapping）：它是將限制性酶切位點標(biāo)定在DNA分子的相對位置。2）基于克隆的基因組作圖

(Clone-basedmapping)：根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊順序構(gòu)建重疊群

(Contig),繪制物理連鎖圖。3）熒光原位雜交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）：將熒光標(biāo)記的探針與染色體雜交確定分子標(biāo)記的所在位置。4）序列標(biāo)簽位點作圖

（Sequencetaggedsite,STS）：通過PCR或分子雜交將小段DNA序列定位在基因組的DNA區(qū)段中。物理圖繪制方法1）限制性作圖（Restrictionmapping）：43.1限制性作圖限制性內(nèi)切酶：Ⅰ型限制性內(nèi)切酶：催化宿主DNA甲基化，在識別位點約1000bp以外任何位置切割DNA鏈，不產(chǎn)生確定限制片段和明確條帶Ⅱ型限制性內(nèi)切酶：在識別位點之中或鄰近的確定堿基位置特異性切開DNA鏈，產(chǎn)生確定的限制性片段和條帶，是3類限制性內(nèi)切酶中唯一可用于限制性作圖的酶Ⅲ型限制性內(nèi)切酶：催化宿主DNA甲基化，在識別位點約25-27bp何位置切割DNA鏈，要求識別位點是反向重復(fù)序列，很少產(chǎn)生完全酶切的片段3.1限制性作圖限制性內(nèi)切酶：53.1.1限制性作圖的基本方法比較一種DNA分子被不同限制性內(nèi)切酶切割所產(chǎn)生的片段大小。首先用一種酶處理樣品后，電泳確定DNA片段的大小。然后用第二種酶處理，獲得第二組片段。最后用兩種酶混合處理，獲得第三組片段。收集上述資料進行對比組裝。兩種酶切位點交替出現(xiàn)的區(qū)段用加減法確定其的相對位置。連續(xù)出現(xiàn)2個或多個相同酶切位點的區(qū)段，采用部分酶解法（多個相同酶切位點區(qū)段只發(fā)生一次酶切）。切點過多時可以采用末端同位素標(biāo)記結(jié)合部分酶解進行繪圖。3.1.1限制性作圖的基本方法比較一種DNA分子被不同限制6§3Physicalmapping§3.2限制酶作圖限制酶作圖的基本方法8結(jié)論：圖譜II是正確的雙限制性酶切圖解片段結(jié)論0.2kb,0.5kb必然來自0.7kb的BamHI片段，其中有一個EcoRI的位點1.0kb這必然是一個不含EcoRI位點的BamHI片段，如果我們?nèi)缦路胖?.0kb的片段，就可以解釋1.5kbEcoRI片段的出現(xiàn)1.2kb,2.0kb這必然也是不含EcoRI位點的BamHI片段，它們必須位于3.4kb的EcoRI片段中。這樣就有兩種可能：BamHI部分限制性酶切的預(yù)測如果圖譜I是正確的，不完全消化產(chǎn)物應(yīng)該包括1.2+0.7=1.9kb的片段如果圖譜I是正確的，不完全消化產(chǎn)物應(yīng)該包括2.0+0.7=2.7kb的片段BamHI亞適條件§3Physicalmapping限制酶作圖的基本方法7限制性片段越大，切點越多，需要比較的片段也會增加，而且當(dāng)片段多到一定程度，一些大小相似的片段會重疊在一起，不可能組成一個清晰的圖譜。因此，限制性作圖更適合于小分子。實際應(yīng)用中如果DNA分子小于50kb，通?？梢赃x用識別6個核苷酸序列的限制酶來建立清晰的限制性圖譜。一個較簡單的變通策略使我們可以忽略大量的片段。這種方法是將標(biāo)記物加到要分析的DNA分子兩端，進行部分酶切處理后，很多產(chǎn)物成為不可見的，我們利用可見的部分大小，確定那些未定位的切點與DNA分子末端的相對位置。限制性片段越大，切點越多，需要比較的片段也會增加，而且當(dāng)片段8末端同位素標(biāo)記（或其他標(biāo)記）結(jié)合部分酶切：形成梯形分布帶末端同位素標(biāo)記（或其他標(biāo)記）結(jié)合部分酶切：形成梯形分布帶93.1.2限制性作圖的局限如果基因組較大，切點較多，單、雙、部分酶切的片段會很多。限制性作圖只能應(yīng)用于較小的DNA分子。

通過選擇靶DNA分子中的稀有酶切位點酶可以克服限制性酶切作圖的局限性。稀有切點限制酶:在基因組DNA順序中只有很少可識別序列的限制酶,一般識別位點在6-8堿基對之間,并含有高G/C比。稀有切點限制酶分為兩大類：識別具有7或8個核苷酸序列的酶；識別序列包含靶DNA稀少基序的酶。3.1.2限制性作圖的局限如果基因組較大，切點較多，單、雙10稀有切點限制圖繪制識別順序越長產(chǎn)生的片段越大，但當(dāng)識別位點含非特異順序時，片段長度小于預(yù)期；識別位點的堿基組成影響限制性片段的大小。高等生物基因組一般A/T比較高,應(yīng)選G/C高比例限制酶,如-GCGGCCGC-(NotI)限制酶識別位點較長，即使高等真核生物基因組也沒有這種序列，可以通過轉(zhuǎn)座或轉(zhuǎn)導(dǎo)將這類酶切位點引入待測基因組；基因組DNA甲基化對酶切位點出現(xiàn)頻率的影響。高等生物基因組DNA甲基化比例很高,但果蠅和酵母基因組無甲基化。稀有切點限制圖繪制識別順序越長產(chǎn)生的片段越大，但當(dāng)識別位點含11稀有切點限制酶稀有切點限制酶12選用稀有切點限制酶酶切大片段DNA預(yù)測稀有切點限制性內(nèi)切酶酶切片段大小1)根據(jù)稀有酶切位點限制酶識別堿基數(shù)推測產(chǎn)生的DNA片段長段:

NotI酶:GC/GGCCGC48=74536bp=75kb

I-SceI酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT418=90000000bp=90000kb2)由于多細(xì)胞真核生物基因組DNA存在大量的甲基化位點,識別CG序列的稀有酶切點限制酶實際產(chǎn)生的DNA片段比預(yù)期大得多.如NotI酶切人類基因組DNA產(chǎn)生的片段常在200kb以上，平均長度達到1Mb。選用稀有切點限制酶酶切大片段DNA1)根據(jù)稀有酶切位點限13PFGE的基本原理將一個方向不斷變換的電場，取代簡單的單一電場（單向電場，使電泳中受阻的DNA分子在電場改變時扭轉(zhuǎn)遷移方向，較小的分子比較大的分子重新排列的快，以此達到分離的目的。分辨率達到10Mb。常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳可分辨30kb以下的線性分子，脈沖凝膠電泳可分辨10Mb的大分子大片段DNA的分離技術(shù)——脈沖凝膠電泳PFGE的基本原理大片段DNA的分離技術(shù)——脈沖凝膠電泳14常規(guī)與非常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳正交變電場凝膠電泳3.脈沖凝膠電泳常規(guī)與非常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳正交變電場凝膠電泳15垂直交變電場電泳垂直交變電場(OFAGE)，有2對電極，分別位于凝膠對角線的兩端，2對電極輪流接通電場，產(chǎn)生一個交替的方向不同的電場，DNA分子在凝膠中不斷改變遷移方向。交變電場電泳主要用于相對分子量較大的DNA分子的分離。垂直交變電場電泳垂直交變電場(OFAGE)，16均一脈沖電泳均一脈沖電泳17大腸桿菌基因組物理圖大腸桿菌基因組物理圖183.2基于克隆的基因組作圖

---大分子DNA的克隆基于克隆的基因組作圖：根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊序列構(gòu)建重疊群(Contig)，繪制物理連鎖圖。3.2基于克隆的基因組作圖

---大分子DNA的克隆基于克193.2.1載體質(zhì)粒、噬菌體、粘?！【平湍富蚪M主要是先構(gòu)建粘粒文庫，然后建立克隆重疊群完成測序高等生物基因組擬南芥1.2X105bp，需要25000個克隆人類基因組是擬南芥基因組的33倍3.2.1大分子DNA克隆載體常規(guī)的質(zhì)粒載體不適用于大分子DNA的克隆。大分子DNA克隆載體構(gòu)建:YAC,BAC,PAC

3.2.1載體3.2.1大分子DNA克隆載體常規(guī)的質(zhì)粒20酵

母

人

工

染

色

體（YAC）端粒：用于保護線狀的DNA不被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。自主復(fù)制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進行雙向復(fù)制所必須的信號。端粒酵

母

人

工

染

色

體（YAC）端粒：用于保護線狀的D21YAC文庫裝載的DNA片段的大小一般可達200-500kb，有的可達1Mb以上。

YAC載體的工作原理YAC載體的工作原理22YAC的主要缺點：

1．存在高比例的嵌合體，即一個YAC克隆含有兩個本來不相連的獨立片段；

2．部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會發(fā)生缺失或重排；

3．難與酵母染色體區(qū)分開，因為YAC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu);

4．轉(zhuǎn)化效率低。

YAC的主要缺點：

1．存在高比例的嵌合體，即一個YAC克隆23噬菌體P1載體：與λ載體相似，將天然噬菌體基因組中的一段區(qū)域缺失，容量達125kb細(xì)菌人工染色體BAC：由大腸桿菌中F質(zhì)粒衍生，容量達300kb，單拷貝復(fù)制，穩(wěn)定，不會因重組發(fā)生嵌合P1人工染色體PAC：結(jié)合P1載體和BAC載體的優(yōu)點噬菌體P1載體：與λ載體相似，將天然噬菌體基因組中的一段區(qū)域24細(xì)菌人工染色體（BAC）：以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)，人工構(gòu)建的環(huán)狀的DNA分子?？梢詳y帶大于100-350Kb的外源DNA片段。選擇標(biāo)記：

氯霉素抗性基因等。

BAC載體的優(yōu)點：較為穩(wěn)定；沒有嵌合現(xiàn)象；轉(zhuǎn)化效率高；BAC克隆易于操作和DNA提取；BAC文庫篩選方便。細(xì)菌人工染色體（BAC）：以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)，人工構(gòu)建的環(huán)狀253物理圖繪制匯總課件263物理圖繪制匯總課件27質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pU28基因組文庫：指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機的同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了某種有機體整個基因組。1)目標(biāo)基因組大分子DNA的制備；2)載體制備；3)載體和DNA的連接；4)轉(zhuǎn)化；5)轉(zhuǎn)化子鑒定。YAC和BAC基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫：指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切YAC和BAC基因29

目標(biāo)基因組大分子DNA的制備樣品→洗滌吸干水分→液氮冷凍→碾碎→離心收集細(xì)胞核→低融點瓊脂糖包埋→蛋白酶消化→洗滌→限制酶部分酶解目標(biāo)基因組大分子DNA的制備樣品→洗滌吸干水分→液氮30插入大分子DNA的分離插入大分子DNA的分離31載體制備與插入DNA連接1)YAC載體：制備過程與一般質(zhì)粒載體相同。2)BAC載體：低拷貝載體，大量制備，超離心純化。3)酶切：釋放接頭，接頭去磷，減少自連。4)連接：將含有大分子DNA的瓊脂糖薄片與載體混合,按重量比1:1，680C保溫5min，降溫至370C，加入連接酶過夜。載體制備與插入DNA連接1)YAC載體：32染色體步移3.2.2重疊群組建相互重疊的DNA片段組成的物理圖稱為重疊群(contig)。構(gòu)建重疊群：步移法和指紋法染色體步移3.2.2重疊群組建相互重疊的DNA片段組成的物33

3.2.3指紋作圖—3種指紋在基因組范圍內(nèi)查找重疊的克隆，最好的方法是克隆指紋排序。指紋指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段組成。指紋重疊，表明2個克隆具有共同的區(qū)段，兩個片段相鄰排列。3.2.3指紋作圖—3種指紋在基因組范圍內(nèi)查找重疊的克34指紋作圖限制性帶型指紋：用不同限制性酶處理樣品，凝膠分析，DNA條帶有部分相同，說明它們含有重疊的序列重復(fù)序列DNA指紋：不同克隆酶解電泳，轉(zhuǎn)移到雜交膜中，用一種或幾種基因組范圍的重復(fù)序列作為探針雜交，出現(xiàn)相同的雜交帶型，說明重疊重復(fù)序列DNAPCR：設(shè)計與重復(fù)序列互補的引物，對檢測的克隆進行PCR擴增，相同的產(chǎn)物，說明重疊STS目錄作圖：STS是已知的單一序列。設(shè)計引物，對大量的單個克隆進行PCR擴增指紋作圖35限

制

性

片

段

指

紋

作

圖

原

理限

制

性

片

段

指

紋

作

圖

原

理36限制性片段指紋電泳圖限制性片段指紋電泳圖37指紋重疊群構(gòu)建指紋重疊群構(gòu)建38酵母基因組遺傳圖與物理圖的整合酵母基因組遺傳圖與物理圖的整合393.3原位染色體連鎖圖原位染色體連鎖圖：通過原位雜交的方法將基因或DNA分子標(biāo)記定位在染色體的某一區(qū)段，由此繪制圖稱為原位染色體連鎖圖。最常用的細(xì)胞圖繪制技術(shù)為熒光原位雜交。（fluorescentinsituhybridization,FISH）原位雜交是以標(biāo)記的DNA分子為探針，檢測完整染色體的一種雜交分析方法，其必須使染色體DNA成為單鏈。3.3原位染色體連鎖圖原位染色體連鎖圖：通過原位雜交的方40熒光原位雜交熒光原位雜交41

原位雜交的操作

染色體分裂細(xì)胞染色體變性檢測信號早期的原位雜交用的標(biāo)記是放射性標(biāo)記，但放射性標(biāo)記很難同時滿足靈敏度和分辨率兩個原位雜交的必要條件。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的熒光標(biāo)記解決了這一矛盾。為了得到高靈敏度，探針的標(biāo)記量要盡可能大一些，以往的探針至少40kb?，F(xiàn)在由于強信號熒光物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和重標(biāo)記技術(shù)的發(fā)明，對探針長度的要求已經(jīng)不那么嚴(yán)格了。甲酰胺處理加入探針原位雜交的操作甲酰胺處理加入探針42一種封閉雜交探針中重復(fù)序列的方法一種封閉雜交探針中重復(fù)序列的方法43如何提高熒光原位雜交的分辨率？原位雜交的分辨率與染色體的制備有關(guān)：中期染色體：過于收縮，其分辨率1000kb，主要用于發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)記屬于哪條染色體；機械伸展的中期染色體：離心可使中期染色體伸張，保持形態(tài)，提高分辨率200—300kb；非中期染色體：松弛狀態(tài)，分辨率可達到25kb以下，用于小區(qū)段分子標(biāo)記排序研究。如何提高熒光原位雜交的分辨率？原位雜交的分辨率與染色體的制備44

限制性作圖不能用于大型基因組；

克隆重疊群復(fù)雜，費時費力；

FISH難于操作，數(shù)據(jù)積累慢。目前最有效的物理作圖技術(shù)，也是能對大型基因組產(chǎn)生最詳盡圖譜的技術(shù)，是STS作圖，主要為輻射雜種作圖。3.4輻射雜種作圖限制性作圖不能用于大型基因組；3.4輻射雜45序列標(biāo)記位點(STS)是一段短的DNA序列，其長度通常為100—500bp。一段DNA序列要成為STS需滿足兩個條件：1.它的序列必須是已知的，便于PCR檢測；2.STS必須在擬研究的染色體上有唯一的定位。尋找STS的方法:1）從EST序列中尋找：來自cDNA，EST來自單拷貝的基因時可作為STS2）SSLP：具有多態(tài)性并已在連鎖分析中定位隨機基因組序列3）隨機基因組序列：在數(shù)據(jù)庫中尋找所感興趣的某些序列3.4.1序列標(biāo)記位點序列標(biāo)記位點(STS)是一段短的DNA序列，其長度通常為1046STS作圖原理兩個STS出現(xiàn)在同一片段的機會取決于他們在基因組中的距離，彼此靠的越近，分離的幾率越小，彼此相隔越遠(yuǎn)，分離的幾率越大。兩個STS之間相對距離的估算與連鎖分析的原理一樣，它們之間的圖距根據(jù)它們的分離頻率來算。STS作圖原理兩個STS出現(xiàn)在同一片段的機會取決于他們在基因47STS作圖原理圖示(1)STS作圖原理圖示(1)48STS作圖與連鎖分析是一樣的，不同之處僅在于兩個標(biāo)記間的圖距是根據(jù)分離頻率來計算的。主要采用的方法是輻射雜種作圖。STS作圖與連鎖分析是一樣的，不同之處僅在于兩個標(biāo)記間的圖距49輻射雜種（放射雜交體）：指含有另一種生物染色體片段的嚙齒類細(xì)胞。輻射雜種群（radiationhybridpanel)：通過放射雜交產(chǎn)生的融合細(xì)胞群稱為輻射雜種群。輻射雜種群分為兩類：全基因組輻射雜種群單染色體輻射雜種群3.4.2輻射雜種作圖的程序與方法輻射雜種（放射雜交體）：指含有另一種生物染色體片段的嚙齒類細(xì)50全基因組輻射雜種的篩選并非所有參與融合的鼠類細(xì)胞都會保留來自人類的染色體片段，因此要對其進行鑒別:使用不能產(chǎn)生胸腺激酶（TK)或者次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPRT)的倉鼠細(xì)胞系作受體。這種細(xì)胞在添加了次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)基（HAT）中不能存活。只有獲得人體DNA中TK和HPRT基因的倉鼠細(xì)胞才能在HAT選擇性培養(yǎng)基中生長。全基因組輻射雜種的篩選并非所有參與融合的鼠類細(xì)胞都會保留來51Z之后，可通過PCR檢測STS標(biāo)記，根據(jù)成對STS出現(xiàn)頻率，判斷標(biāo)記是否連鎖及連鎖程度Z之后，可通過PCR檢測STS標(biāo)記，根據(jù)成對STS出現(xiàn)頻率52單染色體輻射雜種群構(gòu)建：用x射線照射另外一類含一條人染色體的嚙齒類（如小鼠）細(xì)胞系，再將這種細(xì)胞與倉鼠細(xì)胞融合。篩選：用人類基因組廣泛分布的重復(fù)序列如Alu（一類SINE)做探針，篩選只含有人染色體片段的雜種細(xì)胞。單染色體輻射雜種群構(gòu)建：用x射線照射另外一類含一條人染色體的53輻射雜種圖距單位

輻射雜種的作圖單位為厘鐳(centiRay,cR)：DNA分子暴露在N拉徳(rad)X射線劑量下兩個分子標(biāo)記之間發(fā)生1%斷裂的機率。利用類似于遺傳重組原理和最大似然性的統(tǒng)計學(xué)方法來計算存在于DNA片段上的STS之間的斷點頻率，以此估計標(biāo)記之間的距離。輻射雜種圖距單位輻射雜種的作圖單位為厘鐳(centi54人類21號染色體輻射雜種圖人類21號染色體輻射雜種圖55人類21號染色體輻射雜種物理圖探針探針排列次序，以及相鄰一對探針之間的圖距人類21號染色體輻射雜種物理圖探針探針排列次序，以及相鄰一對563物理圖繪制匯總課件573.5遺傳

圖物

理圖

的整合釀酒酵母chr3遺傳圖與物理圖的比較因為分子標(biāo)記在染色體上的位置是特定的，可以通過分子標(biāo)記將遺傳圖和物理圖聯(lián)系起來，通過比對查找錯誤，并重新驗證。3.5釀酒酵母chr3遺傳圖與物理圖的比較因為分子標(biāo)記在染色58人類基因組物理圖譜:人類基因組序列開始測定時，已有45萬個EST，其中有一些重復(fù)序列，經(jīng)計算機分析篩選后得到49625個。再從中篩選出3萬個EST、2個輻射雜交系庫（分別有83和93個細(xì)胞株）、1個有32000個克隆的YAC文庫，用于構(gòu)建物理圖譜。構(gòu)建物理圖譜的密度為每個標(biāo)記183Kb。EST分布結(jié)果表明，基因在染色體上的排列是不均勻的。將物理圖譜和遺傳圖譜整合而成更加完整的人類基因組圖譜，作為基因組測序的框架和分析的依據(jù)。人類基因組物理圖譜:591）1987年，發(fā)表遺傳圖，含403個標(biāo)記，密度為10Mb；2)1994年,發(fā)表遺傳圖,含5800個標(biāo)記,密度為0.7Mb.3)1993年，發(fā)表重疊群物理圖，含33000個YAC;4)1995年,發(fā)表STS圖,含15086個標(biāo)記,密度為199kb.5)1996年,發(fā)表遺傳圖,含7050個標(biāo)記,密度為600kb.6)1996年,發(fā)表物理圖,含17096個標(biāo)記,密度達100kb.7)STS圖中含7000多個SSLP,使遺傳圖與物理圖彼此銜接,成為測序的框架圖.人類基因組圖1）1987年，發(fā)表遺傳圖，含403個標(biāo)記，密度為10Mb；60圖譜的應(yīng)用---定位克?。▓D位克?。┒ㄎ豢寺。╬ositionalcloning）：利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶并對目的基因進行克隆。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置?？寺。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進一步研究其功能。圖譜的應(yīng)用---定位克隆（圖位克?。┒ㄎ豢寺。╬ositio613物理圖繪制匯總課件62定位克隆的主要目的之一是將目標(biāo)基因定位于特定染色體上。

A-1型短指（趾）癥：法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論文中首先報道了這一病癥，即世界上第一例孟德爾常染色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學(xué)的經(jīng)典例子被全世界的生物學(xué)和遺傳學(xué)教材廣泛引用。定位克隆的主要目的之一是將目標(biāo)基因定位于特定染色體上。63賀林等利用布依族、苗族和漢族的三個A-1型短指（趾）癥大家系，對該病的致病基因進行了精確定位（位點定在2q35-36區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因上的三個突變位點是導(dǎo)致A-1型短指（趾）癥的直接原因。賀林等利用布依族、苗族和漢族的三個A-1型短指（趾）癥大家系64番茄抗病基因的圖位克隆番茄抗病基因的圖位克隆65定位候選克隆該方法是定位克隆的進一步發(fā)展。將疾病相關(guān)基因定位于染色體相關(guān)區(qū)域；該染色體區(qū)域得到若干候選基因；進一步分析得到目的cDNA；蛋白質(zhì)功能研究。疾病染色體定位若干候選基因確定目的基因蛋白質(zhì)功能定位候選克隆該方法是定位克隆的進一步發(fā)展。疾病染色體定位若干66功能克隆克?。ㄖ虏。┗虻牧硪环N策略。收集所要克隆的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其功能的信息，用以分離基因，并對基因進行定位。性狀（疾?。┑鞍踪|(zhì)產(chǎn)物（生物學(xué)功能）從氨基酸序列出發(fā)設(shè)計DNA引物，從文庫調(diào)取基因得到基因序列染色體定位疾病功能基因功能克隆克隆（致?。┗虻牧硪环N策略。性狀（疾?。┑鞍踪|(zhì)產(chǎn)物67分析異?；虻漠a(chǎn)物（蛋白質(zhì)），弄清它是如何引起臨床癥狀的：純化蛋白質(zhì)，進行氨基酸序列測定，據(jù)此推測可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從cDNA文庫或基因組文庫中篩選對應(yīng)的編碼基因；絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷病如白化?。╝lbinism）、苯丙酮尿癥（PKU）和鐮刀形細(xì)胞貧血?。╯ickle-celldisease）等，都是采取的這一策略。分析異常基因的產(chǎn)物（蛋白質(zhì)），弄清它是如68流式細(xì)胞儀計數(shù)儀熒光染料對染色體染色。熒光探測器確定含有正確染色體的液滴發(fā)出的信號，并將一個電荷加到液滴上流式細(xì)胞儀計數(shù)儀69Science：發(fā)現(xiàn)新抑癌基因SDH5郝淮湘博士從一個功能未知的蛋白入手，發(fā)現(xiàn)了一個疾病基因并闡明了其分子功能和致病機理。

SDH5,aGeneRequiredforFlavinationofSuccinateDehydrogenase,IsMutatedinParagangliomaHuai-XiangHao1,OlehKhalimonchuk2,MargitSchraders3,NoahDephoure4,Jean-PierreBayley5,HenricusKunst6,PeterDevilee7,CorW.R.J.Cremers6,JoshuaD.Schiffman8,BrandonG.Bentz9,StevenP.Gygi4,DennisR.Winge2,HannieKremer3,JaredRutter1*Science：發(fā)現(xiàn)新抑癌基因SDH570郝淮湘，一位在美國諾華生物醫(yī)學(xué)研究所接受博后訓(xùn)練的80后大男孩，在《Science》上發(fā)表了一篇漂亮的研究性文章，文章被同期的Nature雜志推薦為亮點研究成果。郝淮湘1999－2003年在廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)專業(yè)就讀，最后一年在長江學(xué)者林圣彩教授實驗室完成了本科畢業(yè)論文。2003年8月來到美國猶他州鹽湖城的猶他大學(xué)就讀，次年加入醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的JaredRutter教授實驗室，在其指導(dǎo)下進行博士論文研究，2009年5月答辯。2009年6月至今，在波士頓劍橋的諾華生物醫(yī)學(xué)研究所（NovartisInstitutesforBioMedicalResearch）進行博士后訓(xùn)練。郝淮湘，一位在美國諾華生物醫(yī)學(xué)研究所接受博后訓(xùn)練的80后大男71生物通：作為一名80后的年輕人，您可以說十分年輕，就已經(jīng)獲得生命科學(xué)領(lǐng)域的博士學(xué)位，能談?wù)勀鰢髮W(xué)的成長歷程嗎？可以給我們的青年讀者介紹一下在美國學(xué)習(xí)的感受嗎？郝淮湘：其實我拿到博士學(xué)位并不算早，花了將近六年（2003－2009），有人四年多就博士畢業(yè)了。來美國后第一年主要是上課和在四個實驗室輪轉(zhuǎn)（可以從將近100個實驗室選擇）。這邊上課沒有教科書，一門課多個教授授課，很多時候都是直接講文獻，一個部分上完就考一次試，記憶的東西不多，主要是分析能力。第二年的時候，我根據(jù)自己的興趣和對導(dǎo)師和課題的判斷加入了一個新成立的實驗室，跟年輕導(dǎo)師做研究雖然會辛苦一點，但是的確能學(xué)很多東西，也有機會了解如何建立實驗室和從頭構(gòu)思課題。在此后的5年里，我接觸了多個研究項目，一些失敗了，最后有兩個得以發(fā)表，并順利畢業(yè)?？傮w而言，我覺得美國的博士教育制度還是比較有效的。

生物通：作為一名80后的年輕人，您可以說十分年輕，就已經(jīng)獲得72生物通：在Science上發(fā)表文章很不容易，除了英語要過關(guān)外，您還有什么忠告給讀者嗎？郝淮湘：英語的確很重要，但不是最重要的，只要意思表達清楚就可以了，文章接受后編輯會幫助修改的。我覺得最重要的是課題的創(chuàng)新性和意義，所以設(shè)計課題的時候就應(yīng)該多考慮這兩個方面，把研究的起點抬高。最后寫文章的時候，也要盡可能突出這兩方面，尤其是在投稿的說明信（coverletter）和文章的摘要里。

生物通：在Science上發(fā)表文章很不容易，除了英語要過關(guān)外73生物通：在您的研究過程中，遇到最大的難題是什么？您是如何克服的？郝淮湘：曾經(jīng)有一段時間，SDH5課題無法進行下去，因為抑制子篩選（suppressorscreen）只能找到SDH5本身，而標(biāo)記的Sdh5蛋白又不溶，不能開展生化研究。我測試了至少十種去垢劑(detergent)和不同的濃度，效果并不好，后來偶然發(fā)現(xiàn)如果使用提純的線粒體，而不是全細(xì)胞，Sdh5蛋白就很易溶。這樣終于能兩步法提純蛋白做質(zhì)譜分析了，結(jié)果又發(fā)現(xiàn)Sdh5-TAP不能從抗體珠子上洗脫，最后換成Sdh5-His-HA，才解決了問題，研究馬上就有了突破。生物通：在您的研究過程中，遇到最大的難題是什么？您是如何克服74生物通：在諾華生物醫(yī)學(xué)研究所接受博后訓(xùn)練后，您對您未來的職業(yè)有什么規(guī)劃嗎？郝淮湘：我喜歡有應(yīng)用價值的研究，尤其是和疾病相關(guān)的。我之前研究的PASK激酶和肥胖與糖尿病有關(guān)，這次的SDH5是抑癌基因。兩個研究成果我們都申請了專利，希望將來可以成為藥物靶分子。諾華生物醫(yī)學(xué)研究所的博士后項目是一個很獨特的機會，既能做很學(xué)術(shù)化的研究，又能接觸藥物研發(fā)的過程，和我的研究理念很接近。在這里完成博士后訓(xùn)練之后，我希望能到生物制藥公司做研發(fā)。生物通：在諾華生物醫(yī)學(xué)研究所接受博后訓(xùn)練后，您對您未來的職業(yè)75

第三章物理圖繪制第三章物理圖繪制76用遺傳學(xué)技術(shù)作圖對于指導(dǎo)基因組計劃的測序階段還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因為遺傳圖譜的局限性：遺傳圖的分辨率有限：依賴于所得到的交換數(shù)目。遺傳圖的覆蓋面較低：重組熱點、極少重組區(qū)段的存在。遺傳圖的準(zhǔn)確率有限：環(huán)境因素和取樣誤差，分子標(biāo)記的排列有時會出現(xiàn)差錯。用遺傳學(xué)技術(shù)作圖對于指導(dǎo)基因組計劃的測序77物理圖譜是以物理距離來表示各遺傳標(biāo)記之間或DNA序列兩點之間在DNA分子上的位置，以實際的堿基對長度來度量其物理距離。物理圖譜是以物理距離來表示各遺傳標(biāo)記之間或DNA序列兩點之間781）限制性作圖（Restrictionmapping）：它是將限制性酶切位點標(biāo)定在DNA分子的相對位置。2）基于克隆的基因組作圖

(Clone-basedmapping)：根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊順序構(gòu)建重疊群

(Contig),繪制物理連鎖圖。3）熒光原位雜交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）：將熒光標(biāo)記的探針與染色體雜交確定分子標(biāo)記的所在位置。4）序列標(biāo)簽位點作圖

（Sequencetaggedsite,STS）：通過PCR或分子雜交將小段DNA序列定位在基因組的DNA區(qū)段中。物理圖繪制方法1）限制性作圖（Restrictionmapping）：793.1限制性作圖限制性內(nèi)切酶：Ⅰ型限制性內(nèi)切酶：催化宿主DNA甲基化，在識別位點約1000bp以外任何位置切割DNA鏈，不產(chǎn)生確定限制片段和明確條帶Ⅱ型限制性內(nèi)切酶：在識別位點之中或鄰近的確定堿基位置特異性切開DNA鏈，產(chǎn)生確定的限制性片段和條帶，是3類限制性內(nèi)切酶中唯一可用于限制性作圖的酶Ⅲ型限制性內(nèi)切酶：催化宿主DNA甲基化，在識別位點約25-27bp何位置切割DNA鏈，要求識別位點是反向重復(fù)序列，很少產(chǎn)生完全酶切的片段3.1限制性作圖限制性內(nèi)切酶：803.1.1限制性作圖的基本方法比較一種DNA分子被不同限制性內(nèi)切酶切割所產(chǎn)生的片段大小。首先用一種酶處理樣品后，電泳確定DNA片段的大小。然后用第二種酶處理，獲得第二組片段。最后用兩種酶混合處理，獲得第三組片段。收集上述資料進行對比組裝。兩種酶切位點交替出現(xiàn)的區(qū)段用加減法確定其的相對位置。連續(xù)出現(xiàn)2個或多個相同酶切位點的區(qū)段，采用部分酶解法（多個相同酶切位點區(qū)段只發(fā)生一次酶切）。切點過多時可以采用末端同位素標(biāo)記結(jié)合部分酶解進行繪圖。3.1.1限制性作圖的基本方法比較一種DNA分子被不同限制81§3Physicalmapping§3.2限制酶作圖限制酶作圖的基本方法8結(jié)論：圖譜II是正確的雙限制性酶切圖解片段結(jié)論0.2kb,0.5kb必然來自0.7kb的BamHI片段，其中有一個EcoRI的位點1.0kb這必然是一個不含EcoRI位點的BamHI片段，如果我們?nèi)缦路胖?.0kb的片段，就可以解釋1.5kbEcoRI片段的出現(xiàn)1.2kb,2.0kb這必然也是不含EcoRI位點的BamHI片段，它們必須位于3.4kb的EcoRI片段中。這樣就有兩種可能：BamHI部分限制性酶切的預(yù)測如果圖譜I是正確的，不完全消化產(chǎn)物應(yīng)該包括1.2+0.7=1.9kb的片段如果圖譜I是正確的，不完全消化產(chǎn)物應(yīng)該包括2.0+0.7=2.7kb的片段BamHI亞適條件§3Physicalmapping限制酶作圖的基本方法82限制性片段越大，切點越多，需要比較的片段也會增加，而且當(dāng)片段多到一定程度，一些大小相似的片段會重疊在一起，不可能組成一個清晰的圖譜。因此，限制性作圖更適合于小分子。實際應(yīng)用中如果DNA分子小于50kb，通?？梢赃x用識別6個核苷酸序列的限制酶來建立清晰的限制性圖譜。一個較簡單的變通策略使我們可以忽略大量的片段。這種方法是將標(biāo)記物加到要分析的DNA分子兩端，進行部分酶切處理后，很多產(chǎn)物成為不可見的，我們利用可見的部分大小，確定那些未定位的切點與DNA分子末端的相對位置。限制性片段越大，切點越多，需要比較的片段也會增加，而且當(dāng)片段83末端同位素標(biāo)記（或其他標(biāo)記）結(jié)合部分酶切：形成梯形分布帶末端同位素標(biāo)記（或其他標(biāo)記）結(jié)合部分酶切：形成梯形分布帶843.1.2限制性作圖的局限如果基因組較大，切點較多，單、雙、部分酶切的片段會很多。限制性作圖只能應(yīng)用于較小的DNA分子。

通過選擇靶DNA分子中的稀有酶切位點酶可以克服限制性酶切作圖的局限性。稀有切點限制酶:在基因組DNA順序中只有很少可識別序列的限制酶,一般識別位點在6-8堿基對之間,并含有高G/C比。稀有切點限制酶分為兩大類：識別具有7或8個核苷酸序列的酶；識別序列包含靶DNA稀少基序的酶。3.1.2限制性作圖的局限如果基因組較大，切點較多，單、雙85稀有切點限制圖繪制識別順序越長產(chǎn)生的片段越大，但當(dāng)識別位點含非特異順序時，片段長度小于預(yù)期；識別位點的堿基組成影響限制性片段的大小。高等生物基因組一般A/T比較高,應(yīng)選G/C高比例限制酶,如-GCGGCCGC-(NotI)限制酶識別位點較長，即使高等真核生物基因組也沒有這種序列，可以通過轉(zhuǎn)座或轉(zhuǎn)導(dǎo)將這類酶切位點引入待測基因組；基因組DNA甲基化對酶切位點出現(xiàn)頻率的影響。高等生物基因組DNA甲基化比例很高,但果蠅和酵母基因組無甲基化。稀有切點限制圖繪制識別順序越長產(chǎn)生的片段越大，但當(dāng)識別位點含86稀有切點限制酶稀有切點限制酶87選用稀有切點限制酶酶切大片段DNA預(yù)測稀有切點限制性內(nèi)切酶酶切片段大小1)根據(jù)稀有酶切位點限制酶識別堿基數(shù)推測產(chǎn)生的DNA片段長段:

NotI酶:GC/GGCCGC48=74536bp=75kb

I-SceI酶:TAGGGATAA/CAGGGTAAT418=90000000bp=90000kb2)由于多細(xì)胞真核生物基因組DNA存在大量的甲基化位點,識別CG序列的稀有酶切點限制酶實際產(chǎn)生的DNA片段比預(yù)期大得多.如NotI酶切人類基因組DNA產(chǎn)生的片段常在200kb以上，平均長度達到1Mb。選用稀有切點限制酶酶切大片段DNA1)根據(jù)稀有酶切位點限88PFGE的基本原理將一個方向不斷變換的電場，取代簡單的單一電場（單向電場，使電泳中受阻的DNA分子在電場改變時扭轉(zhuǎn)遷移方向，較小的分子比較大的分子重新排列的快，以此達到分離的目的。分辨率達到10Mb。常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳可分辨30kb以下的線性分子，脈沖凝膠電泳可分辨10Mb的大分子大片段DNA的分離技術(shù)——脈沖凝膠電泳PFGE的基本原理大片段DNA的分離技術(shù)——脈沖凝膠電泳89常規(guī)與非常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳正交變電場凝膠電泳3.脈沖凝膠電泳常規(guī)與非常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳正交變電場凝膠電泳90垂直交變電場電泳垂直交變電場(OFAGE)，有2對電極，分別位于凝膠對角線的兩端，2對電極輪流接通電場，產(chǎn)生一個交替的方向不同的電場，DNA分子在凝膠中不斷改變遷移方向。交變電場電泳主要用于相對分子量較大的DNA分子的分離。垂直交變電場電泳垂直交變電場(OFAGE)，91均一脈沖電泳均一脈沖電泳92大腸桿菌基因組物理圖大腸桿菌基因組物理圖933.2基于克隆的基因組作圖

---大分子DNA的克隆基于克隆的基因組作圖：根據(jù)克隆的DNA片段之間的重疊序列構(gòu)建重疊群(Contig)，繪制物理連鎖圖。3.2基于克隆的基因組作圖

---大分子DNA的克隆基于克943.2.1載體質(zhì)粒、噬菌體、粘?！【平湍富蚪M主要是先構(gòu)建粘粒文庫，然后建立克隆重疊群完成測序高等生物基因組擬南芥1.2X105bp，需要25000個克隆人類基因組是擬南芥基因組的33倍3.2.1大分子DNA克隆載體常規(guī)的質(zhì)粒載體不適用于大分子DNA的克隆。大分子DNA克隆載體構(gòu)建:YAC,BAC,PAC

3.2.1載體3.2.1大分子DNA克隆載體常規(guī)的質(zhì)粒95酵

母

人

工

染

色

體（YAC）端粒：用于保護線狀的DNA不被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。著絲粒：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。自主復(fù)制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進行雙向復(fù)制所必須的信號。端粒酵

母

人

工

染

色

體（YAC）端粒：用于保護線狀的D96YAC文庫裝載的DNA片段的大小一般可達200-500kb，有的可達1Mb以上。

YAC載體的工作原理YAC載體的工作原理97YAC的主要缺點：

1．存在高比例的嵌合體，即一個YAC克隆含有兩個本來不相連的獨立片段；

2．部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會發(fā)生缺失或重排；

3．難與酵母染色體區(qū)分開，因為YAC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu);

4．轉(zhuǎn)化效率低。

YAC的主要缺點：

1．存在高比例的嵌合體，即一個YAC克隆98噬菌體P1載體：與λ載體相似，將天然噬菌體基因組中的一段區(qū)域缺失，容量達125kb細(xì)菌人工染色體BAC：由大腸桿菌中F質(zhì)粒衍生，容量達300kb，單拷貝復(fù)制，穩(wěn)定，不會因重組發(fā)生嵌合P1人工染色體PAC：結(jié)合P1載體和BAC載體的優(yōu)點噬菌體P1載體：與λ載體相似，將天然噬菌體基因組中的一段區(qū)域99細(xì)菌人工染色體（BAC）：以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)，人工構(gòu)建的環(huán)狀的DNA分子?？梢詳y帶大于100-350Kb的外源DNA片段。選擇標(biāo)記：

氯霉素抗性基因等。

BAC載體的優(yōu)點：較為穩(wěn)定；沒有嵌合現(xiàn)象；轉(zhuǎn)化效率高；BAC克隆易于操作和DNA提取；BAC文庫篩選方便。細(xì)菌人工染色體（BAC）：以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)，人工構(gòu)建的環(huán)狀1003物理圖繪制匯總課件1013物理圖繪制匯總課件102質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pUC18/19,T-載體pGEM-3z等λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，Λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀〈10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli環(huán)狀100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體〉1000kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒載體的種類和特征質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例E.coli環(huán)狀〈8*pU103基因組文庫：指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機的同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了某種有機體整個基因組。1)目標(biāo)基因組大分子DNA的制備；2)載體制備；3)載體和DNA的連接；4)轉(zhuǎn)化；5)轉(zhuǎn)化子鑒定。YAC和BAC基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫：指將基因組DNA通過限制性內(nèi)切YAC和BAC基因104

目標(biāo)基因組大分子DNA的制備樣品→洗滌吸干水分→液氮冷凍→碾碎→離心收集細(xì)胞核→低融點瓊脂糖包埋→蛋白酶消化→洗滌→限制酶部分酶解目標(biāo)基因組大分子DNA的制備樣品→洗滌吸干水分→液氮105插入大分子DNA的分離插入大分子DNA的分離106載體制備與插入DNA連接1)YAC載體：制備過程與一般質(zhì)粒載體相同。2)BAC載體：低拷貝載體，大量制備，超離心純化。3)酶切：釋放接頭，接頭去磷，減少自連。4)連接：將含有大分子DNA的瓊脂糖薄片與載體混合,按重量比1:1，680C保溫5min，降溫至370C，加入連接酶過夜。載體制備與插入DNA連接1)YAC載體：107染色體步移3.2.2重疊群組建相互重疊的DNA片段組成的物理圖稱為重疊群(contig)。構(gòu)建重疊群：步移法和指紋法染色體步移3.2.2重疊群組建相互重疊的DNA片段組成的物108

3.2.3指紋作圖—3種指紋在基因組范圍內(nèi)查找重疊的克隆，最好的方法是克隆指紋排序。指紋指克隆的DNA序列所具有的特定的DNA片段組成。指紋重疊，表明2個克隆具有共同的區(qū)段，兩個片段相鄰排列。3.2.3指紋作圖—3種指紋在基因組范圍內(nèi)查找重疊的克109指紋作圖限制性帶型指紋：用不同限制性酶處理樣品，凝膠分析，DNA條帶有部分相同，說明它們含有重疊的序列重復(fù)序列DNA指紋：不同克隆酶解電泳，轉(zhuǎn)移到雜交膜中，用一種或幾種基因組范圍的重復(fù)序列作為探針雜交，出現(xiàn)相同的雜交帶型，說明重疊重復(fù)序列DNAPCR：設(shè)計與重復(fù)序列互補的引物，對檢測的克隆進行PCR擴增，相同的產(chǎn)物，說明重疊STS目錄作圖：STS是已知的單一序列。設(shè)計引物，對大量的單個克隆進行PCR擴增指紋作圖110限

制

性

片

段

指

紋

作

圖

原

理限

制

性

片

段

指

紋

作

圖

原

理111限制性片段指紋電泳圖限制性片段指紋電泳圖112指紋重疊群構(gòu)建指紋重疊群構(gòu)建113酵母基因組遺傳圖與物理圖的整合酵母基因組遺傳圖與物理圖的整合1143.3原位染色體連鎖圖原位染色體連鎖圖：通過原位雜交的方法將基因或DNA分子標(biāo)記定位在染色體的某一區(qū)段，由此繪制圖稱為原位染色體連鎖圖。最常用的細(xì)胞圖繪制技術(shù)為熒光原位雜交。（fluorescentinsituhybridization,FISH）原位雜交是以標(biāo)記的DNA分子為探針，檢測完整染色體的一種雜交分析方法，其必須使染色體DNA成為單鏈。3.3原位染色體連鎖圖原位染色體連鎖圖：通過原位雜交的方115熒光原位雜交熒光原位雜交116

原位雜交的操作

染色體分裂細(xì)胞染色體變性檢測信號早期的原位雜交用的標(biāo)記是放射性標(biāo)記，但放射性標(biāo)記很難同時滿足靈敏度和分辨率兩個原位雜交的必要條件。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的熒光標(biāo)記解決了這一矛盾。為了得到高靈敏度，探針的標(biāo)記量要盡可能大一些，以往的探針至少40kb?，F(xiàn)在由于強信號熒光物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和重標(biāo)記技術(shù)的發(fā)明，對探針長度的要求已經(jīng)不那么嚴(yán)格了。甲酰胺處理加入探針原位雜交的操作甲酰胺處理加入探針117一種封閉雜交探針中重復(fù)序列的方法一種封閉雜交探針中重復(fù)序列的方法118如何提高熒光原位雜交的分辨率？原位雜交的分辨率與染色體的制備有關(guān)：中期染色體：過于收縮，其分辨率1000kb，主要用于發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)記屬于哪條染色體；機械伸展的中期染色體：離心可使中期染色體伸張，保持形態(tài)，提高分辨率200—300kb；非中期染色體：松弛狀態(tài)，分辨率可達到25kb以下，用于小區(qū)段分子標(biāo)記排序研究。如何提高熒光原位雜交的分辨率？原位雜交的分辨率與染色體的制備119

限制性作圖不能用于大型基因組；

克隆重疊群復(fù)雜，費時費力；

FISH難于操作，數(shù)據(jù)積累慢。目前最有效的物理作圖技術(shù)，也是能對大型基因組產(chǎn)生最詳盡圖譜的技術(shù)，是STS作圖，主要為輻射雜種作圖。3.4輻射雜種作圖限制性作圖不能用于大型基因組；3.4輻射雜120序列標(biāo)記位點(STS)是一段短的DNA序列，其長度通常為100—500bp。一段DNA序列要成為STS需滿足兩個條件：1.它的序列必須是已知的，便于PCR檢測；2.STS必須在擬研究的染色體上有唯一的定位。尋找STS的方法:1）從EST序列中尋找：來自cDNA，EST來自單拷貝的基因時可作為STS2）SSLP：具有多態(tài)性并已在連鎖分析中定位隨機基因組序列3）隨機基因組序列：在數(shù)據(jù)庫中尋找所感興趣的某些序列3.4.1序列標(biāo)記位點序列標(biāo)記位點(STS)是一段短的DNA序列，其長度通常為10121STS作圖原理兩個STS出現(xiàn)在同一片段的機會取決于他們在基因組中的距離，彼此靠的越近，分離的幾率越小，彼此相隔越遠(yuǎn)，分離的幾率越大。兩個STS之間相對距離的估算與連鎖分析的原理一樣，它們之間的圖距根據(jù)它們的分離頻率來算。STS作圖原理兩個STS出現(xiàn)在同一片段的機會取決于他們在基因122STS作圖原理圖示(1)STS作圖原理圖示(1)123STS作圖與連鎖分析是一樣的，不同之處僅在于兩個標(biāo)記間的圖距是根據(jù)分離頻率來計算的。主要采用的方法是輻射雜種作圖。STS作圖與連鎖分析是一樣的，不同之處僅在于兩個標(biāo)記間的圖距124輻射雜種（放射雜交體）：指含有另一種生物染色體片段的嚙齒類細(xì)胞。輻射雜種群（radiationhybridpanel)：通過放射雜交產(chǎn)生的融合細(xì)胞群稱為輻射雜種群。輻射雜種群分為兩類：全基因組輻射雜種群單染色體輻射雜種群3.4.2輻射雜種作圖的程序與方法輻射雜種（放射雜交體）：指含有另一種生物染色體片段的嚙齒類細(xì)125全基因組輻射雜種的篩選并非所有參與融合的鼠類細(xì)胞都會保留來自人類的染色體片段，因此要對其進行鑒別:使用不能產(chǎn)生胸腺激酶（TK)或者次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPRT)的倉鼠細(xì)胞系作受體。這種細(xì)胞在添加了次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)基（HAT）中不能存活。只有獲得人體DNA中TK和HPRT基因的倉鼠細(xì)胞才能在HAT選擇性培養(yǎng)基中生長。全基因組輻射雜種的篩選并非所有參與融合的鼠類細(xì)胞都會保留來126Z之后，可通過PCR檢測STS標(biāo)記，根據(jù)成對STS出現(xiàn)頻率，判斷標(biāo)記是否連鎖及連鎖程度Z之后，可通過PCR檢測STS標(biāo)記，根據(jù)成對STS出現(xiàn)頻率127單染色體輻射雜種群構(gòu)建：用x射線照射另外一類含一條人染色體的嚙齒類（如小鼠）細(xì)胞系，再將這種細(xì)胞與倉鼠細(xì)胞融合。篩選：用人類基因組廣泛分布的重復(fù)序列如Alu（一類SINE)做探針，篩選只含有人染色體片段的雜種細(xì)胞。單染色體輻射雜種群構(gòu)建：用x射線照射另外一類含一條人染色體的128輻射雜種圖距單位

輻射雜種的作圖單位為厘鐳(centiRay,cR)：DNA分子暴露在N拉徳(rad)X射線劑量下兩個分子標(biāo)記之間發(fā)生1%斷裂的機率。利用類似于遺傳重組原理和最大似然性的統(tǒng)計學(xué)方法來計算存在于DNA片段上的STS之間的斷點頻率，以此估計標(biāo)記之間的距離。輻射雜種圖距單位輻射雜種的作圖單位為厘鐳(centi129人類21號染色體輻射雜種圖人類21號染色體輻射雜種圖130人類21號染色體輻射雜種物理圖探針探針排列次序，以及相鄰一對探針之間的圖距人類21號染色體輻射雜種物理圖探針探針排列次序，以及相鄰一對1313物理圖繪制匯總課件1323.5遺傳

圖物

理圖

的整合釀酒酵母chr3遺傳圖與物理圖的比較因為分子標(biāo)記在染色體上的位置是特定的，可以通過分子標(biāo)記將遺傳圖和物理圖聯(lián)系起來，通過比對查找錯誤，并重新驗證。3.5釀酒酵母chr3遺傳圖與物理圖的比較因為分子標(biāo)記在染色133人類基因組物理圖譜:人類基因組序列開始測定時，已有45萬個EST，其中有一些重復(fù)序列，經(jīng)計算機分析篩選后得到49625個。再從中篩選出3萬個EST、2個輻射雜交系庫（分別有83和93個細(xì)胞株）、1個有32000個克隆的YAC文庫，用于構(gòu)建物理圖譜。構(gòu)建物理圖譜的密度為每個標(biāo)記183Kb。EST分布結(jié)果表明，基因在染色體上的排列是不均勻的。將物理圖譜和遺傳圖譜整合而成更加完整的人類基因組圖譜，作為基因組測序的框架和分析的依據(jù)。人類基因組物理圖譜:1341）1987年，發(fā)表遺傳圖，含403個標(biāo)記，密度為10Mb；2)1994年,發(fā)表遺傳圖,含5800個標(biāo)記,密度為0.7Mb.3)1993年，發(fā)表重疊群物理圖，含33000個YAC;4)1995年,發(fā)表STS圖,含15086個標(biāo)記,密度為199kb.5)1996年,發(fā)表遺傳圖,含7050個標(biāo)記,密度為600kb.6)1996年,發(fā)表物理圖,含17096個標(biāo)記,密度達100kb.7)STS圖中含7000多個SSLP,使遺傳圖與物理圖彼此銜接,成為測序的框架圖.人類基因組圖1）1987年，發(fā)表遺傳圖，含403個標(biāo)記，密度為10Mb；135圖譜的應(yīng)用---定位克?。▓D位克隆）定位克?。╬ositionalcloning）：利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶并對目的基因進行克隆。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置?？寺。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進一步研究其功能。圖譜的應(yīng)用---定位克?。▓D位克?。┒ㄎ豢寺。╬ositio1363物理圖繪制匯總課件137定位克隆的主要目的之一是將目標(biāo)基因定位于特定染色體上。

A-1型短指（趾）癥：法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論文中首先報道了這一病癥，即世界上第一例孟德爾常染色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學(xué)的經(jīng)典例子被全世界的生物學(xué)和遺傳學(xué)教材廣泛引用。定位克隆的主要目的之一是將目標(biāo)基因定位于特定染色體上。138賀林等利用布依族、苗族和漢族的三個A-1型短指（趾）癥大家系，對該病的致病基因進行了精確定位（位點定在2q35-36區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因上的三個突變位點是導(dǎo)致A-1型短指（趾）癥的直接原因。賀林等利用布依族、苗族和漢族的三個A-1型短指（趾）癥大家系139番茄抗病基因的圖位克隆番茄抗病基因的圖位克隆140定位候選克隆該方法是定位克隆的進一步發(fā)展。將疾病相關(guān)基因定位于染色體相關(guān)區(qū)域；該染色體區(qū)域得到若干候選基因；進一步分析得到目的cDNA；蛋白質(zhì)功能研究。疾病染色體定位若