蛋白質(zhì)的十種提取方法

蛋白質(zhì)的十種提取方法.txt大人物的悲哀在于他們需要不停地做出選擇；而小人物的悲哀在于他們從來沒有選擇的機(jī)會(huì)。男人因滄桑而成熟，女人因成熟而滄桑。男人有了煙，有了酒，也就有了故事；女人有了錢，有了資色，也就有了悲劇。蛋白質(zhì)提取方法列舉10種方法[來源：綠谷生物網(wǎng)點(diǎn)擊數(shù)：4587更新時(shí)間：2008年05月30日][收藏本文]一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法（summer）1、根據(jù)樣品重量（1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入），準(zhǔn)備提取液放在冰上。2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置（3-4小時(shí)）。3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃4、提取上清夜，樣品制備完成。蛋白質(zhì)提取液：300ml1、1Mtris-HCl（PH8）45ml2、甘油（Glycerol）75ml3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g這種方法針對(duì)SDS，垂直板電泳！二、植物組織蛋白質(zhì)提取方法(summer)三氯醋酸—丙酮沉淀法1、在液氮中研磨葉片2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）棄上清。3、加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)），然后真空干燥沉淀，備用。4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)），可臨時(shí)保存在4℃待用。5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩Ｋ幤罚禾崛∫海汉?0%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！三、組織：腸黏膜（newinbio）目的：WESTERNBLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min離心：12000g，10min，4度，棄上清加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量）振蕩，置室溫20min離心：7500g，5min，4度，棄上清重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次沉淀中加入100％乙醇2ml充分振蕩混勻，置室溫20min離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀1％SDS溶解沉淀離心：10000g，10min，4度取上清-20度保存（或可直接用于WESTERNBLOT）存在的問題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml左右。解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。四、lysissolution:（yog）Proteinextractionbuffer(Camiolobuffer):100ml=(0.075MPotassiumAcetate)0.736g(0.3M)NaCl1.753g(0.1M)L-argininebasicsalt1.742g(0.01M)EDTA-HCl0.292g(0.25%)TritonX-100250.ulupto100mlwithdH20.pH7.4.Then0.2umfilter.1.Freezetissueinliquidnitrogen.2.RinseinPBSthenmince.3.Add1mlCamioloextractionbufferper100mgoftissue.4.Homogenizefor1minuteat4\'C.5.Spinat3,000.rpm/15minutes/4\'C.6.Removesupernatantandsaveinanothertube.7.Ifnecessary,dializethesupernatantagainstPBSwith50mM/LTris-HClpH7.4.五、植物材料：水稻苗，葉鞘，根（ynibcas）1、200毫克樣品置于冰上磨碎2、加lysisbuffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清3、重復(fù)離心5minlysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40六、蛋白質(zhì)樣品制備（sigma）秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇），混勻，-20℃沉淀1小時(shí)，4℃，15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。按每mg干粉加入20μl（可調(diào)）UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃溫育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度（溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰）16000r/min離心15min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳。或者-70度保存七、植物根中蛋白質(zhì)的抽取（phenol）(1)sample,液氮研磨(2)裝1.5mlcentrifuge用tube(3)加1MKH2PO4+K2HPO4700ul(4)12000rpm,4度,10-15minite(5)取上層液，蛋白質(zhì)就在里面八、SDSextractionfollowedbyacetoneprecipitation–simpleextractionprotocolthatdoesnotrequirephenol.Recommendedstartprotocolforwholetissueextractions.（hgp）1.Grind1goffreshtissuetoapowderwithliquidnitrogeninamortarandpestle.2.Add5mLofextractionmedia(0.175MTris-HCl,pH8.8,5%SDS,15%glycerol,0.3MDTT)directlytomortarandcontinuegrindingforanadditional30sec.3.Filterhomogenatethroughtwolayersofmiraclothintoa50mLFalcontubeatroomtemperature.4.Immediatelyadd4volumesoficecold100%acetonetofilteredhomogenate,mixbyvortexingandplaceat-20Cforatleastonehourtoprecipitateproteins.5.Centrifugeat5000gfor15mintocollectprecipitatedprotein,decantsupernatant.6.GentlyblotresidualacetonefromcontainerwithKimwipeandthenwashpelletin15-20mLofcold80%acetone.Besuretothoroughlybreak-uppelletbypipetting,vortexingorsonication.7.Repeatsteps5and6.8.Collectfinalproteinprecipitatebycentrifugationat5000gfor15minanddrypelletbyinvertingonKimwipefor15minat37C.9.Resuspendfinalpelletin0.5-1mLofIEFextractionsolution(8Murea,2Mthiourea,2%CHAPS,2%TritonX-100,50mMDTT,0.2%pH3-10ampholytes)bypipettingandvortexingat25-30C.Incubatesamplefor1hatroomtemperaturewithagitation.Donotheatsampleunderanycircumstancesasthiswillleadtocarbamylationofproteins.10.Centrifugefor10minat12000gandusesupernatanttorehydrateIPGstrips.11.Ifproteinquantitationisnecessary,precipitateproteinsamplewithTCAoracetonepriortoperformingBradfordorLowryassayasdetergentsandreducingagentsinterferewiththeseassays.Phenolextractionfollowedbymethanolicammoniumacetateprecipitation–aneffectiveprotocolforsamplepreparationfromprotein-poor,recalcitranttissuessuchasplants(seeHurkmanandTanaka,1986,PlantPhysiology81:802-80九、材料：細(xì)菌蛋白（puc18）用甲醇提取的，凍干后用緩沖液溶解的。樣品緩沖液是一般的。其中含又2%的SDS，20mmol的2-巰基乙醇。十、線粒體蛋白的提取(bioon)IsolationforMitochondriaModificationbyBioonMaterialsandreagents:homogenizingbuffer:100mMmannitol10mMTris-HClbuffer(pH7.5)5mMMgCl2關(guān)于蛋白質(zhì)1mMEGTA1mMDTTleupeptin(0.1ug/ml)0.1MNa2CO3Methods:-10*6Cellswerewashedwithice-coldPBSandlysedbyhomogenizingin1mlbuffer(ice-cold)containing100mMmannitol,10mMTris,5mMMgCl2,1mMEGTA,1mMDTT,leupeptin(0.1ug/ml)-SubjectedtoPolytronhomogenizationforthree-fourburstsof3-10seachatasettingof6.5.-Intactcellsandnucleiwereseparatedbycentrifugationat120gfor5minat4℃-Supernatantswerecentrifugedat10,000gfor10mintocollecttheheavy(mitochondrial)membranepellet.-Cytoplasmicfractionswereobtainedbycentrifugingsupernatantsat100,000gfor30min.-Resuspendedpelletto0.25mg/mlinfreshpreparationof0.1MNa2CO3(pH11.5)-Incubatedonicefor30min.-Ultracentrifugationat100000gfor1hat4℃toprecipitatethemitochondriamembraneprotein.Andthesupernatantsaremitochondrialmatrix.0.5mgofproteinsinmitochondriacanget100ugofproteins(thealkali-resistantfractions)Ref.:PNAS,2002，99：12825–12830本方法只適用于提大鼠細(xì)胞線粒體蛋白，而不適用于線粒體功能檢測(cè)

考馬斯亮藍(lán)染色一產(chǎn)品簡(jiǎn)介：本考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒Staining采用了最經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)染色和脫色方法，以考馬斯亮藍(lán)為染料，或非變性等蛋白電泳凝膠的常規(guī)染色和脫色，或膠上殘余蛋白的檢測(cè)。使用本試劑盒，采用常規(guī)染色脫色方法累計(jì)時(shí)間達(dá)到2-3小時(shí)后可以觀察到蛋白條帶；采用快速染色脫色方法20分鐘左右即可觀察到蛋白條帶。觀察到最清晰的蛋白條帶則需染色脫色更長(zhǎng)時(shí)間。本試劑盒中的染色液和脫色液經(jīng)過改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性氣味的乙酸。二保存條件：室溫保存，至少一年有效。注意事項(xiàng)：可以使用槍頭盒或適當(dāng)大小的培養(yǎng)皿作為染色和脫色的容器。本染色液呈酸性，有輕微腐蝕性，使用時(shí)請(qǐng)作必要防護(hù)。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。三使用說明：1.常規(guī)染色脫色方法：a.電泳結(jié)束后，取凝膠放入適量考馬斯亮藍(lán)染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠。b.置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)，1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。注：具體的染色時(shí)間取決于凝膠的厚度和染色時(shí)的溫度。凝膠較厚，溫度較低，則染色時(shí)間宜適當(dāng)延長(zhǎng)。凝膠較薄，溫度較高，則染色時(shí)間可以適當(dāng)縮短。通常染色至凝膠的顏色和染個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)對(duì)最終的染色效果產(chǎn)生負(fù)面影響。c.2-3次。d.加入適量考馬斯亮藍(lán)染色脫色液，確保脫色液可以充分覆蓋凝膠。e.置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫脫色4-24小時(shí)。期間更換脫色液2-4次，直至藍(lán)色背景基本上全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達(dá)到預(yù)期。通常蛋白條帶在脫色1-2小時(shí)后即可出現(xiàn)。注：脫色期間可以在脫色液中加入一片吸水紙，可以使部分染料吸附在吸水紙上，加快脫色。脫色時(shí)間過長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致蛋白條帶的顏色變淺。f．凝膠保存在水漲。如需避免溶漲，可以把膠保存在含20%甘油的水中。長(zhǎng)期保存可以制備干膠。2.快速染色脫色方法：a.電泳結(jié)束后，取膠放入適量考馬斯亮藍(lán)染色液中，微波爐加熱至接近沸騰或剛剛沸騰，立即停止加熱。通常對(duì)于膠濃度大于10％的膠比較堅(jiān)韌，在發(fā)生煮沸時(shí)不易破損；對(duì)于膠濃度小于10%的膠，宜盡量避免煮沸，以免出現(xiàn)膠碎裂的情況。b.隨后在分鐘。c.2-3次。d.加入適量考馬斯亮藍(lán)染色脫色液，確保染色液可以充分覆蓋凝膠。e.微波爐加熱至接近沸騰或剛剛沸騰，立即停止加熱。隨后在脫色液溫度較