基因工程 (genetic engineering)課件

基因工程

基因工程(geneticengineering)在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，包括DNA片段之間的連接重組、基因克隆載體的構建、目的基因的獲得及含有目的基因的重組DNA導入受體細胞等一系列操作方法，最終獲得具有特殊性狀的新的生物類型。基因工程操作的對象是DNA分子。又稱為重組DNA技術基因工程概況DNA重組基因克隆載體目的基因重組DNA導入受體細胞基因工程的應用目錄1.基因工程的含義是指按照人類的愿望，將不同生物的遺傳物質在體外人工剪切并和載體重組后轉入細胞內進行擴增，并表達產生出所需的蛋白質的技術。

特點：打破物種之間的界限，在基因水平上改變生物遺傳性，并通過工程化手段為人類提供有用的產品及服務。2.1基因工程概況2.基因工程研究的理論依據(jù)不同基因具有相同的物質基礎。所有生物的DNA組成和基本結構都是一樣的?；蚴强汕懈畹??；蛑本€排列在DNA分子上?？梢酝暾囊粋€一個地從DNA分子上切割下來?；蚴强梢赞D移的。攜帶基因的DNA分子可以在不同生物體之間轉移，還可以在不同染色體間跳躍，插入到靶DNA分子之中。遺傳密碼是通用的。一系列三連密碼子同氨基酸之間的對應關系，在所有生物中都相同。基因可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代。經(jīng)重組的基因一般來說是能傳代的，可獲得穩(wěn)定的轉基因生物。多肽與基因之間存在對應關系?；虻霓D移或重組可根據(jù)其表達產物多肽的性質來考慮。mRNADNA3.基因工程基本路線

生物材料

RNAcDNA文庫基因組文庫人工合成克隆載體

目的基因受體細胞重組DNA

克隆子重組子

2.2DNA重組

在自然界，生物體內時刻發(fā)生DNA的重組,導致基因重組，呈現(xiàn)對生物有利或有害的變異?；蚬こ躺婕暗腄NA重組是根據(jù)人們的愿望，進行嚴密設計，在生物體外通過人為的DNA片段化和連接重組，產生新的重組DNA分子，使其遺傳信息發(fā)生預期的變化。

1.DNA的組成和結構

脫氧核糖核酸DNA是一類由脫氧核苷酸按照一定的順序聚合而成的大分子。脫氧核苷酸分子由脫氧核糖、堿基和磷酸基團組成。脫氧核苷酸每一個脫氧核苷酸含有一個戊糖（脫氧核糖）分子、一個磷酸分子和一個含氮的有機堿（堿基）。脫氧核糖上第1位碳原子與嘌呤或嘧啶結合，就成為脫氧核苷，第3位或第5位碳原子再與磷酸結合，就成為脫氧核糖核苷酸。脫氧核苷酸的有機堿分為兩類；一類是嘌呤，是雙環(huán)分子；一類是嘧啶，是單環(huán)分子。嘌呤包括腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)2種嘧啶有胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)2種。成為DNA的基本結構。T

脫氧核糖核酸—DNA

T T多個脫氧核糖核苷酸以磷酸順序相連成長鏈的多核苷酸分子，即

DNA雙鏈結構堿基互補配對：A與T配對、G與C配對，通過氫鍵相連形成雙鏈結構；并且G=C（三條氫鍵）、A=T（兩條氫鍵）。DNA變性：當溫度超過90℃時，氫鍵斷裂而解鏈成單鏈DNA。DNA復性：高溫變性的DNA被逐漸冷卻時，分開的兩條單鏈又重新結合成雙鏈DNA的過程。書寫順序：以5’→3’走向的單鏈DNA的核苷酸序列來表示。如DNA片段5’-GATCATGCATC-3’

3’-CTAGTACGTAG-5’可寫成5’-GATCATGCATC-3’。DNA的功能

在細胞內復制

?方式：半保留復制基本規(guī)律?需RNA引物、DNA聚合酶和四種dNTP

?需多種生物大分子參加

?合成方向：5′→3′

DNA的功能

攜帶遺傳信息中心法則轉錄——遺傳信息從DNA傳遞給核糖核酸(RNA)的過程。信使RNA(mRNA)轉運RNA(tRNA)核糖體RNA(rRNA)翻譯——遺傳信息通過mRNA進一步傳遞給蛋白質的過程。啟動子——轉錄過程中RNA聚合酶識別和結合的位點原核生物和真核生物啟動子區(qū)的結構比較轉錄終止子:基因編碼區(qū)下游一段使轉錄終止的核苷酸序列遺傳密碼密碼子的概念密碼子的性質

連續(xù)性 通用性 簡并性三個相鄰核苷為一組密碼子

在mRNA分子上三個連續(xù)的核苷酸組成一組，代表一個氨基酸，因而又稱為三聯(lián)體密碼，也叫氨基酸密碼。第一密碼第三密碼

遺傳密碼

第二密碼限制性內切酶

限制性內切酶

一類能識別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的反應條件下使每條鏈一定位點上的磷酸二酯鍵斷開，產生具有3’-OH基團和5’-P基團的DNA片段的內切脫氧核糖核酸酶。

Ⅰ型酶Ⅱ型酶Ⅲ型酶2.獲得需要的DNA片段

限制性內切酶的特點1.識別順序和酶切位點

１）識別４-8個相連的核苷酸HindIIIAAGGTT；BamHIGGATCC：

MaeIIIGTNACDraIIPuGGNCCPy２）富含ＧＣ３）對稱性—旋轉對稱或互補對稱EcoRI5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

４）切點大多數(shù)在識別順序之內，也有例外５）限制酶切后產生兩個末端，末端結構是

５’-Ｐ和３’-ＯＨPstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’5’-CTGCA3’-G

G-3’ACGTC-5’２）５’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’5’-GOH3’-CTTAAPPAATTC-3’

HOG-5’

限制性內切酶的特點

2.末端種類１）３’-端突起，個數(shù)為２或４個核苷酸

在進行DNA重組時，應用同種限制酶同時切割目的基因和載體DNA，使之產生互補的粘性末端，然后再將二者連接成重組DNA分子。GAATTC

CTTAAG并做如下切割：

5′······NNNNGAATTCNNN······3′

3′······NNNNCTTAAGNNN······5′限制性內切酶5′······NNNNGAATTCNNN······3′3′······NNNNCTTAAGNNN······5′EcoRI識別序列：CTGCAG

GACGTC并做如下切割：

5′······

NNNNCTGCAGNNN······3′

3′······NNNNGACGTCNNN······5′限制性內切酶5′······NNNNCTGCA3′······NNNNG

GNNN······3′ACGTCNNN······5′PstI識別序列：

限制性內切酶的識別序列EcoRI的識別序列是：5'-G-AATTC-3' 3'-CTTAA-G-5'

限制性核酸內切酶EcoRI的作用

同裂酶（isoschizomer）1.定義

能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制 酶。同裂酶產生同樣切割，形成同樣的末端，酶切 后所得到的DNA片段經(jīng)連接后所形成重組序列，仍 可能被原來的限制酶所切割。2.特點

1）識別相同順序

2）切割位點異、同KpnIGGTACC

SstICCGCGGAsp718GGTACC

SacICCGCGG

MunI的識別序列5'-CAATTG–3'3'-GTTAAC–5'

EcoRI的識別序列5'-GAATTC–3'3'-CTTAAG–5'

同尾酶（isocaudomers）定義

來源不同、識別及切割序列也不相同，但卻

能產生相同的粘性末端的限制酶。兩種同尾酶切 割形成的DNA片段經(jīng)連接后所形成的重組序 列，不能被原來的限制酶所識別和切割。EcoRI

和MunI同屬同尾酶。酶名稱識別序列產生菌BamHI

EcoRI

HindIII

KpnI

PstI

SmaI

XbaI

SalI

SphI

NcoI

GGATCC GAATTC AAGCTT GGTACC CTGCAGCCCGGG TCTAGA GTCGAC GCATGC CCATGG淀粉液化芽孢桿菌（BacillusamyloliuifaciensH）大腸桿菌（EscherichacoliRr13）流感嗜血桿菌（HaemophilusinfluenzaeRd）肺炎克雷伯氏桿菌（KlebsiellapneumoniaeOK8）普羅威登斯菌屬(Providenciastuartii164)粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescenssb)黃單胞菌屬(Xanthomonasbadrii)白色鏈霉菌(StreptomycesalbusG)暗色產色鏈霉菌(Streptomycesphaeochromogenes)珊瑚諾卡氏菌(Nocardiacorallina)一些常用限制酶的識別序列及其產生菌

限制性內切酶的酶切位點

概念?酶切位點?粘性末端（3’粘性末端、5’粘性末端）?平末端限制酶切割DNA分子示意圖DNA連接酶的連接作用示意圖

在合成重組DNA分子過程中，互補的堿基處雖然連接起來，但是這種連接只相當于把斷成兩截的梯子中間的氫鍵（踏板）連接起來，兩邊的扶手的斷口處還沒有連接起來，這就要靠另一種極其重要的工具——DNA連接酶。200多種限制性內切酶，切點各不相同。平整末端粘性末端

限制性內切酶反應系統(tǒng)

組成?酶?反應底物（環(huán)狀或線性的雙鏈DNA分子）?反應緩沖液?最適反應溫度為37℃。

限制性內切酶酶切DNA的方法?單酶切法用一種限制性核酸內切酶酶 切DNA樣品。環(huán)狀DNA酶切 后產生與識別序列數(shù)（n）相 同的DNA片斷，并且兩末端 相同。線形DNA分子則產生

n+1個片段，其中有兩個片 段仍保留原來的末端。限制性內切酶酶切DNA的方法?雙酶切法用兩種不同的限制性核酸內 切酶酶切同一種DNA分子的 方法。無論是環(huán)狀的還是線 形的DNA酶切結果產生的兩 個粘性末端不同。限制性內切酶酶切DNA的方法

選用的限制性內切核酸酶對 其在DNA分子上的全部識別 序列進行不完全的酶切。底物DNA純度低識別序列甲基化酶用量不足反應時間不夠反應緩沖液和溫度不適宜

?部分酶切原因

PCR擴增技術聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）即PCR法，是一種在體外快速擴增特定DNA序列的新技術。PCR技術只需數(shù)小時，就可在體外將該特定的基因擴增百萬倍，免除了基因重組和分子克隆等一系列繁瑣操作。

PCR基本原理

模仿細胞內發(fā)生的DNA復制過程進行的,以DNA互補鏈聚合反應為基礎，通過靶DNA變性、引物與模板DNA一側的互補序列復性雜交、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過程的多次循環(huán)，產生待擴增的特異性DNA片段。

PCR基本過程

①變性加熱至90?95℃，模板DNA經(jīng)熱變性，變?yōu)閮?條單鏈，作為互補鏈聚合反應的模板； ②復性使溫度下降至37?60℃，寡核苷酸引物即與模板

DNA中所要擴增序列兩端的堿基配對； ③延伸升溫至70?75℃，引物3’-端向前延伸，合成與 模板堿基序列完全互補的DNA鏈。

變性、復性和延伸三步驟構成一個循環(huán)，新合成的DNA鏈又可作為模板進行下一個循環(huán)的復制。DNA片段以2的指數(shù)增長，在1~2h內重復25~30次循環(huán)，擴增的DNA片段拷貝數(shù)可增至106~107倍。PCR擴增過程?聚合酶鏈式反應（PCR）變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結合延伸：以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈?聚合酶鏈式反應（PCR）每一輪聚合酶鏈式反應可使目的基因片段增加一倍30輪循環(huán)可獲得——230（1.07×109)個基因片段PCR擴增方式

耐熱性DNA聚合酶

耐熱性DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)使PCR擴增特異性DNA片段成為可能。由于這種酶在靶DNA變性的高溫下仍保持活性，所以在PCR擴增特異性DNA片段的全過程中，只需一次性加入反應系統(tǒng)中，不必在每次高溫變性處理后再添加酶。目前用于PCR的耐熱性DNA聚合酶主要有：

TaqDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、

TthDNA聚合酶、C.themDNA聚合酶。

PCR引物

引物是PCR過程中與模板DNA序列互補，并能引導模板DNA的互補鏈合成的一種脫氧核苷寡聚體，其３’端必須具有游離的—OH基團。為擴增特異性高的DNA片段，設計并用化學方法合成的引物由20?30個核苷酸組成。

3.DNA片段的連接重組DNA連接酶——催化雙鏈片段緊靠在一起的3’-OH末端與5’-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接，形成重組DNA分子。

T4DNA連接酶:1)相同或互補粘性末端的連接

2)平整末端的相連

E.coliDNA連接酶:互補粘性末端的連接

2.3基因克隆載體

克隆載體（cloningvector）：把一個有用的目的DNA片段（基因）通過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具。

作為克隆載體的基本要求：①能進行獨立自我復制；②具有便于外源DNA的插入和限制酶作用的單一切割位點；③必須具有可供選擇的遺傳標記；④不含有對受體細胞有害的基因，不會任意轉入其它生物的細胞。

?在基因工程中的載體

基因工程中使用的載體基本上均來自微生物，主要包括：

質粒載體

λ噬菌體載體 復合載體 病毒載體 人工染色體克隆載體

載體的選擇

是一個有自我復制能力的復制子（replicon)

能在受體細胞內大量增殖，即有較高的復制率。 載體上最好只有一個限制性內切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上。 載體上必須有一種選擇遺傳標記，以便及時將“工程菌”選擇出來。

載體的選擇

有條件作為載體的，對原核受體細胞來說，主要有細菌質粒（松弛型）和λ噬菌體兩類。

對真核微生物受體來說，主要有SV40病毒。

——SV40病毒是猴體內小型環(huán)狀雙鏈DNA病毒

對植物細胞受體來說，主要是Ti質粒。

1.質粒克隆載體

質粒是細菌染色體外能夠自主復制的環(huán)形雙鏈的DNA分子。經(jīng)人工修飾改造后作為克隆載體具有十分有利的特性：①具有獨立復制起點；②具有較小的相對分子質量，一般不超過15kb；③具有較高拷貝數(shù)，使外源DNA得以大量擴增；④易于導入細胞；⑤具有便于選擇的標記和具有安全性。 環(huán)形雙鏈的質粒DNA分子具有三種不同的構型： 共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，開環(huán)

DNA(ocDNA)，線性DNA(cDNA)，具有不同的電 泳遷移率，可在瓊脂糖凝膠電泳中分開。質粒的一般生物學特性編碼抗菌素抗性基因的質粒叫R質粒。R質?？蓪⑵淇剐赞D移到缺乏該質粒的適宜的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力。質粒的一般生物學特性質粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定的條件下又會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體地復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。質粒的一般生物學特性質粒DNA不僅能在細菌中復制，并且在添加真核復制信號和啟動子后，可以構建出能在原核和真核細胞中均可復制的穿梭質粒，并在真核細胞中表達，因此這類載體在基因工程中應用廣泛。質粒的拷貝數(shù)與不親和性質粒的拷貝數(shù)指某種質粒在一個細菌細胞內的數(shù)目。根據(jù)每個寄主細胞中質?？截悢?shù)的多少，把質粒分為嚴緊型復制質粒（拷貝數(shù)少，為1?5個）與松弛型復制質粒（拷貝數(shù)多，可達10?200份拷貝）。因此，作為載體的質粒應該是松弛型的。質粒的不親和性（不相容性）指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能在同一個寄主細胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細胞的增殖過程中，其中必然有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。Amp

大腸桿菌質粒載體

是應用最廣泛的克隆載體，含有大腸桿菌源質粒ColE1復制起始位點（Col-ori），能夠在轉化的大腸桿菌中按質粒復制的形式進行復制。pBR322是一種常用的典型的質粒載體。

HindIII BamHI PstI SalIScaIrpBR322(4.36kb)

oriAmp1.分子量較?。?363bp） 而拷貝數(shù)較大，每個細胞中可累積1000?3000個拷貝。2.具有兩種抗菌素抗性 基因：apr（氨芐西林抗性基因）、tcr（四環(huán)素抗性基因），可作為篩選轉化子的選擇標記基因。BamHISalIHindIIIPstIScaIroripBR322(4.36kb)

pBR322質粒載體?特點pUC18和pUC19質粒載體EcoRISacIKpnISmaIBamHIXbaISalIPstISphIHindIIIHindIIISphIPstI

pUC18SalIXbaIBamHISmaIKpnISacIEcoRIOriLacZ(2.68kb)AprpUC19

MCS為便于外源DNA片段的克隆，在載體合適的位置上組裝一個多克隆位點（MCS）連桿，如質粒載體pUC18、pUC19。

農桿菌Ti質粒載體

Ti質粒（tumorinducingplasmid）：誘癌質粒。致癌農桿菌含有一種內源質粒，可引起許多雙子葉植物的根癌。

Ti質粒是一種雙鏈環(huán)狀DNA分子，長200kb， 是一個大型質粒。當前，Ti質粒已成為植物遺傳工 程研究中的重要載體。一些具有重要性狀的外源 基因可借DNA重組技術設法插入到Ti質粒中，并 進一步使之整合到植物染色體上，以改變該植物 的遺傳性，達到培育植物優(yōu)良品種的目的。Ti質粒

酵母2m質粒載體

酵母是一種最簡單的單細胞真核生物，幾乎所有的釀酒酵母中都存在一種質粒，即2m質粒。一般將酵母2m質粒構建成穿梭質粒載體，含有2m質粒的復制起始位點和大腸桿菌源質粒的復制起始位點。

2.病毒（噬菌體）克隆載體把感染細菌的病毒稱為噬菌體，由此構件的載體 稱為噬菌體載體。

噬菌體感染細菌示意圖λ噬菌體克隆載體λ噬菌體優(yōu)點①其分子遺傳學背景十分清楚；②載體容量較大，一般質粒載體只能容納10kb，而λ噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段；③具有較高的感染效率，其感染宿主細胞的效率幾乎可達100%，而質粒DNA的轉化率卻只有0.1%。?λDNA構建克隆載體的依據(jù)

λDNA在噬菌體中以線狀雙鏈DNA分子存在，兩端各有5’凸出粘性末端而且互補，進入宿主細胞后，粘性末端連接成為環(huán)狀DNA分子。λDNA上約有20kb的區(qū)域對λ噬菌體的生長不是絕對需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代。?構建λ噬菌體載體克隆載體的原則①刪除基因組中非必需區(qū)，除去多余的限制位點；②在非必需區(qū)可組入選擇性標記基因；③構建的λDNA載體不應小于36.4kb。柯斯（Cosmid）質粒載體柯斯質粒載體（cosmidvector）即粘粒載體，由λ噬菌體的粘性末端和質粒構建而成?？滤官|粒載體含有來自質粒的一個復制起點、抗藥性標記、一個或多個限制酶單一位點，以及來自λ噬菌體粘性末端的DNA片段，即cos位點，其對于將DNA包裝成λ噬菌體粒子是必需的。Cosmid載體示意圖柯斯質粒載體的優(yōu)點①具有噬菌體的高效感染力②具有質粒DNA的復制方式③具有克隆大片段外源DNA的能力Cosmid質粒一般只有5~7kb左右，而它可克隆外源DNA片段的極度限值竟高達45kb，遠遠超過質粒載 體及λ噬菌體載體的克隆能力。植物病毒克隆載體?構建構建植物病毒克隆載體的基本策略：對病毒DNA進行加工，消除其對植物的致病性，保留其通過轉導或轉染能進入植物細胞的特性，是攜帶的目的基因導入植物細胞。?目前應用于植物細胞的克隆載體：①由Ti改建的克隆載體；②35S啟動子表達載體，是一類植物病毒克隆載體，能啟動目的基因在植物細胞中進行高效表達。動物病毒克隆載體?質?？寺≥d體不能用于動物基因，在動物轉基因研究中所用載體為動物病毒克隆載體。?目前用于構建克隆載體動物病毒：痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒、猿猴空泡病毒、反轉錄病毒。

以痘苗病毒DNA（線形雙鏈）作載體。將外源基因與痘苗病毒基因組的基因或基因同源重組，將外源目的基因整合到痘苗病毒基因組上，包裝后的重組痘苗病毒轉導敏感的動物。痘苗病毒載體

特點：①表達的產物更接近于天然產物的生物活性和理化性質；②外源基因插入量大；③宿主細胞廣泛；④表達產物可直接刺激機體產生體液和細胞免疫，純化過程簡單，產物性質穩(wěn)定，易于保存運輸；⑤所表達的外源目的基因在實驗動物中可提供保護性免疫反應。3.人工染色體克隆載體

酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）是一類目前能容納最大外源DNA片段人工構建的載體。

酵母染色體的控制系統(tǒng)主要包括：

①著絲粒（centromere,CEN）：它的作用是使染色體 的附著粒與有絲分裂的紡錘絲相連，保證染色體在細胞分 裂過程中正確分配到子代細胞。 ②端粒（telomere,TEL）：位于染色體兩個末端，功能 是保護染色體兩端，保證染色體的正常復制，防止染色體

DNA復制過程中兩端序列的丟失。③DNA復制起點（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）：其功能與酵母細胞復制有關。④抗藥基因標記、EcoRI限制位點、BamHI限制位點。酵母人工染色體和使用示意圖①用BamHI及EcoRI雙酶切YAC，獲得具有BamHI和EcoRI酶切末端的兩個DNA片段。②與兩端具EcoRI酶切末端的外源DNA連接，構成酵母人工染色體。將目標DNA并入YAC載體的步驟①真核細胞里的某些DNA序列，尤其是重復性序列，很難在細菌內復制。酵母細胞屬於真核細胞，較容易復制一般真核細胞的DNA序列。②YAC能攜帶長達1000kb-3000kb的DNA片段，比質?；颚耸删w多十倍。用于構建基因文庫、基因治療和基因功能鑒定。YAC載體優(yōu)點

2.4目的基因目的基因：在基因工程設計和操作中，被用于 基因重組、改變受體細胞性狀和獲 得預期表達產物的基因。 目的基因一般是結構基因，是能轉錄和翻譯出 多肽（蛋白質）的基因。1.目的基因的來源

取出

DNA用限制酶 切斷DNA將需要的基因從供體生物的細胞內提取出來。

目前被較廣 泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。2.分離目的基因的途徑????酶切直接分離法構建基因組文庫或cDNA文庫分離法PCR擴增法化學合成法

1.直接分離目的基因——鳥槍法

將供體生物的DNA用限制酶切割，分離出含目的基因的DNA片段，再用載體將這些片段運載到受體生物的不同細胞中去。只要有一個細胞獲得了需要的目的基因并得以表達，基因工程就算成功了。 該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉移到原核生物中去。用限制酶 切割2.PCR直接擴增法??PCR擴增目的基因片段適用于克隆序列清楚的基因。以目的基因DNA為模板，合成一對互補的引物，可十分有效的擴增出目的基因的DNA片段。

成合成DNA。2.直接合成法：根據(jù)蛋白 質的氨基酸順序推算出 信使RNA核苷酸順序， 再據(jù)此推算出基因DNA

的脫氧核苷酸順序。用 游離脫氧核苷酸直接合 成相應的基因。DNA合成儀

PCR擴增儀3.人工基因合成法

1.逆轉錄法：以信使RNA

為模板，在逆轉錄酶的 作用下將脫氧核苷酸合4.構建基因組文庫篩選目的基因

利用重組DNA技術，可將某種生物染色體基因組的全部遺傳信息貯存在由重組體群體之中，這種群體即為這種生物的基因組文庫。基因組文庫(genelibrary)基因組文庫（genelibrary）構建流程抽提基因組DNA鳥槍法制備DNA片段DNA片段與載體重組轉化宿主菌篩選目的基因基因組文庫的構建步驟1、從組織或細胞提取基因組DNA；2、用限制性酶部分水解成適當長度的DNA片段，經(jīng)分級分離選出一定大小合適克隆的DNA片段；3、通常采用λ噬菌體或柯斯質粒載體等容載量較大的克隆載體，在適當位點將載體切開；4、將基因組DNA片段與載體進行體外連接；5、重組體DNA直接轉化細菌或用體外包裝的重組λ噬菌體顆粒感染敏感細菌細胞。最后得到攜帶重組DNA的細菌群體或噬菌體群體即構成基因文庫。基因文庫的構建將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質?；蚴删w載體上，便構成了該生物的基因文庫。某種生物基因組轉錄的全部mRNA經(jīng)反轉錄產生的各種cDNA片斷分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌克隆子群體之中，這樣的群體稱為cDNA文庫。cDNA文庫(complementaryDNAlibrary)cDNA文庫的構建步驟①從生物體或細胞中提取mRNA；②利用逆轉錄酶以寡聚核苷酸為引物合成cDNA的一條鏈；③利用DNA聚合酶I，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當引物合成cDNA第二條鏈；④cDNA與載體的體外連接；⑤噬菌體的體外包裝及感染或質粒的轉化。從文庫中獲得目的基因

在構建文庫之后就需要從眾多的克隆中，篩選出含有目的基因的重組體，并鑒定其正確性。通常的鑒定方法是核酸探針法。探針（probes）：根據(jù)所需基因的核苷酸順序制 成一段與之互補的核苷酸短鏈，并用同位素標記。

2.5目的基因導入受體細胞

轉化法：通過生物學、物理學、化學等方法使外源裸露DNA進入受體細胞，并在受體細胞內穩(wěn)定維持和表達的過程。如果外源DNA分子是病毒（噬菌體）的DNA，則此過程稱為轉染。

轉導法：用病毒（噬菌體）DNA構建的克隆載體或攜帶目的基因的克隆載體，在體外包裝成病毒（噬菌體）顆粒后，感染受體細胞，使其攜帶的重組DNA進入受體細胞的過程。遺傳轉化常用的方法載體法轉化——農桿菌介導法基因的直接轉移（1）高壓電脈沖電激穿孔（2）基因槍法（3）微注射法

克隆子的篩選克隆子：攝取外源DNA分子并能使該分子在其 中穩(wěn)定維持的受體細胞。轉化子：采用各種轉化方法或轉導方法獲得的 克隆子。重組子：含有重組DNA分子的克隆子。①抗藥性記號插入失活選擇法

pUC118質粒的多克隆位點整合在lacZ基因中，該位點如果沒有插入外源目的基因，lacZ基因便可表達出-半乳糖苷酶。平板培養(yǎng)基中含有IPTG和X-gal，X-gal便會被-半乳糖苷酶水解成藍色，大腸桿菌形成藍色克隆。

在多克隆位點插入外源目的基因，破壞了lacZ基因的結構，大腸桿菌形成白色的克隆。利用lacZ基因的插入失活篩選重組質粒和乳糖重組子的鑒定瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團帶負電荷酶解片段向陽極移動電場驅動力和凝膠阻力——不同遷移率分子量標準參照物酶切和電泳方法無菌落篩選重組子的示意圖AmprTcAmprTcs

有DNA插入 外源DNA

AmprTcs

陽性菌落提取DNA

電泳

重組DNA

1)限制酶切

2)DNA重組 無DNA插入

AmprTcr

轉化AmprTcr

篩選重組子

AmprTcs外源DNAApr利用菌落顏色篩選重組子Apr無DNA插入

1)限制酶切

2)DNA重組 有DNA插入

AprApr

轉化Apr

篩選重組子 白色菌落 提取DNA

電泳

重組DNA Apr32P標記的DNA分子探針雜交放射自顯影法DNA雜交直接鑒定紀念發(fā)明者EdwardSouthern（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（