NGF復(fù)合涂層,口腔論文

在牙種植體表面構(gòu)建鈣磷離子/NGF復(fù)合涂層,口腔論文隨著當(dāng)代口腔種植技術(shù)的日益完善,種植義齒修復(fù),在條件允許的情況下,已成為治療牙列缺損、缺失,恢復(fù)口腔咀嚼功能的最佳手段。種植體植入頜骨后與周圍骨組織能否構(gòu)成良好的骨整合(osseointegration),以及骨整合構(gòu)成的快慢、新生骨組織的質(zhì)和量是影響種植體成功率的重要因素。

當(dāng)前臨床常用的各類純鈦及其合金種植系統(tǒng)通過微螺紋和/或雙螺紋的設(shè)計、噴砂-酸蝕(sand-blastedandacid-etched,SLA)的外表處理而具有一定的骨傳導(dǎo)能力,但無骨誘導(dǎo)性。近年來,學(xué)者們嘗試通過種植體外表的生物功能化改性技術(shù),將多種調(diào)控骨改建經(jīng)過的細(xì)胞生長因子,如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMPs)、血小板衍生因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)和神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor,NGF)等,應(yīng)用于促進種植體周骨組織再生,獲得了眾多成果。

神經(jīng)生長因子(nervegrowthfactor,NGF)于1953年被Levi-Montalcini和Hamburger首先發(fā)現(xiàn),具有促進神經(jīng)再生和骨折愈合的雙重作用,在改善種植體臨床效果方面意義重大。因而,本研究擬通過模擬體液(simulatedbodyfluid,SBF)仿生沉積法,在種植體外表構(gòu)建鈣磷離子/NGF復(fù)合涂層,以期為種植體成功率的進一步提高和遠(yuǎn)期效果的進一步改善以及新型口腔種植體的開發(fā)提供一定的實驗根據(jù)。

1、材料與方式方法

1.1種植體的外表處理

本實驗所采用的柱狀鈦合金(Ti6Al4V)種植體由四川大學(xué)國家生物材料工程研究中心提供,外表無螺紋,直徑為1.0mm,長度為12mm。所有種植體外表均依次進行了如下處理:240、360、600目砂紙逐級打磨,75mTiO2顆粒噴砂,丙酮、乙醇、去離子水45℃超聲清洗各30min后,枯燥備用;63.6%硫酸、10.6%鹽酸依次60℃水浴各10min,去離子水45℃超聲清洗30min后,枯燥備用;5mol/LNaOH溶液60℃水浴24h,去離子水45℃超聲清洗30min,枯燥24h后600℃處理1h,無菌條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2涂層的制備

無菌條件下,隨機選取外表處理后的種植體,置入鈣磷離子濃度為正常值5倍,大鼠NGF濃度為10mg/L的SBF中(Ca2+濃度為2.5mmol/L、HPO2-4濃度為1.0mmol/L、pH=7.40),37℃水浴,每隔24h換液一次,48h后取出,枯燥備用。制備完成后的種植體均在-80℃下避光保存。

1.3外表形貌觀察

使用JSM-5900LV掃描電子顯微鏡(電子株式會社,日本;加速電壓10kV)觀察在4000、100000放大倍數(shù)下Ca/P/NGF涂層的外表形貌。

1.4涂層厚度及強度檢測

1.4.1涂層厚度的檢測種植體(n=3)經(jīng)聚甲基丙烯酸甲脂(poly-methyl-meth-acrylate,PMMA)包埋后,用金剛鋸在種植體長軸中點垂直長軸切開,使用掃描電子顯微鏡檢測其橫斷面涂層厚度均勻區(qū)域的多個位點,取其平均值。

1.4.2涂層結(jié)合強度的檢測Revetest使用聲發(fā)射劃痕儀(CSMInstruments,瑞士;金剛石球狀壓頭直徑0.2mm,劃痕速度10mm/min,加載速率20N/min)檢測涂層(n=3)的臨界載荷。每個試件檢測3次,取其平均值。

1.5ELISA法檢測涂層所含NGF的總量及體外緩釋規(guī)律

1.5.1涂層所含NGF總量的檢測機械剝離Ca/P/NGF涂層,溶解于1mL含20%乙二胺四乙酸(ethylenediamineyetraaceticacid,EDTA)的溶液中,震蕩均勻。將適量所獲得的EDTA溶液稀釋10倍和100倍后進行NGF濃度的ELISA法檢測。

1.5.2涂層體外釋出NGF量的檢測將Ca/P/NGF涂層(n=6)種植體置入含有5mLPBS的10mL離心管中,37℃水浴搖床,每隔1周換液一次,共4周。每次換液前,先使浸入的種植體脫離液面,用洗耳球盡量將種植體上殘留的液體吹入離心管中,震蕩均勻。將適量所獲得PBS浸泡液稀釋10倍和100倍后進行NGF濃度的ELISA法檢測。

1.5.3NGF濃度的ELISA法檢測將100L稀釋10倍后的樣本和100L稀釋100倍后的樣本參加大鼠神經(jīng)生長因子ELISA試劑盒的96孔板中,與標(biāo)準(zhǔn)品一起經(jīng)第一抗體工作液、酶標(biāo)抗體工作液、底物工作液、終止液反響后,30min內(nèi)用酶標(biāo)儀測定450nm波長處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的吸光度/濃度曲線,可獲得樣本中NGF的濃度,再乘以體積(1mL/5mL),計算得出涂層所含NGF的總量以及每1周時間段內(nèi)體外釋出NGF的量。

1.5.4種植體浸泡液鈣磷離子濃度的檢測及統(tǒng)一使用實驗室離子+pH計(IM-55G,DKK-TOA,日本)檢測各周種植體浸泡液中鈣磷離子的濃度及pH值,并取各周等量浸泡液根據(jù)SBF的配制方式方法配制等量、Ca2+濃度為2.5mmol/L、HPO2-4濃度為1.0mmol/L、pH=7.40的溶液。

1.6NGF體外活性測定

1.6.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmes-enchymalstemcells,BMSCs)的分離、培養(yǎng)、擴增取4周齡SD大鼠3只,斷頸處死,無菌條件下分離股骨和脛骨,減去干垢端,DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔,獲得的細(xì)胞懸液以1000r/min的速度離心10min,棄掉上清液及雜質(zhì),重新懸浮后緩慢加于等體積、密度為1.077g/mL的細(xì)胞分離液之上,避免混合。2000r/min的速度離心20min后,取中間云霧狀的細(xì)胞層于另一離心管中,PBS沖洗,按1109/L的密度接種于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中,置于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的孵箱中培養(yǎng),24h后初次換液,棄除未貼壁細(xì)胞,每隔3~4d換液一次。原代細(xì)胞(P0)聚合后,用含0.02%EDTA的2.5g/L的胰蛋白酶消化,按1∶3的比例進行傳代。

1.6.2大鼠BMSCs定向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)將生長良好的第二代大鼠BMSCs(P2)消化后,按1107/L的密度接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板,共24個孔,參加含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、0.1mol/L地塞米松、10mmol/L-甘油磷酸鈉、50mol/L維生素C、100U/L雙抗的成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)液,分為8組,再分別參加等量各周種植體浸泡液配制的溶液(見1.5.4)和SBF。將培養(yǎng)板置于37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的孵箱中培養(yǎng),每隔2~3d換液一次。使用倒置相差顯微鏡(CKX41,Olympus,日本)觀察2周后茜素紅染色下鈣化結(jié)節(jié)的構(gòu)成情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

測定的數(shù)據(jù)以平均值標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示,使用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行t檢驗。P0.05被以為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2、結(jié)果

2.1涂層的外表形貌

4000放大倍數(shù)下的涂層外表以成團圓集的微晶為主要特征,凹凸不平,一定程度上增加了材料外表的粗糙度。100000放大倍數(shù)下的涂層外表以無數(shù)納米級的小球為主要特征,小球粒度約為200nm(圖1-2)。

2.2涂層的厚度

涂層的平均厚度為(11.20.26)m。

2.3涂層的結(jié)合強度

涂層的平均臨界載荷為(6.80.37)N(圖3)。

2.4涂層的體外緩釋規(guī)律

本實驗使用的大鼠神經(jīng)生長因子ELISA試劑盒,其最小的NGF檢測濃度小于15pg/mL。所得的數(shù)據(jù)見圖4。涂層所含NGF的總量為0.620g,PBS浸泡4周后,釋出了總量的79.03%。

2.5涂層釋出NGF的體外活性

第2代大鼠BMSCs(P2)定向成骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)14d后,行茜素紅染色,倒置相差顯微鏡觀察(圖5),均有鈣化結(jié)節(jié)構(gòu)成。涂層種植體浸泡液培養(yǎng)孔,鈣化結(jié)節(jié)的平均數(shù)目和尺寸均大于同濃度鈣磷離子溶液培養(yǎng)孔(P0.05)。

3、討論

最初的Branemark種植系統(tǒng)外表光滑,是臨床應(yīng)用最早、隨訪時間最長的一類種植系統(tǒng)。但隨著研究的深切進入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn),外表粗糙的種植體具有更好的骨傳導(dǎo)性,與周圍骨組織的結(jié)合愈加牢固,遠(yuǎn)期效果要優(yōu)于外表光滑的種植體。

骨整合的構(gòu)成是一個成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在相關(guān)因子的影響下共同作用的骨改建經(jīng)過,這些因子主要包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs),轉(zhuǎn)化生長因子-(TGF-)、胰島素樣生長因子(IGFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和神經(jīng)生長因子(NGF)等。由美國科學(xué)家Puleo首先提出的種植體外表生物化學(xué)改性,就是利用分子生物學(xué)和化學(xué)方式方法將多肽、蛋白質(zhì)及細(xì)胞生長因子等生物活性分子復(fù)合于種植體外表,構(gòu)建新一代的分子生物材料,促進有利反響和/或抑制不利反響。能保持生物活性分子復(fù)合于種植體外表后的生物活性,是此法最突出的特點。根據(jù)所要復(fù)合的生物活性分子種類的不同,主要有吸附法、化學(xué)鍵結(jié)合法和復(fù)合涂層法。

吸附法操作簡單,但生物活性分子在種植體外表結(jié)合強度低、吸附的總量、密度及分布都無法控制,個體差異也較大;植入體內(nèi)后,隨體液擴散迅速,其作用與局部注射法類似,作用的部位固然更直接,但仍難以保持治療濃度和有效時間。復(fù)合涂層法是對吸附法的改進,適用于大多數(shù)生物活性分子。它是以模擬體液仿生沉積為基礎(chǔ),生物活性因子通過與鈣磷離子共同沉積的方式復(fù)合于種植體外表,構(gòu)成生物活性分子全層均勻分布的鈣磷離子涂層。植入體內(nèi)后,隨著鈣磷離子涂層外表的緩慢溶解,生物活性分子被逐步釋放于周圍組織中,具有一定的緩釋作用。

制備鈣磷離子涂層的方式方法很多,主要包括等離子噴涂、溶膠-凝膠等物理化學(xué)方式方法和模擬體液仿生沉積的生物化學(xué)方式方法。模擬體液仿生沉積的生物化學(xué)方式方法,是通過模擬生理狀態(tài)下鈣磷離子的自然沉積來制備HA涂層。與物理化學(xué)方式方法相比,此法在人體正常體溫下進行,避免了高溫所引起的相變,有利于加強涂層與種植體外表的結(jié)合力;通過控制模擬體液中鈣磷離子的濃度,可制得致密的,低結(jié)晶度的,具有一定溶解性的涂層;生物活性分子能夠其作為載體復(fù)合于種植體外表。

本實驗所采用的涂層制備方式方法是改進后的模擬體液仿生沉積。種植體外表先進行噴砂-酸蝕,提高外表的粗糙度和自由能;再通過堿熱處理,構(gòu)成富含Ti-OH的活性外表,種植體外表粗糙度和自由能的提高以及活性的加強都能促進鈣磷離子在其外表的沉積。將外表處理后的種植體浸泡入不含NGF和含有不同濃度NGF、鈣磷離子濃度為正常值5倍的模擬體液中,37℃水浴48h,最終制得的涂層外表以成團圓集的微晶為基礎(chǔ),以無數(shù)納米級的小球為次級構(gòu)造。

本實驗制備的復(fù)合涂層的平均厚度為(11.20.26)m,平均臨界載荷為(6.80.37)N。與溶膠-凝膠法制備的HA涂層相比,本實驗制備的涂層厚度是其10倍(0.9550.105)m,臨界載荷類似;而與材料外表未經(jīng)處理的鈦合金試件通過模擬體液兩步沉積72h法制備的HA涂層相比,本實驗制備的涂層厚度是其1/2(25.006.4)m,但臨界載荷更高層次(1.80.08)N。講明模擬體液仿生沉積制備的復(fù)合涂層厚度與沉積時間有關(guān);通過噴砂-酸蝕和堿熱處理,提高材料外表的粗糙度和外表能,加強材料外表的活性,能夠促進鈣磷離子的沉積并加強涂層的結(jié)合強度。臨床植入種植體時的扭矩往往到達35Ncm,遠(yuǎn)高于復(fù)合涂層的平均臨界載荷。涂層能否會在植入經(jīng)過中發(fā)生脫落是下一步的動物實驗需要探明的問題。

本實驗制備的涂層種植體含有(0.620.005)gNGF,經(jīng)PBS浸泡、37℃水浴搖床4周后,釋出了總量的79.03%,這講明涂層的體外緩釋作用可持續(xù)至少4周。涂層在第1周釋出NGF的量明顯多于后3周,這是由于沉積時間結(jié)束的時候,涂層外表有部分NGF分子還未被鈣磷離子完全包裹,或是剛剛吸附于已成形的復(fù)合涂層外表。浸泡入PBS后,這部分結(jié)合疏松的NGF分子首先脫離涂層外表,進而引起了釋出量的激增。而在第2、3、4周,兩種涂層的NGF釋出量逐步降低,這與鈣磷離子自然沉積構(gòu)成的HA涂層越接近材料外表,構(gòu)造越致密,溶解性越小的特點是一致的。

有學(xué)者觀察并檢測了NGF在種植體早期骨整合中的表示出,以組織切片NGF免疫組化染色陽性率進行比擬,發(fā)現(xiàn)種植體植入后,NGF的表示出便開場增加[(44.43.7)%],并在第2、3周增加到并維持在一個較高的水平[(第2周:(74.33.2)%;第3周:(74.93.6)%],第4周開場降低[(31.12.7)%]。本實驗制備的NGF/HA復(fù)合涂層,其在第1周釋出量多的特點,正好能夠彌補生理