密度梯度離心法課件

第三章離心技術(shù)

離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到一個(gè)外向的離心力的行為發(fā)展起來(lái)的一種分離分析技術(shù)。

第三章離心技術(shù)離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻速1貝克曼庫(kù)爾特離心技術(shù)發(fā)展里程碑

1947

ModelE全球首臺(tái)分析型超速離心機(jī)。1947

ModelL全球首臺(tái)制備型超速離心機(jī)。1963

Type50Ti全球首個(gè)鈦金屬轉(zhuǎn)頭。1974

MicrofugeB全球首臺(tái)微量離心機(jī)。1976

TJ-6R全球首臺(tái)冷凍臺(tái)式超速離心機(jī)。貝克曼庫(kù)爾特離心技術(shù)發(fā)展里程碑1947

Model21979

L8Series全球首先采用微機(jī)控制及感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的超速離心機(jī)系列。1982

J21-M全球首臺(tái)采用感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的高速離心機(jī)。1984

TL-100全球首臺(tái)微量臺(tái)式超速離心機(jī)。1989

OptimaSeries首先采用半導(dǎo)體制冷的驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)的超速離心機(jī)系列。1989

NVT創(chuàng)新的近垂直轉(zhuǎn)頭,可快速提純DNA樣品。1991

OptimaXL-A重新設(shè)計(jì)的分析型超速離心機(jī)。1979

L8Series全球首先采用微機(jī)控制及感31994

AvantiJ全球獨(dú)有,利用可變磁阻驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)的高效離心。1996

OptimaXL-I擁有兩種檢測(cè)系統(tǒng)的分析型超速離心機(jī)。1998

OptimaMAX全球首臺(tái)超過(guò)一百萬(wàn)離心力的臺(tái)式超速離心。1998

ARIES全球獨(dú)有可以自我修正平衡的轉(zhuǎn)頭。2002

OptiamL-XP全球首先采用觸幕式操作的超速離心機(jī)。2004

AllegraX-12全球唯一可處理細(xì)胞培臺(tái)式離心機(jī)。1994

AvantiJ全球獨(dú)有,利用可變磁阻驅(qū)動(dòng)4離心技術(shù)的應(yīng)用：1、應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)：如化工、制藥、食品等工業(yè)大型制備。離心機(jī)轉(zhuǎn)速都在每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。2、應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)室分析研究：分離和純化樣品，以及對(duì)純化樣品的有關(guān)性能進(jìn)行研究。

離心技術(shù)的應(yīng)用：5第一節(jié)基本原理

一、離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）

離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：Fc=mω2X其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開(kāi)旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。第一節(jié)基本原理一、離心力（centrifugalf6

二、相對(duì)離心力（relativecentrifugalforce，RCF）由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。一般情況下，低速離心時(shí)常以r／min來(lái)表示，高速離心時(shí)則以g(或數(shù)字Xg)表示。

二、相對(duì)離心力（relativecentrifugal7RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。

RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。8Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對(duì)應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖。見(jiàn)圖4-1。在用圖4-1將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對(duì)離心力時(shí)，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對(duì)應(yīng)的離心力925.4cm4200rpm25.4cm4200rpm10例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來(lái)交于RCF標(biāo)尺，此交點(diǎn)500×g即是RCF值。

例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，11

三、沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，S）1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。三、沉降系數(shù)（sedimentationcoeffici12若ω用2πn/60表示，則式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。若ω用2πn/60表示，則式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離13S實(shí)際上時(shí)常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱(chēng)為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫(xiě)S，單位為秒。即：1S=10-13秒例：某物質(zhì)的沉降系數(shù)是10-12秒可寫(xiě)成：10×10-13秒表示為：10S如：核蛋白體為70SS實(shí)際上時(shí)常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱(chēng)為14

細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)某些成分的沉降系數(shù)及其離心條件名稱(chēng)沉降系數(shù)/SRCF/g轉(zhuǎn)速（rpm）細(xì)胞﹥107﹤200﹤1500細(xì)胞核4×106-7600~8003000線粒體2×104~

7×10470007000DNA10~1202×10540000RNA4~504×10560000Pr2~2574×105﹥60000細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)某些成分的沉降系數(shù)及其離心條件15四、沉降速度（sedimentationvelocity）

沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρP為粒子的密度；ρm為介質(zhì)的密度。四、沉降速度（sedimentationvelocity）16

從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場(chǎng)增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項(xiàng)沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：①當(dāng)ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和17五、沉降時(shí)間（sedimentationtime，Ts）在實(shí)際工作中，要將某種物質(zhì)從溶液中分離出來(lái)，必須知道所需轉(zhuǎn)速與時(shí)間。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時(shí)間來(lái)確定分離某粒子所需的時(shí)間。根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：

五、沉降時(shí)間（sedimentationtime，Ts）18積分得：式中X2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時(shí)間（t2－t1）用Ts表示則式可改為：式中Ts以小時(shí)為單位，S以Svedberg為單位。積分得：19六、K系數(shù)（kfactor）

K系數(shù)是用來(lái)描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來(lái)的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個(gè)指數(shù)，所以也叫“cleaningfactor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。其中Rmax為轉(zhuǎn)子最大半徑；Rmin為轉(zhuǎn)子最小半徑。六、K系數(shù)（kfactor）20由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個(gè)變數(shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)速變，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時(shí)，K系數(shù)就改變。通常，離心機(jī)的轉(zhuǎn)子說(shuō)明書(shū)中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計(jì)算出來(lái)的數(shù)值。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系21如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計(jì)沉降到管底所需的離心時(shí)間是T＝k/S＝4h，利用此公式預(yù)估的離心時(shí)間，對(duì)水平式轉(zhuǎn)子最適合；對(duì)固定角式轉(zhuǎn)子而言，實(shí)際時(shí)間將比預(yù)估的時(shí)間來(lái)得快些。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，22

第二節(jié)離心機(jī)一、離心機(jī)的分類(lèi)按轉(zhuǎn)速的大小(機(jī)頭的額定最高轉(zhuǎn)速)分為:①低速離心機(jī)：<10×103r／min②高速離心機(jī)：10×103~25×103r／min)③超速離心機(jī)：>30×103r／min第二節(jié)離心機(jī)一、離心機(jī)的分類(lèi)23類(lèi)型普通離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速(r/min)600025000可達(dá)75000以上最大RCF（g）600089000可達(dá)510000以上分離形式固液沉淀固液沉淀分離密度梯度區(qū)帶分離或差速沉降分離轉(zhuǎn)子角式和外擺式角式、外擺式角式、外擺式、區(qū)帶儀器結(jié)構(gòu)速率不能?chē)?yán)格控制，有消除空氣和轉(zhuǎn)子間備有消除轉(zhuǎn)子與空氣摩擦性能和特點(diǎn)多數(shù)室溫下操作摩擦熱的制冷裝置，熱的真空和冷卻系統(tǒng)，有速率和溫度控制較準(zhǔn)更為精確的溫度和速度控確、嚴(yán)格。制、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、有保證轉(zhuǎn)子正常運(yùn)轉(zhuǎn)的傳動(dòng)和制動(dòng)裝置等。應(yīng)用收集易沉降的大顆粒收集微生物、細(xì)胞主要分離細(xì)胞器、病毒、（如RBC、酵母細(xì)胞等）碎片、大細(xì)胞器、核酸、蛋白質(zhì)、多糖等甚至硫酸銨沉淀物和免疫能分開(kāi)分子大小相近的同位沉淀物等。但不能有素標(biāo)記物15N-DNA和未效沉淀病毒、小細(xì)胞器標(biāo)記的DNA。

（如核糖體）、蛋白質(zhì)等大分子。類(lèi)型24二、離心機(jī)的結(jié)構(gòu)低速離心機(jī)：其主要部件是電機(jī)和轉(zhuǎn)軸。高速、超速離心機(jī)：驅(qū)動(dòng)電機(jī)、制冷系統(tǒng)真空系統(tǒng)（超速離離心機(jī)有）顯示系統(tǒng)、自動(dòng)保護(hù)系統(tǒng)控制系統(tǒng)組成二、離心機(jī)的結(jié)構(gòu)25三、離心轉(zhuǎn)子和離心管

（一）離心轉(zhuǎn)子離心轉(zhuǎn)子是超速、高速離心機(jī)的主要部件之一。由于超速、高速離心機(jī)工作時(shí)的轉(zhuǎn)速很高，相應(yīng)的離心力場(chǎng)則很大，離心轉(zhuǎn)頭均用高強(qiáng)度的鋁合金、鈦合金及超硬鋁、鍛鋁制成。三、離心轉(zhuǎn)子和離心管261、離心轉(zhuǎn)頭的分類(lèi)（1）角轉(zhuǎn)子(nxedanglerotor)角轉(zhuǎn)子是各種類(lèi)型離心機(jī)的基本轉(zhuǎn)子和最高速轉(zhuǎn)子。特點(diǎn)：角轉(zhuǎn)頭常用鋁或鈦合金制作，呈圓錐形。角轉(zhuǎn)頭中離心管的中心線與旋轉(zhuǎn)軸的夾角一般在15°~40°之間。優(yōu)點(diǎn)：具有強(qiáng)度高，重心低，運(yùn)轉(zhuǎn)平穩(wěn)，離心時(shí)間短，壽命長(zhǎng)，使用方便等。1、離心轉(zhuǎn)頭的分類(lèi)27缺點(diǎn)：具有壁效應(yīng)，即靠近離心管外壁部形成強(qiáng)烈對(duì)流和渦旋，影響分離純度。應(yīng)用：常用于差速離心來(lái)分離s（沉降系數(shù)）值相差較大（1：10）的樣品。規(guī)格：角轉(zhuǎn)頭的規(guī)格較多，常見(jiàn)的有32×15ml，6×50ml等。缺點(diǎn)：具有壁效應(yīng)，即靠近離心管外壁部形成強(qiáng)烈對(duì)流和渦旋，影響28（2）水平轉(zhuǎn)頭(swing-outrotor)特點(diǎn)：鋁合金或鈦合金制成。離心管放人吊籃中，離心時(shí)，離心管中心線與旋轉(zhuǎn)中心線由平行而逐漸變?yōu)榇怪薄p少了由于對(duì)流和渦旋而引起的壁效應(yīng)，提高了分離純度。增加了沉降距離，所以離心時(shí)間也相應(yīng)增長(zhǎng)。用途：速度區(qū)帶離心（2）水平轉(zhuǎn)頭(swing-outrotor)29（3）垂直轉(zhuǎn)頭(verticalrotor)特點(diǎn)：垂直轉(zhuǎn)頭是一種角度轉(zhuǎn)頭，離心管垂直放置。離心管與。應(yīng)用：等密度區(qū)帶離心sucrose速度區(qū)帶離心（3）垂直轉(zhuǎn)頭(verticalrotor)30

通常將離心管(加離心管帽或加可熱封的塑料管)密封后垂直插入轉(zhuǎn)頭內(nèi)。離心前，離心管中的樣品液受重力的作用液面呈水平分布。離心時(shí)，由于離心力作用使液面由水平分布轉(zhuǎn)為垂直分布，被分離顆粒沉降在后半管壁。這種由于離心作用使液面重新轉(zhuǎn)向分布稱(chēng)為再定向。通常將離心管(加離心管帽或加可熱封的31圖（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管轉(zhuǎn)子圖（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管322、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)

（1）轉(zhuǎn)頭標(biāo)記的意義

①符號(hào)：角度轉(zhuǎn)頭FA，垂直轉(zhuǎn)頭V；甩平轉(zhuǎn)頭Sw；連續(xù)轉(zhuǎn)頭CF；區(qū)帶轉(zhuǎn)頭Z。②英文字母后的數(shù)字表示該轉(zhuǎn)頭的最大額定轉(zhuǎn)速。③Ti表示由鈦或鈦合金為材料制成的轉(zhuǎn)頭，不標(biāo)則為鋁或鋁合金做成的轉(zhuǎn)頭。如：SW65Ti指該轉(zhuǎn)頭為甩平轉(zhuǎn)頭，最大額定轉(zhuǎn)速為65000r／min，轉(zhuǎn)頭由鈦金屬制成。2、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)33(2)轉(zhuǎn)頭參數(shù)Rmax：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最外緣或離心管底的距離；Rmin：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最內(nèi)緣或離心管頂?shù)木嚯x；RPMmax：轉(zhuǎn)頭的最高安全轉(zhuǎn)速；FRCmax：轉(zhuǎn)頭以只fM，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，在Rrna~處的相對(duì)離心力；

FRCmin：轉(zhuǎn)頭以RPMmax運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，在Rmin處的相對(duì)離心力；K：衡量轉(zhuǎn)頭相對(duì)效率的量，K值愈小，效率愈高，所需離心時(shí)間就愈短。(2)轉(zhuǎn)頭參數(shù)34（二）離心管常用的塑料離心管:聚乙烯管(PE)、纖維素管(CAB)、聚碳酸酯管(PC)和丙二醇酯管(PP)等。離心管有各種大小:1.5ml到1000ml。（二）離心管35選擇離心管時(shí)應(yīng)考慮下列的一些性能。1)

容量：由樣品的體積決定。注意在有些應(yīng)用中（如高速離心）離心管必須裝滿。2)

形狀：做收集沉淀時(shí)，用圓錐性管底的離心管較好；而進(jìn)行密度梯度離心時(shí)圓底離心管更有用。3)

最大離心力：詳細(xì)信息由廠家提供。4)

耐腐蝕性：玻璃管是惰性物質(zhì)，但絕對(duì)不能在高、超速離心機(jī)上使用。聚碳酸酯管對(duì)有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮）敏感，而聚丙烯管具有更好的耐腐蝕性。詳細(xì)信息可參考廠家的說(shuō)明書(shū)。選擇離心管時(shí)應(yīng)考慮下列的一些性能。365)

滅菌：一次性塑料離心管出廠時(shí)通常是消過(guò)毒的。玻璃管及聚丙烯管可重復(fù)滅菌使用。多次高壓滅菌可能會(huì)導(dǎo)致聚碳酸酯崩裂或變形。6)

透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管為半透明。7)

能否刺穿：若想用刺穿管壁的方法收集樣品，纖維素乙酸管和聚丙烯管易于用注射管針頭刺穿。8)

管帽：大多數(shù)角式及垂直管式轉(zhuǎn)子要求離心管有管帽，用以防止使用過(guò)程中樣品漏出并在離心過(guò)程中支撐離心管，防止其離心時(shí)變形。對(duì)于放射性樣品，即使是低速離心也一定要蓋管帽，并且要使用與所用離心管配套的管帽。5)

滅菌：一次性塑料離心管出廠時(shí)通常是消過(guò)毒的。玻璃管及聚37第三節(jié)離心技術(shù)一、離心技術(shù)的分類(lèi)：根據(jù)離心原理，按照實(shí)際工作的需要，目前已設(shè)計(jì)出許多離心方法，綜合起來(lái)大致可分三類(lèi)。

⒈平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離，包括差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）和速率區(qū)帶離心法（ratezonalcentrifugation）。

⒉等密度離心法（jsopycniccentrifugation）又稱(chēng)等比重離心法，依粒子密度差進(jìn)行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱(chēng)為密度梯度離心法。⒊經(jīng)典式沉降平衡離心法用于對(duì)生物大分子分子量的測(cè)定、純度估計(jì)、構(gòu)象變化等。第三節(jié)離心技術(shù)一、離心技術(shù)的分類(lèi)：38二、離心分離的方法

（一）差速離心法差速離心法是利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過(guò)程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi)，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。

差速離心法主要用于分離細(xì)胞器和病毒。二、離心分離的方法39優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開(kāi)，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開(kāi)，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。③壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀。④顆粒被擠壓，離心力過(guò)大、離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。例如用差速離心法分離細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。密度梯度離心法課件40（二）密度梯度離心法：密度梯度離心法是樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。（二）密度梯度離心法：41優(yōu)點(diǎn)：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；③顆粒不會(huì)積壓變形，能保持顆?；钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。缺點(diǎn)：①離心時(shí)間較長(zhǎng)；②需要制備梯度；③操作嚴(yán)格，不宜掌握。優(yōu)點(diǎn)：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；421、速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開(kāi)原樣品層，按不同沉降速率沿管底沉降。離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開(kāi)，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降的越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。1、速率區(qū)帶離心法432、等密度離心法等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有顆粒的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開(kāi)始后，梯度液由于離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)浮力密度不同的顆粒，在離心力場(chǎng)下，或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移動(dòng)到它們密度恰好相等的位置上（即等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶。所形成的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與顆粒的大小和其他參數(shù)無(wú)關(guān)。因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長(zhǎng)離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置。此法一般用于分離大小相近，而密度差異較大的物質(zhì)。2、等密度離心法44（三）梯度溶液的制備1、梯度材料的選擇原則

①與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開(kāi)。②可達(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小。③不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化，價(jià)格便宜或容易回收。⑤濃度便于測(cè)定，如具有折光率。⑥對(duì)于超速離心分析工作來(lái)說(shuō)，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒(méi)有的。（三）梯度溶液的制備45梯度材料：①糖類(lèi)：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②無(wú)機(jī)鹽類(lèi)：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。③有機(jī)碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機(jī)物：如氟代碳等。梯度材料：46（四）分析性離心離心除了用于制備外，還可用于樣品的定性定量分析。在離心機(jī)上裝備光學(xué)系統(tǒng)，采用特殊的透光離心池，在離心過(guò)程中可以直接觀察樣品顆粒的沉降情況，以對(duì)樣品進(jìn)行定性定量分析。（四）分析性離心47第四節(jié)離心機(jī)的使用及注意事項(xiàng)一、低速離心機(jī)的使用：1、開(kāi)機(jī)：①將待離心溶液倒入大小適中的離心管中（溶液量不應(yīng)超過(guò)離心管總體積的2/3）。②離心管連同管套一起放在粗天平上平衡（管套底部應(yīng)放置橡皮墊）。③對(duì)稱(chēng)放入離心機(jī)插孔中（不用的管套應(yīng)拿出），蓋緊上蓋。④開(kāi)關(guān)置于“關(guān)”，調(diào)速旋鈕置于最小，接通電源，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，緩慢啟動(dòng)。⑤用調(diào)速旋鈕沿順時(shí)針?lè)较蚓徛{(diào)速，觀察轉(zhuǎn)速，達(dá)到轉(zhuǎn)速后開(kāi)始計(jì)時(shí)。第四節(jié)離心機(jī)的使用及注意事項(xiàng)一、低速離心機(jī)的使用：482、關(guān)機(jī)：①停轉(zhuǎn)后打開(kāi)上蓋，輕輕取樣。②關(guān)掉開(kāi)關(guān)，切斷電源。③離心管套倒立放置，使其干燥。2、關(guān)機(jī)：49二、離心機(jī)使用注意事項(xiàng)1、精密地平衡離心管及其內(nèi)容物。

超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭是鑲置在一根很細(xì)的軸上，因此在兩支離心管平衡時(shí)重量之差不得超過(guò)各個(gè)離心機(jī)說(shuō)明書(shū)上所規(guī)定的范圍。制備性超速離心機(jī)兩離心管平衡時(shí)重量之差不得超過(guò)0.1g。有的普通離心機(jī)帶有離心管套筒，平衡時(shí)應(yīng)帶上套筒。一臺(tái)離心機(jī)的套筒只能在該離心機(jī)上使用，不能在離心機(jī)之間(特別是不同型號(hào)的離心機(jī)之間)混用套筒。二、離心機(jī)使用注意事項(xiàng)502、平衡后的一對(duì)離心管及其內(nèi)容物(有時(shí)還可能包括離心管套筒)應(yīng)對(duì)稱(chēng)放置，不能錯(cuò)位，不能裝載單數(shù)的管子，以免因離心所產(chǎn)生的離心力不對(duì)稱(chēng)而損壞離心軸。3、當(dāng)平衡的離心管及其內(nèi)容物(或包括套筒)對(duì)稱(chēng)放置好后，蓋好離心機(jī)蓋子，打開(kāi)電源，轉(zhuǎn)動(dòng)速度調(diào)節(jié)旋鈕，逐步增加到所需要的離心速度，計(jì)算離心時(shí)間。

2、平衡后的一對(duì)離心管及其內(nèi)容物(有時(shí)還可能包括離心管套筒)514、當(dāng)離心到達(dá)所需要的時(shí)間后，再轉(zhuǎn)動(dòng)速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。待離心機(jī)自然停止轉(zhuǎn)動(dòng)后取出離心管。關(guān)閉離心機(jī)電源，拔掉電源插，清潔整理離心機(jī)、離心管、套筒、天平等。4、當(dāng)離心到達(dá)所需要的時(shí)間后，再轉(zhuǎn)動(dòng)速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。待離心52

5、超速離心機(jī)帶自動(dòng)控制的操作系統(tǒng)，待選定離心速度、時(shí)間等參數(shù)后，按啟動(dòng)開(kāi)關(guān)，離心機(jī)即自動(dòng)開(kāi)始轉(zhuǎn)動(dòng)、記錄時(shí)間，并可自動(dòng)停機(jī)(取決于輸入的控制信號(hào))。在離心室被抽成真空前，離心機(jī)只作低速運(yùn)轉(zhuǎn)。5、超速離心機(jī)帶自動(dòng)控制的操作系統(tǒng)，待選定離心速度、時(shí)間等53

6、超速離心時(shí)，應(yīng)注意選擇合適的離心管和轉(zhuǎn)頭。根據(jù)待離心液體性質(zhì)及體積選擇合適的離心管，裝載液體時(shí)要按各種離心機(jī)具體操作說(shuō)明進(jìn)行。有的離心管無(wú)蓋，液體不能裝得過(guò)多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭生銹或被腐蝕。制備性超速離心機(jī)的離心管，常常要求必須將液體裝滿，以免離心時(shí)塑料離心管上部凹陷變形。6、超速離心時(shí)，應(yīng)注意選擇合適的離心管和轉(zhuǎn)頭。根據(jù)待離心液54根據(jù)轉(zhuǎn)速選擇合適的轉(zhuǎn)頭，當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)所用轉(zhuǎn)頭最大轉(zhuǎn)速的2.5％時(shí)，轉(zhuǎn)頭就會(huì)爆炸。離心完后，轉(zhuǎn)頭應(yīng)用溫水洗滌并干燥，一般水洗就足夠了，如必須使用去污劑時(shí)應(yīng)用中性去污劑，不可用堿性去污劑。用中性去污劑擦拭轉(zhuǎn)頭，用水除去全部去污劑再用蒸餾水沖凈。切勿將轉(zhuǎn)頭浸泡在去污劑中。洗凈的轉(zhuǎn)頭放在室溫中干燥，更好的辦法是將轉(zhuǎn)頭擦干，用理發(fā)吹風(fēng)機(jī)吹干，轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)期不用應(yīng)涂一層上光蠟保護(hù)。轉(zhuǎn)頭在使用中應(yīng)防止與其他物品碰撞，避免造成傷痕，如果發(fā)現(xiàn)有被腐蝕跡象，轉(zhuǎn)頭不應(yīng)再用。根據(jù)轉(zhuǎn)速選擇合適的轉(zhuǎn)頭，當(dāng)轉(zhuǎn)速超過(guò)所用轉(zhuǎn)頭最大轉(zhuǎn)速的2.555第三章離心技術(shù)

離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻速圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到一個(gè)外向的離心力的行為發(fā)展起來(lái)的一種分離分析技術(shù)。

第三章離心技術(shù)離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在勻速56貝克曼庫(kù)爾特離心技術(shù)發(fā)展里程碑

1947

ModelE全球首臺(tái)分析型超速離心機(jī)。1947

ModelL全球首臺(tái)制備型超速離心機(jī)。1963

Type50Ti全球首個(gè)鈦金屬轉(zhuǎn)頭。1974

MicrofugeB全球首臺(tái)微量離心機(jī)。1976

TJ-6R全球首臺(tái)冷凍臺(tái)式超速離心機(jī)。貝克曼庫(kù)爾特離心技術(shù)發(fā)展里程碑1947

Model571979

L8Series全球首先采用微機(jī)控制及感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的超速離心機(jī)系列。1982

J21-M全球首臺(tái)采用感應(yīng)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的高速離心機(jī)。1984

TL-100全球首臺(tái)微量臺(tái)式超速離心機(jī)。1989

OptimaSeries首先采用半導(dǎo)體制冷的驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)的超速離心機(jī)系列。1989

NVT創(chuàng)新的近垂直轉(zhuǎn)頭,可快速提純DNA樣品。1991

OptimaXL-A重新設(shè)計(jì)的分析型超速離心機(jī)。1979

L8Series全球首先采用微機(jī)控制及感581994

AvantiJ全球獨(dú)有,利用可變磁阻驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)的高效離心。1996

OptimaXL-I擁有兩種檢測(cè)系統(tǒng)的分析型超速離心機(jī)。1998

OptimaMAX全球首臺(tái)超過(guò)一百萬(wàn)離心力的臺(tái)式超速離心。1998

ARIES全球獨(dú)有可以自我修正平衡的轉(zhuǎn)頭。2002

OptiamL-XP全球首先采用觸幕式操作的超速離心機(jī)。2004

AllegraX-12全球唯一可處理細(xì)胞培臺(tái)式離心機(jī)。1994

AvantiJ全球獨(dú)有,利用可變磁阻驅(qū)動(dòng)59離心技術(shù)的應(yīng)用：1、應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)：如化工、制藥、食品等工業(yè)大型制備。離心機(jī)轉(zhuǎn)速都在每分鐘5000轉(zhuǎn)以下。2、應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等實(shí)驗(yàn)室分析研究：分離和純化樣品，以及對(duì)純化樣品的有關(guān)性能進(jìn)行研究。

離心技術(shù)的應(yīng)用：60第一節(jié)基本原理

一、離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）

離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：Fc=mω2X其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開(kāi)旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。第一節(jié)基本原理一、離心力（centrifugalf61

二、相對(duì)離心力（relativecentrifugalforce，RCF）由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。一般情況下，低速離心時(shí)常以r／min來(lái)表示，高速離心時(shí)則以g(或數(shù)字Xg)表示。

二、相對(duì)離心力（relativecentrifugal62RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。

RCF就是實(shí)際離心場(chǎng)轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。63Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對(duì)應(yīng)的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖。見(jiàn)圖4-1。在用圖4-1將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對(duì)離心力時(shí)，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對(duì)應(yīng)的離心力6425.4cm4200rpm25.4cm4200rpm65例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接起來(lái)交于RCF標(biāo)尺，此交點(diǎn)500×g即是RCF值。

例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，66

三、沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，S）1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。三、沉降系數(shù)（sedimentationcoeffici67若ω用2πn/60表示，則式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。若ω用2πn/60表示，則式中X1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離68S實(shí)際上時(shí)常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱(chēng)為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫(xiě)S，單位為秒。即：1S=10-13秒例：某物質(zhì)的沉降系數(shù)是10-12秒可寫(xiě)成：10×10-13秒表示為：10S如：核蛋白體為70SS實(shí)際上時(shí)常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱(chēng)為69

細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)某些成分的沉降系數(shù)及其離心條件名稱(chēng)沉降系數(shù)/SRCF/g轉(zhuǎn)速（rpm）細(xì)胞﹥107﹤200﹤1500細(xì)胞核4×106-7600~8003000線粒體2×104~

7×10470007000DNA10~1202×10540000RNA4~504×10560000Pr2~2574×105﹥60000細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)某些成分的沉降系數(shù)及其離心條件70四、沉降速度（sedimentationvelocity）

沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρP為粒子的密度；ρm為介質(zhì)的密度。四、沉降速度（sedimentationvelocity）71

從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場(chǎng)增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項(xiàng)沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：①當(dāng)ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到平衡。③當(dāng)ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和72五、沉降時(shí)間（sedimentationtime，Ts）在實(shí)際工作中，要將某種物質(zhì)從溶液中分離出來(lái)，必須知道所需轉(zhuǎn)速與時(shí)間。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時(shí)間來(lái)確定分離某粒子所需的時(shí)間。根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：

五、沉降時(shí)間（sedimentationtime，Ts）73積分得：式中X2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時(shí)間（t2－t1）用Ts表示則式可改為：式中Ts以小時(shí)為單位，S以Svedberg為單位。積分得：74六、K系數(shù)（kfactor）

K系數(shù)是用來(lái)描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來(lái)的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個(gè)指數(shù)，所以也叫“cleaningfactor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。其中Rmax為轉(zhuǎn)子最大半徑；Rmin為轉(zhuǎn)子最小半徑。六、K系數(shù)（kfactor）75由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個(gè)變數(shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)速變，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時(shí)，K系數(shù)就改變。通常，離心機(jī)的轉(zhuǎn)子說(shuō)明書(shū)中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計(jì)算出來(lái)的數(shù)值。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系76如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計(jì)沉降到管底所需的離心時(shí)間是T＝k/S＝4h，利用此公式預(yù)估的離心時(shí)間，對(duì)水平式轉(zhuǎn)子最適合；對(duì)固定角式轉(zhuǎn)子而言，實(shí)際時(shí)間將比預(yù)估的時(shí)間來(lái)得快些。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，77

第二節(jié)離心機(jī)一、離心機(jī)的分類(lèi)按轉(zhuǎn)速的大小(機(jī)頭的額定最高轉(zhuǎn)速)分為:①低速離心機(jī)：<10×103r／min②高速離心機(jī)：10×103~25×103r／min)③超速離心機(jī)：>30×103r／min第二節(jié)離心機(jī)一、離心機(jī)的分類(lèi)78類(lèi)型普通離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速(r/min)600025000可達(dá)75000以上最大RCF（g）600089000可達(dá)510000以上分離形式固液沉淀固液沉淀分離密度梯度區(qū)帶分離或差速沉降分離轉(zhuǎn)子角式和外擺式角式、外擺式角式、外擺式、區(qū)帶儀器結(jié)構(gòu)速率不能?chē)?yán)格控制，有消除空氣和轉(zhuǎn)子間備有消除轉(zhuǎn)子與空氣摩擦性能和特點(diǎn)多數(shù)室溫下操作摩擦熱的制冷裝置，熱的真空和冷卻系統(tǒng)，有速率和溫度控制較準(zhǔn)更為精確的溫度和速度控確、嚴(yán)格。制、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、有保證轉(zhuǎn)子正常運(yùn)轉(zhuǎn)的傳動(dòng)和制動(dòng)裝置等。應(yīng)用收集易沉降的大顆粒收集微生物、細(xì)胞主要分離細(xì)胞器、病毒、（如RBC、酵母細(xì)胞等）碎片、大細(xì)胞器、核酸、蛋白質(zhì)、多糖等甚至硫酸銨沉淀物和免疫能分開(kāi)分子大小相近的同位沉淀物等。但不能有素標(biāo)記物15N-DNA和未效沉淀病毒、小細(xì)胞器標(biāo)記的DNA。

（如核糖體）、蛋白質(zhì)等大分子。類(lèi)型79二、離心機(jī)的結(jié)構(gòu)低速離心機(jī)：其主要部件是電機(jī)和轉(zhuǎn)軸。高速、超速離心機(jī)：驅(qū)動(dòng)電機(jī)、制冷系統(tǒng)真空系統(tǒng)（超速離離心機(jī)有）顯示系統(tǒng)、自動(dòng)保護(hù)系統(tǒng)控制系統(tǒng)組成二、離心機(jī)的結(jié)構(gòu)80三、離心轉(zhuǎn)子和離心管

（一）離心轉(zhuǎn)子離心轉(zhuǎn)子是超速、高速離心機(jī)的主要部件之一。由于超速、高速離心機(jī)工作時(shí)的轉(zhuǎn)速很高，相應(yīng)的離心力場(chǎng)則很大，離心轉(zhuǎn)頭均用高強(qiáng)度的鋁合金、鈦合金及超硬鋁、鍛鋁制成。三、離心轉(zhuǎn)子和離心管811、離心轉(zhuǎn)頭的分類(lèi)（1）角轉(zhuǎn)子(nxedanglerotor)角轉(zhuǎn)子是各種類(lèi)型離心機(jī)的基本轉(zhuǎn)子和最高速轉(zhuǎn)子。特點(diǎn)：角轉(zhuǎn)頭常用鋁或鈦合金制作，呈圓錐形。角轉(zhuǎn)頭中離心管的中心線與旋轉(zhuǎn)軸的夾角一般在15°~40°之間。優(yōu)點(diǎn)：具有強(qiáng)度高，重心低，運(yùn)轉(zhuǎn)平穩(wěn)，離心時(shí)間短，壽命長(zhǎng)，使用方便等。1、離心轉(zhuǎn)頭的分類(lèi)82缺點(diǎn)：具有壁效應(yīng)，即靠近離心管外壁部形成強(qiáng)烈對(duì)流和渦旋，影響分離純度。應(yīng)用：常用于差速離心來(lái)分離s（沉降系數(shù)）值相差較大（1：10）的樣品。規(guī)格：角轉(zhuǎn)頭的規(guī)格較多，常見(jiàn)的有32×15ml，6×50ml等。缺點(diǎn)：具有壁效應(yīng)，即靠近離心管外壁部形成強(qiáng)烈對(duì)流和渦旋，影響83（2）水平轉(zhuǎn)頭(swing-outrotor)特點(diǎn)：鋁合金或鈦合金制成。離心管放人吊籃中，離心時(shí)，離心管中心線與旋轉(zhuǎn)中心線由平行而逐漸變?yōu)榇怪薄p少了由于對(duì)流和渦旋而引起的壁效應(yīng)，提高了分離純度。增加了沉降距離，所以離心時(shí)間也相應(yīng)增長(zhǎng)。用途：速度區(qū)帶離心（2）水平轉(zhuǎn)頭(swing-outrotor)84（3）垂直轉(zhuǎn)頭(verticalrotor)特點(diǎn)：垂直轉(zhuǎn)頭是一種角度轉(zhuǎn)頭，離心管垂直放置。離心管與。應(yīng)用：等密度區(qū)帶離心sucrose速度區(qū)帶離心（3）垂直轉(zhuǎn)頭(verticalrotor)85

通常將離心管(加離心管帽或加可熱封的塑料管)密封后垂直插入轉(zhuǎn)頭內(nèi)。離心前，離心管中的樣品液受重力的作用液面呈水平分布。離心時(shí)，由于離心力作用使液面由水平分布轉(zhuǎn)為垂直分布，被分離顆粒沉降在后半管壁。這種由于離心作用使液面重新轉(zhuǎn)向分布稱(chēng)為再定向。通常將離心管(加離心管帽或加可熱封的86圖（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管轉(zhuǎn)子圖（a）水平轉(zhuǎn)子；（b）固定轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)子；（c）垂直離心管872、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)

（1）轉(zhuǎn)頭標(biāo)記的意義

①符號(hào)：角度轉(zhuǎn)頭FA，垂直轉(zhuǎn)頭V；甩平轉(zhuǎn)頭Sw；連續(xù)轉(zhuǎn)頭CF；區(qū)帶轉(zhuǎn)頭Z。②英文字母后的數(shù)字表示該轉(zhuǎn)頭的最大額定轉(zhuǎn)速。③Ti表示由鈦或鈦合金為材料制成的轉(zhuǎn)頭，不標(biāo)則為鋁或鋁合金做成的轉(zhuǎn)頭。如：SW65Ti指該轉(zhuǎn)頭為甩平轉(zhuǎn)頭，最大額定轉(zhuǎn)速為65000r／min，轉(zhuǎn)頭由鈦金屬制成。2、離心轉(zhuǎn)頭的常用標(biāo)記及轉(zhuǎn)頭參數(shù)88(2)轉(zhuǎn)頭參數(shù)Rmax：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最外緣或離心管底的距離；Rmin：從轉(zhuǎn)軸中心至離心管最內(nèi)緣或離心管頂?shù)木嚯x；RPMmax：轉(zhuǎn)頭的最高安全轉(zhuǎn)速；FRCmax：轉(zhuǎn)頭以只fM，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，在Rrna~處的相對(duì)離心力；

FRCmin：轉(zhuǎn)頭以RPMmax運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，在Rmin處的相對(duì)離心力；K：衡量轉(zhuǎn)頭相對(duì)效率的量，K值愈小，效率愈高，所需離心時(shí)間就愈短。(2)轉(zhuǎn)頭參數(shù)89（二）離心管常用的塑料離心管:聚乙烯管(PE)、纖維素管(CAB)、聚碳酸酯管(PC)和丙二醇酯管(PP)等。離心管有各種大小:1.5ml到1000ml。（二）離心管90選擇離心管時(shí)應(yīng)考慮下列的一些性能。1)

容量：由樣品的體積決定。注意在有些應(yīng)用中（如高速離心）離心管必須裝滿。2)

形狀：做收集沉淀時(shí)，用圓錐性管底的離心管較好；而進(jìn)行密度梯度離心時(shí)圓底離心管更有用。3)

最大離心力：詳細(xì)信息由廠家提供。4)

耐腐蝕性：玻璃管是惰性物質(zhì)，但絕對(duì)不能在高、超速離心機(jī)上使用。聚碳酸酯管對(duì)有機(jī)溶劑（如乙醇、丙酮）敏感，而聚丙烯管具有更好的耐腐蝕性。詳細(xì)信息可參考廠家的說(shuō)明書(shū)。選擇離心管時(shí)應(yīng)考慮下列的一些性能。915)

滅菌：一次性塑料離心管出廠時(shí)通常是消過(guò)毒的。玻璃管及聚丙烯管可重復(fù)滅菌使用。多次高壓滅菌可能會(huì)導(dǎo)致聚碳酸酯崩裂或變形。6)

透明度：玻璃管和聚碳酸酯是透明的，而聚丙烯管為半透明。7)

能否刺穿：若想用刺穿管壁的方法收集樣品，纖維素乙酸管和聚丙烯管易于用注射管針頭刺穿。8)

管帽：大多數(shù)角式及垂直管式轉(zhuǎn)子要求離心管有管帽，用以防止使用過(guò)程中樣品漏出并在離心過(guò)程中支撐離心管，防止其離心時(shí)變形。對(duì)于放射性樣品，即使是低速離心也一定要蓋管帽，并且要使用與所用離心管配套的管帽。5)

滅菌：一次性塑料離心管出廠時(shí)通常是消過(guò)毒的。玻璃管及聚92第三節(jié)離心技術(shù)一、離心技術(shù)的分類(lèi)：根據(jù)離心原理，按照實(shí)際工作的需要，目前已設(shè)計(jì)出許多離心方法，綜合起來(lái)大致可分三類(lèi)。

⒈平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進(jìn)行分離，包括差速離心法（differentialvelocitycentrifugation）和速率區(qū)帶離心法（ratezonalcentrifugation）。

⒉等密度離心法（jsopycniccentrifugation）又稱(chēng)等比重離心法，依粒子密度差進(jìn)行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱(chēng)為密度梯度離心法。⒊經(jīng)典式沉降平衡離心法用于對(duì)生物大分子分子量的測(cè)定、純度估計(jì)、構(gòu)象變化等。第三節(jié)離心技術(shù)一、離心技術(shù)的分類(lèi)：93二、離心分離的方法

（一）差速離心法差速離心法是利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過(guò)程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開(kāi)，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。

差速離心法主要用于分離細(xì)胞器和病毒。二、離心分離的方法94優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開(kāi)，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)：①分離效果差，不能一次得到純顆粒；②分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開(kāi)，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。③壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀。④顆粒被擠壓，離心力過(guò)大、離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。例如用差速離心法分離細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。密度梯度離心法課件95（二）密度梯度離心法：密度梯度離心法是樣品在一定惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。（二）密度梯度離心法：96優(yōu)點(diǎn)：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；②適應(yīng)范圍廣，既能分離具有沉淀系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；③顆粒不會(huì)積壓變形，能保持顆?；钚裕⒎乐挂研纬傻膮^(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。缺點(diǎn)：①離心時(shí)間較長(zhǎng)；②需要制備梯度；③操作嚴(yán)格，不宜掌握。優(yōu)點(diǎn)：①分離效果好，可一次獲得較純顆粒；971、速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心時(shí)，由于離心力