乙?；揎椂康鞍踪|(zhì)組學(xué)含案例

主要內(nèi)容乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)簡介乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)原理乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)優(yōu)勢乙?；揎棇嶒灹鞒桃阴；揎棇嶒灲Y(jié)果示例乙酰化修飾實驗詳細(xì)步驟經(jīng)典案例第一頁，共二十四頁。乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)簡介

蛋白質(zhì)的乙酰化修飾是在乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下，蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上添加乙?；倪^程，是細(xì)胞控制基因表達(dá)、蛋白質(zhì)的活性或生理過程的一種機(jī)制。

最近的調(diào)查表明，蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基的乙酰化普遍存在于人體的代謝酶之中，具有調(diào)節(jié)代謝通路及代謝酶的活性。乙?；且粋€普遍和重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，主要集中在對細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)的影響以及對核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活方面

，還影響參與細(xì)胞周期和新陳代謝、肌動蛋白聚合控制，蛋白的乙酰化狀態(tài)調(diào)節(jié)受損的癌癥和多聚谷氨酰胺疾病。蛋白質(zhì)的乙?；哂泻芨叩墓δ芴禺愋?，與腫瘤等等疾病密切相關(guān)，也是目前正在開發(fā)的抗癌藥物的靶點(diǎn)。通過高通量的蛋白質(zhì)組研究和不同物種的代謝通路研究發(fā)現(xiàn)，在生理狀況下，存在著大量非細(xì)胞核的蛋白質(zhì)被乙酰化修飾，具有廣泛的生物學(xué)意義。第二頁，共二十四頁。乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)原理技術(shù)原理

賴氨酸發(fā)生乙?；牡鞍讓Ω鞣N生物功能進(jìn)行調(diào)控。實驗基于特異性識別乙?；嚢彼釟埢囊阴；贵w，對含有乙?；揎椀馁嚢彼犭亩芜M(jìn)行富集。乙?；蟮碾亩?，質(zhì)量發(fā)生42Da的質(zhì)量變化，基于非標(biāo)定量的質(zhì)譜方法對乙?；亩芜M(jìn)行鑒定。

如：組蛋白乙?；喟l(fā)生在核心組蛋白N一端堿性氨基酸集中區(qū)的特定賴氨酸殘基，將乙酰輔酶A的乙酰基轉(zhuǎn)移到賴氨酸的sNH3+中和掉1個正電荷。組蛋白乙酰化水平是由組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(histone

acetyltmnsferse，HATs)和組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(histone

deacetylase，HDACs)共同決定。在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白乙?；c組蛋白去乙?；^程處于動態(tài)平衡，精確地調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。第三頁，共二十四頁。乙?；揎椃菢?biāo)定量技術(shù)優(yōu)勢乙?；贵w：特異性識別乙酰化賴氨酸殘基；精準(zhǔn)鎖定目標(biāo)范圍。靈敏度高：可檢測出低豐度蛋白；分離能力強(qiáng):可分離出酸/堿性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、難溶性蛋白等；適用范圍廣：可以對任何類型的蛋白質(zhì)乙?；M(jìn)行鑒定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：不受樣本數(shù)據(jù)限制，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析；結(jié)果可靠：定性與定量同步進(jìn)行，同時給出每一個組分的相對表達(dá)水平、分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；自動化程度高：液質(zhì)聯(lián)用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。第四頁，共二十四頁。乙?；揎棇嶒灹鞒桃阴；揎棇嶒灹鞒?。

1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質(zhì)；

2：蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉后用胰蛋白酶酶切；

3：各組樣本肽段進(jìn)行純化；

4：各組樣本的肽段分別用乙?；贵w試劑進(jìn)行富集，并RP分離餾分；

5：Q-Exactive質(zhì)譜檢測，定性及定量分析；6：流程化生物信息分析及個性化設(shè)計生物信息服務(wù)蛋白質(zhì)樣品制備樣品及實驗預(yù)判酶解乙?；贵w富集RP分解質(zhì)譜分析軟件分析定性定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果統(tǒng)計學(xué)、生物信息分析第五頁，共二十四頁。乙酰化修飾實驗結(jié)果示例小鼠的肌肉樣本：乙?；揎棇嶒灒?例樣本：A、B、C、D）1:提取各組蛋白質(zhì)，定量并用胰酶酶切；2.各組肽段純化，并用乙?；揎椏贵w進(jìn)行富集；3.

RP分離和質(zhì)譜分析.

4:不同樣本中乙?；揎椀牟町惐磉_(dá)可通過二級質(zhì)譜中峰面積確定5.根據(jù)該肽段的二級質(zhì)譜峰圖，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，得到蛋白的定性及定量信息。質(zhì)譜掃描完畢，得到質(zhì)譜信號總圖橫坐標(biāo)是洗脫時間，縱坐標(biāo)是信號強(qiáng)度。第六頁，共二十四頁。乙?；揎棇嶒灲Y(jié)果示例4例樣本共鑒定到1449個蛋白，肽段6879個，乙酰化修飾肽段637個。乙?；揎椀牟町惙治鋈缦拢簝蓛杀容^顯著差異B/A189C/B202D/C248C/A243D/A273第七頁，共二十四頁。鑒定到的蛋白列表-結(jié)果第八頁，共二十四頁。鑒定到的肽段列表-結(jié)果第九頁，共二十四頁。乙酰化修飾實驗結(jié)果示例

生物信息數(shù)據(jù)交蓋圖

原始數(shù)據(jù)表達(dá)量圖第十頁，共二十四頁。表達(dá)量分布圖

箱線圖第十一頁，共二十四頁。GO富集分析第十二頁，共二十四頁。Pathway通路富集分析第十三頁，共二十四頁。高階（客制化）信息分析詳見信息分析PDF第十四頁，共二十四頁。乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實驗步驟1：蛋白質(zhì)提取

提供專業(yè)的樣本制備，與后期翻譯后修飾富集、液相、質(zhì)譜完美對接。注意事項：1、樣本不要反復(fù)凍融。收集后立即放于液氮中或-80°冰箱保存。2、原始樣本濕重大于1g，根據(jù)不同樣本得率情況盡量多提供原始樣本。3、提得的蛋白大于5mg，可完成一次正常富集。若樣本珍貴難獲取，最少2mg可完成一次實驗。第十五頁，共二十四頁。乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實驗步驟2：蛋白質(zhì)定量

(1)可以采用Bradford方法及其他方法定量初步

(2)定量取各組樣本的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS電泳，考染定量，根據(jù)每個涌道染色情況微調(diào)蛋白濃度，保證后續(xù)實驗中每組樣本的蛋白量相同。第十六頁，共二十四頁。乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實驗步驟3：酶切，富集每組樣本（各5mg）分別加入-20℃預(yù)冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20℃沉淀30min~4h12000rpm離心15分鐘，棄上清，用lysisbuffer充分混懸溶解樣品；加入還原試劑2μL，混勻，60℃反應(yīng)1h；加入半胱氨酸封閉試劑1μL,室溫處理10分鐘；按照酶：蛋白質(zhì)=1：100的比例加入trypsin酶,37℃酶解過夜（16h）；收集肽段，純化，真空冷凍干燥。乙?；贵w富集RP分離質(zhì)譜檢測第十七頁，共二十四頁。乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實驗步驟4：除鹽，此步操作是將實驗過程和相關(guān)buffer的鹽除去，以便于后續(xù)分析。（1）100%乙腈沖洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上（4）0.1%TFA沖洗柱子3~5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400μL洗脫下樣品（6）將樣品冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)分析。第十八頁，共二十四頁。乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實驗步驟5:RP液相分離或手動RP（1）儀器及試劑：渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-901）離心機(jī)（Thermo，型號：PICO17）RIGOLL-3000高效液相色譜系統(tǒng)（北京普源精電科技有限公司）色譜柱：Durashell-C18，4.6mm×250mm，5μm，100?（Agela，貨號：DC952505-0）乙腈（Merck，貨號：100030，德國）氨水（Sigma-Aldrich，貨號：17837，美國）流動相A：98%ddH2O，2%乙腈（pH10）-流動相B：98%乙腈，2%ddH2O（pH10）ddH2O用氨水調(diào)pH值到10

第十九頁，共二十四頁。（2）樣品用100ul流動相A溶解，14000g離心20min，取上清待用。

（3）使用酶解好的BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離測試（柱溫45℃，檢測波長214nm），檢測系統(tǒng)情況。取100ul準(zhǔn)備好的樣本上樣。

流速0.7ml/min，分離梯度如右圖所示：（4）根據(jù)峰型和時間共收取梯度,根據(jù)規(guī)則合并，真空離心濃縮后，待質(zhì)譜分析。質(zhì)譜鑒定：MS掃描范圍400-1800MS/MS掃描范圍100-2000時間（分鐘）流動相B比例（%）05583518623264956895725第二十頁，共二十四頁。乙?；揎椩敿?xì)實驗步驟6:納升級反相色譜-QExactive進(jìn)行蛋白質(zhì)分析（1）儀器及試劑：渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：QL-901）離心機(jī)（Thermo，型號：PICO17）高效液相色譜儀：（ThermoScienticEASY-nLC1000System（NanoHPLC））質(zhì)譜系統(tǒng)（Thermo，型號：Q-Exactive）

流動相A：100%超純水，0.1%甲酸流動相B：100%乙腈，0.1%甲酸甲酸：（Sigma-Aldrich，貨號：56302，美國）甲醇：（Sigma-Aldrich，貨號：14262，美國）預(yù)柱（AcclaimPepMap100column，2cmx100μm，C18，5μm）色譜柱（EASY-Spraycolumn，12cmx75μm，C18，3μm）進(jìn)樣瓶（Thermo，11190533）瓶蓋（Thermo，11150635）噴針（Thermo，PN：ES542）第二十一頁，共二十四頁。

（2）具體操作參數(shù)

時間（分鐘）流動相B比例（%）045154025653570958295854904將高pH反相分離得到的組份用20μl2%甲醇，0.1%甲酸復(fù)溶。12,000轉(zhuǎn)離心10分鐘，吸取上清上樣。上樣體積10μl，采取夾心法上樣。LoadingPump流速350nl/min，15分鐘。分離流速350nl/min，分離梯度如下：第二十二頁，共二十四頁。乙?；菢?biāo)定量詳細(xì)實驗步驟7:

數(shù)據(jù)檢索乙?；菢?biāo)定量的質(zhì)譜分析是由ThermoQ-Exactive型質(zhì)譜完成，產(chǎn)生的質(zhì)譜原始文件采用MaxQuant軟件處理。檢索參數(shù)設(shè)置如下：參數(shù)名稱實驗選項FixedmodificationCarbamidomethyl(C)VariablemodificationOxidation（M），Acetyl（K），Acetyl（N-term）peptidetol.15ppmMS/MStol20mmuMaxmissedcleavages2InstrumentQ_ExactiveEnzymeTrypsinDatabaseuniport_第二十三頁，共二十四頁。乙酰化修飾經(jīng)典案例案例：實驗設(shè)計：3組