哺乳動物DNA的快速分離與PCR擴增1111

實驗二、哺乳動物組織

DNA的快速分離與基因的

PCR

擴增一、實驗?zāi)康?、了解真核細胞中基因組結(jié)構(gòu)與組成的復(fù)雜性；學(xué)會并掌握從哺乳動物組織中提取基因組總DNA的原理與技術(shù)，為PCR分析，RFLP分析，基因文庫的構(gòu)建，基因檢測等研究打下基礎(chǔ)；2、學(xué)習(xí)與掌握PCR擴增基因的原理和操作方法，了解

PCR基因擴增技術(shù)在分子克隆，目的基因檢測，遺傳病的基因診斷，法醫(yī)學(xué)，考古學(xué)等方面的應(yīng)用。二、實驗原理1、哺乳動物組織DNA的提?。涸贓DTA（鰲合二價陽離子以抑制DNase）存在的情況下，用蛋白酶K消化真核細胞或組織，用去垢劑如SDS溶解細胞膜并使蛋白質(zhì)變性。核酸通過有機溶劑進行抽提純化。污染的RNA通過RNase消化去除。根據(jù)本方法制備的哺乳動物基因組DNA約20～50kb，適于作PCR反應(yīng)的模板。DNA產(chǎn)量在0.5～3.0μg/mg組織之間。2、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)簡稱ＰＣＲ技術(shù)：ＰＣＲ技術(shù)實際上是在模板ＤＮＡ，引物和４種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反應(yīng)，ＰＣＲ技術(shù)的特異性取決于引物和模板ＤＮＡ結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步：①變性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反應(yīng)過程見圖。模板DNA在94℃條件下變性形成單鏈；在55℃條件下根據(jù)目的基因兩側(cè)序列設(shè)計的引物分別與其同源序列結(jié)合；72℃下在耐熱性DNA聚合酶Taq酶催化下，在４種dNTP存在條件下延伸形成雙鏈。完成一次循環(huán)。接著又以新合成的DNA為模板進行同樣反應(yīng)，如次往復(fù)循環(huán)30次，由于每次循環(huán)目標(biāo)DNA都以２n次冪擴增，30次循環(huán)后目的DNA的量增加106～7倍。成功的PCR反應(yīng)要求反應(yīng)有很好的特異性和相當(dāng)?shù)臄U增效率。要達此目的PCR反應(yīng)要注意以下問題：①DNA模板：反應(yīng)中DNA量在50ng～200ng左右。且DNA純度較高，以增加反應(yīng)特異性。②dNTP:反應(yīng)體系中達100μM～200μM。③Mg2+：Mg2+是Taq酶的輔基濃度在2.0mM左右，濃度太低Taq

酶活力降低；太高反應(yīng)特異性降低；④引物：根據(jù)目的基因兩側(cè)特定序列設(shè)計。引物約20nt左右，Ｇ＋Ｃ含量在40％～70％之間，引物內(nèi)部不能有回文序列，引物３’端不能互補；⑤Taq酶：它是從嗜熱桿菌中提取的耐熱性DNA聚合酶，在95℃時30min還有50％活力；⑥變性溫度：在93～95℃之間使模板充分變性。⑦復(fù)性溫度：55℃左右，此溫度選擇是根據(jù)模板和引物配對結(jié)合強弱而定，它是反應(yīng)特異性的決定因素。⑧延伸溫度：70～72℃，為Taq酶最適反應(yīng)溫度。三、實驗儀器、材料與試劑1、實驗儀器與材料：臺式高速冷凍離心機，恒溫水浴，真空泵，PCR儀，臺式冷凍離心機、滅菌的微量離心管、凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠成像系統(tǒng)，冰箱、微量移液器、組織勻漿器，制冰機，一次性使用塑料手套和乳膠手套，豬肝組織。2、實驗試劑：

細胞裂解緩沖液

[10mMTris-Cl(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0),1%SDS]，70%乙醇，異丙醇，醋酸鉀(pH=4.8)[60ml的5mol/LKAc,11.5mL冰醋酸，28.5mlH2O]，TE(pH8.0)或無菌水，無DNase的RNaseA(10mg/ml)，蛋白酶K(20mg/mL)；

TaKaRaTaq

(5U/L)，10×PCRBuffer(Mg2+Plus)，dNTPMixture(each2.5mM)，豬肝基因組DNA，引物（ForwardprimerandReverseprimer)。四、實驗操作步驟（一）、豬肝組織DNA的抽提1、切下10-20mg組織，在液氮中碾磨成粉末。2、將粉末轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加0.6mL細胞裂解緩沖液和3μL蛋白酶K，混勻，置于55℃水浴中3h以上,但不要超過16h。3、消化液降至室溫，然后加入2μL無DNase的RNaseA，混勻。37℃水浴中放置0.5h。4、將樣品降至室溫，加入200μL醋酸鉀溶液，劇烈震蕩20sec使其充分混合。冰上放置5min。5、12000g離心5min（4℃

）。6、將上清液轉(zhuǎn)移到一個新離心管中，加0.6mL異丙醇。充分混勻，12000g離心5min（4℃

）。7、去掉上清，加入0.6mL70%乙醇。顛倒離心管數(shù)次，

12000g離心1min（4℃）。8、去掉上清，空氣中干燥DNA沉淀15min。9、將DNA沉淀溶解于100μLTE或水中。10、濃度和純度測定：

OD260/OD280；1OD260=50μg/mL1、設(shè)計PCR反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性2min后開始以下循環(huán)

94℃30sec55℃30sec25cycles72℃30sec72℃5min；

4℃冷卻恒定。（二）、PCR擴增基因片斷2、在0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分：

ddH2O:

18.0L10×buffer:2.5LdNTPs(2.5mM)1.0

L

Forwardprimer(10M)

:1.0LReverseprimer(10M)

:1.0LTaqDNA酶(5U/L)

:0.5L

TemplateDNA(20ng/L):1.0L

總體積25L3、混勻后，離心2-3sec，將PCR薄壁管放入PCR儀的樣品槽中，選擇預(yù)先設(shè)定的程序，按START鍵啟動

PCR儀。4、采用1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量、引物擴增的特異性。五、實驗結(jié)果與分析

1、提取的豬肝DNA進行電泳后，采用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照并對電泳圖譜進行適當(dāng)?shù)姆治觥?/p>