瘧疾鏡檢-課件

瘧原蟲鏡檢技術瘧原蟲鏡檢技術1一、顯微鏡鏡檢用于瘧疾診斷

顯微鏡鏡檢仍是目前廣泛應用的瘧疾診斷技術(金標準）主要優(yōu)點-特異高-能區(qū)分蟲種-能分期-能計數-1小時內能完成診斷程序一、顯微鏡鏡檢用于瘧疾診斷

顯微鏡鏡檢仍是目前廣泛應用的瘧疾21.所需設備（1）載玻片（2）采血針

（3）玻片盒

（4）75％乙醇棉球（5）鉛筆（6）登記表二、血片制作及染色1.所需設備二、血片制作及染色3

2．血片制作（1）取血部位采血部位有指尖、耳垂、嬰兒可在足跟取血（2）涂制血膜厚血膜的涂制：

用推片的左下角刮取血液4-5μl（約火柴頭大?。?，將血滴涂于載片的中央偏右，由里向外劃圈涂成直徑為0.8-1厘米的厚薄均勻的圓形厚血膜。2．血片制作用推片的左下角刮取血液4-5μl（約火柴頭4用棉球抹凈角上的血漬，再刮取血液1.5μl{約1/4火柴頭大小)，將推片的一端置于血滴之前，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至約2cm寬時，使兩玻片保持25-35°角，從右向左迅速向前推成舌狀薄血膜，長約2.5CM。（一）薄血膜的涂制：（一）薄血膜的涂制：5（3）厚薄血膜的位置：每張載玻片上分別做1個薄血膜，1個厚血膜。標準血膜的位置如下圖所示。（4）血膜的編號制成血片后，待薄血膜干后用鉛筆將代號或個人編號寫于血膜基部，編號要與登記本及結果報告單上的編號相一致，以防差錯。（3）厚薄血膜的位置：6

標準血膜示意圖

標準血膜示意圖7（二）血片的染色1．薄血膜的固定血片完全干燥后才可染色固定的方法：將涂片的血膜面向上，厚血膜在上端，略傾斜放置，干后用小玻棒蘸甲醇在薄血膜上輕輕抹過以固定薄血膜。（注意：厚血膜不能固定）（二）血片的染色82．染色用水和沖洗用水配制常用中性的蒸餾水或經煮沸過濾的冷開水。用pH7.0～pH7.2的緩沖液效果最佳。在沒有蒸餾水的情況下，也可用井水、河水、泉水或雨水。為了使血膜著色較好。（1）兩種貯備液的配制：貯備液I1/15M磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液Na2HPO49.5g蒸餾水1000ml貯備液Ⅱ1/15M磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶液KH2PO49.07g蒸餾水1000ml2．染色用水和沖洗用水配制9（2）緩沖液的配制PHM/15Na2HPO4M/15KH2PO4DW(ml)(ml)(ml)6.849519007.063379007.168329007.273279007.48119900加緩沖液的PH可用試紙或0.02%酚紅液測定。亦可用PH7.0中性蒸餾水稀釋染劑（2）緩沖液的配制10（1）配制吉姆薩（Giemsa）染液：吉姆薩粉10g

甲醇500ml

甘油500ml

將吉姆薩粉置于研缽中，加入少量甘油充分研磨，然后邊加邊磨，至甘油加完為止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研缽中加入少量甲醇洗滌掉剩余部分并倒入瓶內，重復數次，一并倒入瓶中，至研缽中甘油洗凈為止。塞緊瓶塞，充分搖勻，在室溫下放置3-5天，每天搖動，即可使用。放置時間越長染色效果愈佳。（1）配制吉姆薩（Giemsa）染液：11（2）

染色方法：

A.常規(guī)染色用PH7.0-7.2緩沖液或蒸餾水將吉氏原液與緩沖液1：20稀釋。分別加數滴經稀釋吉氏染液于厚、薄血膜，染色25-30分鐘后，用中性蒸餾水輕輕將片上的染液沖去，（沖洗時勿用水直接對準厚血膜，以免血膜脫落）涼干后鏡檢。（2）

染色方法：12

B.

快速吉氏染色

在每毫升緩沖液中加吉氏原液3滴，（10-15%吉氏染液）分別加數滴于厚、薄血膜上，染色5分鐘，用流水輕輕沖洗干凈，涼干后鏡檢。

13瑞氏（Wright）染液:（1）染液配制：

瑞氏染劑粉0.1—0.5g甘油3ml純甲醇97ml將瑞氏染劑粉置于研缽內，加入甘油充分研磨后，然后加入少量甲醇碾磨后倒入有玻塞瓶中，再分次用甲醇沖洗碾缽中的瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。充分搖勻，一般放置一二星期后，再過濾應用（保存時間愈久，染色力愈佳）。急用時，放置24小時后過濾也可使用。

瑞氏（Wright）染液:14（2）染色方法：

先用臘筆在厚薄血膜間畫一界線，滴2-3滴蒸餾水于厚血膜上溶血,棄殘液。（小心勿使蒸餾水超出臘筆線而觸及薄血膜）。在薄血膜上滴瑞氏染液5-8滴，再加與染液等量的蒸餾水，與染液混合均勻后用玻棒引至厚血膜上，厚薄血膜同時染色5-8分鐘后，用清水輕輕沖洗數秒鐘，待干后鏡檢。

（2）染色方法：153.染色質量染色較好的血片，肉眼看上去呈淡紫紅色（不應該出現藍—綠色或紅色）；鏡檢紅細胞呈淡紅色，嗜酸性細胞的顆粒呈鮮紅色，淋巴細胞及瘧原蟲的胞漿呈藍色或淡藍色，白細胞的核呈紫藍色；瘧原蟲的核呈紅色，瘧色素清晰可見，在顯微鏡下僅有小量染液沉淀。3.染色質量染色較好的血片，肉眼看上去呈淡紫紅色（不應該出164.影響血膜染色的因素血膜染色好壞，除與玻片的清潔、血膜制作技術等有關外，尚與下列因素有關：(1)試劑和溶劑的質量：染料、甲醇和甘油如不純，常使所配的染液偏酸或偏堿，從而影響血膜的染色。

(2)染液的新舊：新配制的染液，因色素尚未充分溶解，一般染色力弱，且常帶堿性。染液放置較久，染色力逐漸增加，尤以吉氏染液為甚。通常在染液配制1-2周后才使用。

4.影響血膜染色的因素17(3)染液的稀釋濃度：染液濃度高，則著色快而深，各種細胞著色粗糙、薛氏點等粗大顯著，但顏色偏堿；使用染液濃度低，染色時間長，則著色慢，顏色偏酸，各種細胞內部結構著色均勻、細致。

(4)染色時間與溫度：染色時間長，化學反應充分完成，染色效果好，反之則染色效果差。瘧疾鏡檢-課件18用水過酸可致受染RBC上的點彩染不出來，用水過堿，則使薄血膜上的RBC染成灰藍色，致使R的胞漿難以辨論。因此，當染色結果發(fā)生偏藍（堿）或偏紅（酸）時，可用酸堿度與之相反的緩沖液沖洗血膜，予以調整。(5)稀釋和沖洗用水：用水過酸可致受染RBC上的點彩染不出來，(5)稀釋和沖洗用水19瘧疾鏡檢-課件20

血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質量好壞等有關外，還受到以下幾個因素的影響：（1）染料溶劑的質量染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時所用的器具必須干凈而無水份。血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質量好壞21（2）染液的新舊新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常有沉渣。染液存放時間越久，染色力越強。通常在染液配制1~2周后才使用，盛裝染液的瓶子應加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質量。（3）染液稀釋后使用時間染液的主要成份是美藍、伊紅和由美藍氧化產生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍和天青即產生沉淀。因此，必須在稀釋染液當時使用，一般在半小時內染色力最強。（2）染液的新舊新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色22

（

4）染液的稀釋濃度與染色時間染液的濃度高其著色就快而深，染色時間相對縮短，瘧原蟲寄生紅細胞的薛氏點粗大顯著，但顏色常偏藍；染液濃度過低則染色時間相對長一些，顏色偏酸紅，薛氏點不明顯或消失。（5）稀釋和沖洗用水：為使厚、薄血膜著色較好，應使稀釋的染液呈中性或稍偏堿性，故應用pH7.0~pH7.2的水稀釋。當染色太藍，可用pH較低的緩沖水沖洗；如染色太紅，則用pH較高的緩沖液沖洗；如染色太深，可延長沖洗時間，予以校正。瘧疾鏡檢-課件23薄血膜中常見的血液成分中性白細胞酸性球血小板大單核球淋巴球紅血球薄血膜中常見的血液成分中性白細胞酸性球血小板大單核球淋巴球紅24（三）厚薄血膜的優(yōu)缺點及其適用范圍薄血膜用血量約為2μl，涂制成2cm寬×4cm長面積的薄血膜。由于在制備過程中，血片通常經甲醇固定，使紅細胞及其內瘧原蟲的形態(tài)保持完整，便于瘧原蟲蟲種的鑒定。惟由于用血量少，為保證檢測的敏感性，常耗時較多，似不適用于大規(guī)模調查。即使在醫(yī)院的化驗室，由于要求在短時間內作出診斷，因而極有可能出現漏診。（三）厚薄血膜的優(yōu)缺點及其適用范圍25

厚血膜用血量約為10μl～20μl。涂制成直徑1cm的厚血膜由于在制備過程中紅細胞已溶解，瘧原蟲在形態(tài)上仍可分辨，但胞漿和胞核不可避免地形成一定程度的固縮。受影響較大的有大滋養(yǎng)體、裂殖體的形態(tài)。在鏡檢厚血膜時，一般門診須檢查200~1000個油鏡視野（相當于0.5~2.5μl血量），才能確保鏡檢的敏感性和可重復性。通常的敏感性可達約10~20個原蟲/μl血。由于厚血膜與薄血膜相比血量大，須查范圍小，節(jié)省時間，陽性檢出率較高。厚血膜能查出瘧原蟲數是薄血膜的15～25倍。所以，我們推薦瘧疾診斷應以檢查厚血膜為主。在普查時均應查完整個厚血膜，未查見瘧原蟲則判為陰性。厚血膜26混合感染的鑒別1、容易鑒別的混合感染1）同一血膜中發(fā)現間日瘧各期原蟲和惡性瘧雌雄配子體。2）同一血膜中發(fā)現大量纖細的惡性瘧環(huán)狀體，并混有少量間日瘧原蟲。2、不易鑒別的混合感染1）間日瘧各期原蟲和粗環(huán)的惡性瘧環(huán)狀體。2）僅有間日瘧和惡性瘧的環(huán)狀體。

3分子生物學方法應用于瘧原蟲分型1）提高檢出：對鏡檢漏診病人敏感性達5個原蟲/100uL血2）確定四種瘧原蟲，做復核鑒定混合感染的鑒別1、容易鑒別的混合感染27三、厚血膜的瘧原蟲計數

根據預先測定的白細胞數目計算出每微升血液中瘧原蟲的數目。在制作厚血膜的同時，使用Coulter計數器或血球計確定每微升血液中的白細胞數。然后鏡檢厚血膜，計數同一視野中的瘧原蟲數和白細胞數，直到所計數的白細胞數達到確定的數值為止(如果瘧原蟲密度較高，計數100～200個白細胞即可，但在瘧原蟲密度很低時，計數白細胞數需達1000個)。用下式算出瘧原蟲密度：瘧原蟲數/白細胞數×白細胞數/μl血=瘧原蟲數/μl血。

如果無法進行白細胞計數，則可按常規(guī)估計白細胞數。國外最常采用的數值是8000白細胞/μl血,國內常用6000白細胞/μl血。三、厚血膜的瘧原蟲計數28謝謝大家謝謝大家29瘧原蟲鏡檢技術瘧原蟲鏡檢技術30一、顯微鏡鏡檢用于瘧疾診斷

顯微鏡鏡檢仍是目前廣泛應用的瘧疾診斷技術(金標準）主要優(yōu)點-特異高-能區(qū)分蟲種-能分期-能計數-1小時內能完成診斷程序一、顯微鏡鏡檢用于瘧疾診斷

顯微鏡鏡檢仍是目前廣泛應用的瘧疾311.所需設備（1）載玻片（2）采血針

（3）玻片盒

（4）75％乙醇棉球（5）鉛筆（6）登記表二、血片制作及染色1.所需設備二、血片制作及染色32

2．血片制作（1）取血部位采血部位有指尖、耳垂、嬰兒可在足跟取血（2）涂制血膜厚血膜的涂制：

用推片的左下角刮取血液4-5μl（約火柴頭大?。?，將血滴涂于載片的中央偏右，由里向外劃圈涂成直徑為0.8-1厘米的厚薄均勻的圓形厚血膜。2．血片制作用推片的左下角刮取血液4-5μl（約火柴頭33用棉球抹凈角上的血漬，再刮取血液1.5μl{約1/4火柴頭大小)，將推片的一端置于血滴之前，當血液在載玻片與推片之間向兩側擴展至約2cm寬時，使兩玻片保持25-35°角，從右向左迅速向前推成舌狀薄血膜，長約2.5CM。（一）薄血膜的涂制：（一）薄血膜的涂制：34（3）厚薄血膜的位置：每張載玻片上分別做1個薄血膜，1個厚血膜。標準血膜的位置如下圖所示。（4）血膜的編號制成血片后，待薄血膜干后用鉛筆將代號或個人編號寫于血膜基部，編號要與登記本及結果報告單上的編號相一致，以防差錯。（3）厚薄血膜的位置：35

標準血膜示意圖

標準血膜示意圖36（二）血片的染色1．薄血膜的固定血片完全干燥后才可染色固定的方法：將涂片的血膜面向上，厚血膜在上端，略傾斜放置，干后用小玻棒蘸甲醇在薄血膜上輕輕抹過以固定薄血膜。（注意：厚血膜不能固定）（二）血片的染色372．染色用水和沖洗用水配制常用中性的蒸餾水或經煮沸過濾的冷開水。用pH7.0～pH7.2的緩沖液效果最佳。在沒有蒸餾水的情況下，也可用井水、河水、泉水或雨水。為了使血膜著色較好。（1）兩種貯備液的配制：貯備液I1/15M磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液Na2HPO49.5g蒸餾水1000ml貯備液Ⅱ1/15M磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶液KH2PO49.07g蒸餾水1000ml2．染色用水和沖洗用水配制38（2）緩沖液的配制PHM/15Na2HPO4M/15KH2PO4DW(ml)(ml)(ml)6.849519007.063379007.168329007.273279007.48119900加緩沖液的PH可用試紙或0.02%酚紅液測定。亦可用PH7.0中性蒸餾水稀釋染劑（2）緩沖液的配制39（1）配制吉姆薩（Giemsa）染液：吉姆薩粉10g

甲醇500ml

甘油500ml

將吉姆薩粉置于研缽中，加入少量甘油充分研磨，然后邊加邊磨，至甘油加完為止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研缽中加入少量甲醇洗滌掉剩余部分并倒入瓶內，重復數次，一并倒入瓶中，至研缽中甘油洗凈為止。塞緊瓶塞，充分搖勻，在室溫下放置3-5天，每天搖動，即可使用。放置時間越長染色效果愈佳。（1）配制吉姆薩（Giemsa）染液：40（2）

染色方法：

A.常規(guī)染色用PH7.0-7.2緩沖液或蒸餾水將吉氏原液與緩沖液1：20稀釋。分別加數滴經稀釋吉氏染液于厚、薄血膜，染色25-30分鐘后，用中性蒸餾水輕輕將片上的染液沖去，（沖洗時勿用水直接對準厚血膜，以免血膜脫落）涼干后鏡檢。（2）

染色方法：41

B.

快速吉氏染色

在每毫升緩沖液中加吉氏原液3滴，（10-15%吉氏染液）分別加數滴于厚、薄血膜上，染色5分鐘，用流水輕輕沖洗干凈，涼干后鏡檢。

42瑞氏（Wright）染液:（1）染液配制：

瑞氏染劑粉0.1—0.5g甘油3ml純甲醇97ml將瑞氏染劑粉置于研缽內，加入甘油充分研磨后，然后加入少量甲醇碾磨后倒入有玻塞瓶中，再分次用甲醇沖洗碾缽中的瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。充分搖勻，一般放置一二星期后，再過濾應用（保存時間愈久，染色力愈佳）。急用時，放置24小時后過濾也可使用。

瑞氏（Wright）染液:43（2）染色方法：

先用臘筆在厚薄血膜間畫一界線，滴2-3滴蒸餾水于厚血膜上溶血,棄殘液。（小心勿使蒸餾水超出臘筆線而觸及薄血膜）。在薄血膜上滴瑞氏染液5-8滴，再加與染液等量的蒸餾水，與染液混合均勻后用玻棒引至厚血膜上，厚薄血膜同時染色5-8分鐘后，用清水輕輕沖洗數秒鐘，待干后鏡檢。

（2）染色方法：443.染色質量染色較好的血片，肉眼看上去呈淡紫紅色（不應該出現藍—綠色或紅色）；鏡檢紅細胞呈淡紅色，嗜酸性細胞的顆粒呈鮮紅色，淋巴細胞及瘧原蟲的胞漿呈藍色或淡藍色，白細胞的核呈紫藍色；瘧原蟲的核呈紅色，瘧色素清晰可見，在顯微鏡下僅有小量染液沉淀。3.染色質量染色較好的血片，肉眼看上去呈淡紫紅色（不應該出454.影響血膜染色的因素血膜染色好壞，除與玻片的清潔、血膜制作技術等有關外，尚與下列因素有關：(1)試劑和溶劑的質量：染料、甲醇和甘油如不純，常使所配的染液偏酸或偏堿，從而影響血膜的染色。

(2)染液的新舊：新配制的染液，因色素尚未充分溶解，一般染色力弱，且常帶堿性。染液放置較久，染色力逐漸增加，尤以吉氏染液為甚。通常在染液配制1-2周后才使用。

4.影響血膜染色的因素46(3)染液的稀釋濃度：染液濃度高，則著色快而深，各種細胞著色粗糙、薛氏點等粗大顯著，但顏色偏堿；使用染液濃度低，染色時間長，則著色慢，顏色偏酸，各種細胞內部結構著色均勻、細致。

(4)染色時間與溫度：染色時間長，化學反應充分完成，染色效果好，反之則染色效果差。瘧疾鏡檢-課件47用水過酸可致受染RBC上的點彩染不出來，用水過堿，則使薄血膜上的RBC染成灰藍色，致使R的胞漿難以辨論。因此，當染色結果發(fā)生偏藍（堿）或偏紅（酸）時，可用酸堿度與之相反的緩沖液沖洗血膜，予以調整。(5)稀釋和沖洗用水：用水過酸可致受染RBC上的點彩染不出來，(5)稀釋和沖洗用水48瘧疾鏡檢-課件49

血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質量好壞等有關外，還受到以下幾個因素的影響：（1）染料溶劑的質量染料、甲醇和甘油如果不純，常使配制的染液偏酸或偏堿而影響染色效果。因此必須用分析純的甲醇和中性甘油，而且在配制時所用的器具必須干凈而無水份。血片染色好壞除了與玻片是否清潔，血片制作質量好壞50（2）染液的新舊新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力較弱且常有沉渣。染液存放時間越久，染色力越強。通常在染液配制1~2周后才使用，盛裝染液的瓶子應加塞蓋密。以防吸潮而影響染液質量。（3）染液稀釋后使用時間染液的主要成份是美藍、伊紅和由美藍氧化產生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊紅遇到美藍和天青即產生沉淀。因此，必須在稀釋染液當時使用，一般在半小時內染色力最強。（2）染液的新舊新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色51

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4）染液的稀釋濃度與染色時間染液的濃度高其著色就快而深，染色時間相對縮短，瘧原蟲寄生紅細胞的薛氏點粗大顯著，但顏色常偏藍；染液濃度過低則染色時間相對長一些，顏色偏酸紅，薛氏點不明顯或消失。（5）稀釋和沖洗用水：為使厚、薄血膜著色較好，應使稀釋的染液呈中性或稍偏堿性，故應用pH7.0~pH7.2的水稀釋。當染色太藍，可用pH較低的緩沖水沖洗；如染色太紅，則用pH較高的緩沖液沖洗；如染色太深，可延長沖洗時間，予以校正。瘧疾鏡檢-課件52薄血膜中常見的血液成分中性白細胞酸性球血小板大單核球淋巴球紅血球薄血膜中常見的血液成分中性白細胞酸性球血小板大單核球淋巴球紅53（三）厚薄血膜的優(yōu)缺點及其適用范圍薄血膜用血量約為2μl，涂制成2cm寬×4cm長面