大鼠內(nèi)耳的解剖結(jié)構(gòu)與內(nèi)耳膜迷路獲取技術(shù),人體解剖學(xué)論文

大鼠內(nèi)耳的解剖結(jié)構(gòu)與內(nèi)耳膜迷路獲取技術(shù),人體解剖學(xué)論文大鼠作為動物模型，被廣泛地應(yīng)用于內(nèi)耳研究中，包括化學(xué)制劑和重金屬的耳毒性研究，噪聲、沖擊波的損害性試驗，以及各種原因所致聽力損失的治療研究等。盡管各種實驗的內(nèi)容和目的不同，但都不可避免地需要觀察和評估大鼠內(nèi)耳的病理改變或者需要取出內(nèi)耳膜迷路結(jié)合分子生物學(xué)檢查方式方法評判某些特定基因或特殊蛋白質(zhì)的變化。因而，了解大鼠內(nèi)耳構(gòu)造、把握大鼠內(nèi)耳膜迷路取材技術(shù)是開展內(nèi)耳研究的最基本訓(xùn)練科目之一。本文重點介紹大鼠內(nèi)耳的解剖構(gòu)造及大鼠內(nèi)耳膜迷路取材技術(shù)，以期與同道溝通，并為初學(xué)者提供參考經(jīng)歷體驗。1大鼠內(nèi)耳的解剖構(gòu)造大鼠內(nèi)耳位于顳骨內(nèi)，其骨性外殼被稱為骨迷路〔BonyLabyrinth〕〔圖1A〕，內(nèi)部包裹與骨迷路形狀類似的懸浮于外淋巴液中的膜迷路〔MembranousLaby?rinth〕〔圖1B〕。內(nèi)耳可分為前部的耳蝸〔Cochlea〕和后部的前庭〔Vestibule〕兩部分。1.1耳蝸大鼠骨性耳蝸是一個中空盤旋2.2周的螺旋形骨管，華而不實心的蝸軸〔modiolus〕在大鼠正常頭位時指向前下方。為描繪敘述方便，我們暫且規(guī)定蝸尖朝上。蝸軸上呈螺旋狀發(fā)出的骨性螺旋板〔osseousspirallami?na〕自蝸底向頂部盤旋，向外與耳蝸基底膜〔basilarmembrane〕相接。在骨性螺旋板下方的蝸軸內(nèi)部有一個類似螺旋式盤旋的骨管，稱為蝸軸螺旋管〔RothenthalsCanal〕，其內(nèi)為螺旋神經(jīng)節(jié)〔spiralgan?glion〕，包括神經(jīng)元〔SpiralGanglionNeurons,SGNs〕、膠質(zhì)細(xì)胞、耳蝸傳入和傳出神經(jīng)纖維等〔圖1C〕。SGNs可分為Ⅰ型和Ⅱ型。華而不實Ⅰ型SGNs約占傳入神經(jīng)元總數(shù)的90-95%,Ⅱ型SGNs約占傳入神經(jīng)元總數(shù)的5-10%[1,2].兩類傳入神經(jīng)纖維和傳出神經(jīng)纖維僅在穿出疆孔之前有施萬細(xì)胞包裹，進入基底膜耳蝸螺旋器〔Cortiorgan〕的傳入和傳出神經(jīng)纖維均裸露不再有髓鞘包裹。華而不實Ⅰ型傳入神經(jīng)末梢與內(nèi)毛細(xì)胞〔InnerHairCells,IHCs〕建立突觸聯(lián)絡(luò)，Ⅱ型傳入神經(jīng)末梢與外毛細(xì)胞〔OuterHairCells,OHCs〕相接〔圖3A〕。進入IHCs下方的來自內(nèi)橄欖核耳蝸束神經(jīng)纖維的末梢與Ⅰ型傳入神經(jīng)纖維建立突觸聯(lián)絡(luò)但并不與內(nèi)毛細(xì)胞直接接觸，而橫穿Corti隧道進入外毛細(xì)胞下方的耳蝸上隧道傳出神經(jīng)纖維的末梢則與OHCs建立直接的突觸聯(lián)絡(luò)。在一般情況下，一個內(nèi)毛細(xì)胞與大約20個Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)末梢相聯(lián)絡(luò)，而一根Ⅱ型傳入神經(jīng)纖維則與大約10個外毛細(xì)胞相聯(lián)絡(luò)。因而不難根據(jù)毛細(xì)胞的數(shù)目對Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)總數(shù)和Ⅱ型螺旋神經(jīng)節(jié)總數(shù)做大致的推算[1,3].蝸軸螺旋管內(nèi)所有神經(jīng)纖維的另一端經(jīng)螺旋管內(nèi)側(cè)骨壁進入蝸軸中心會聚成聽神經(jīng)束，在內(nèi)聽道的底部向內(nèi)轉(zhuǎn)彎入顱。由于外毛細(xì)胞的高度自耳蝸底回向頂回逐步增加，內(nèi)、外毛細(xì)胞的靜纖毛長度也相應(yīng)變長，因而Cor?ti器的高度、寬度及質(zhì)量在耳蝸的不同部位并不一樣，其受力后形變的程度〔其倒數(shù)即為勁度〕自然也不一樣。小鼠耳蝸Corti器的寬度從耳蝸底回向頂回逐步變寬，但基底膜的寬度從耳蝸底回向頂回卻是逐步變窄，這顯然與很多教學(xué)材料中對耳蝸基底膜寬度描繪敘述明顯不同[6].大鼠耳蝸Corti器的寬度從耳蝸底回向頂回也是逐步變寬，基底膜的寬度變化同樣是由寬變窄，但是并不像小鼠那樣明顯，這一點顯然既不同于教學(xué)材料中對人類基底膜寬度變化的描繪敘述也不同于小鼠的基底膜寬度變化特征〔圖2C〕，因而，我們以為Corti器的寬度、勁度和質(zhì)量才是造成耳蝸不同部位具有不同頻率響應(yīng)的關(guān)鍵因素，而并不完全取決于基底膜的寬度。1.2前庭大鼠的前庭由前庭池〔vestibularcavity〕和半規(guī)管〔semicircularcanals〕組成。前者位于內(nèi)耳中部，其外壁中部的卵圓窗〔ovalwindow〕被鐙骨底板及環(huán)韌帶封閉，上壁與上鼓室相隔，后壁與弓狀下窩相隔，內(nèi)壁與后顱窩相隔，下壁介入構(gòu)成巖骨底面顱底〔圖1A〕。在大鼠前庭池內(nèi)側(cè)骨壁的前下方有一個扁平的球囊〔saccule〕，后上方為啞鈴狀的橢圓囊〔utricle〕〔圖1D、2A〕。球囊的下方靠外經(jīng)聯(lián)合管〔ductusreuni?ens〕與蝸管相通，靠內(nèi)經(jīng)內(nèi)淋巴管〔endolymphaticduct〕與內(nèi)淋巴囊〔endolymphaticsac〕相通[7].開口于橢圓囊后壁下角的前庭導(dǎo)水管〔vestibularaqueduct〕也向內(nèi)與內(nèi)淋巴管匯合匯入內(nèi)淋巴囊。在球囊的內(nèi)側(cè)外表有一個處于矢狀面呈鉤形的球囊斑〔maculasacculi〕〔圖2D、3B〕，球囊斑的感覺上皮面對前庭池的外側(cè)壁，球囊斑的底部則緊貼前庭池的內(nèi)側(cè)骨壁〔圖1D〕。在橢圓囊的上部有一個處于冠狀面呈扇形的橢圓囊斑〔maculautriculi〕〔圖2D、3C〕，橢圓囊斑感覺上皮面朝向后方〔圖1D、2A〕，其底面的神經(jīng)纖維和毛細(xì)血管經(jīng)上篩斑〔superiormaculacribrosa〕骨壁小孔通向顱內(nèi)。在球囊斑和橢圓囊斑的外表均覆蓋著膠狀的耳石膜〔otolithicmembrane〕，耳石膜的表層覆蓋著結(jié)晶體樣的耳石層〔otoconiallayer〕。毛細(xì)胞的動纖毛和靜纖毛插入到耳石膜內(nèi)，當(dāng)頭位發(fā)生直線加速運動時，耳石膜因慣性與囊斑產(chǎn)生相對位移造成毛細(xì)胞的纖毛彎曲，感覺上皮因而而產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)沖動，進而產(chǎn)生身體直線加速運動的感覺[1,2].大鼠的半規(guī)管位于前庭池后方。這三個互相垂直的呈2/3環(huán)的中空骨管分別是外半規(guī)管〔lateralsemicircularcanal〕、上半規(guī)管〔superiorsemicircularcanal〕和后半規(guī)管〔posteriorsemicircularcanal〕，三個半規(guī)管借5個開口與前庭池相通。外半規(guī)管向外側(cè)凸起，與水平面約成30角，其壺腹端開口和單腳分別開口于前庭池外壁的上部和下部；上半規(guī)管垂直向上向后凸起，與水平面垂直，壺腹端開口于前庭池上壁的后部，上半規(guī)管的另一端與后半規(guī)管聯(lián)合構(gòu)成總腳開口于前庭后壁中部的內(nèi)角；后半規(guī)管向后向外凸起，與水平面幾乎平行，其壺腹端開口于前庭池下壁的內(nèi)角，另一端與上半規(guī)管聯(lián)合構(gòu)成總腳。大鼠的三個骨性半規(guī)管及其周圍菲薄的骨壁共同圍成一個開口朝向顱內(nèi)的球形空洞〔圖1A〕，內(nèi)容小腦絨球葉。三個膜性半規(guī)管內(nèi)充滿內(nèi)淋巴液，并借結(jié)締組織小梁懸浮固定在充滿外淋巴液的骨半規(guī)管內(nèi)。在三個膜性半規(guī)管凸側(cè)緣的壺腹內(nèi)各有一個與半規(guī)管走向垂直的壺腹嵴。壺腹嵴的外表布滿感覺毛細(xì)胞，毛細(xì)胞的動纖毛〔kinocilium〕和靜纖毛〔ste?reocilium〕插入到壺腹嵴外表覆蓋的膠質(zhì)終帽〔cupu?la〕[1,2].當(dāng)動物體位發(fā)生旋轉(zhuǎn)運動時，與旋轉(zhuǎn)平面平行的半規(guī)管內(nèi)的壺腹嵴終帽就會與壺腹嵴產(chǎn)生最明顯的相對位移，使毛細(xì)胞的纖毛隨著終帽偏轉(zhuǎn)并因而產(chǎn)生角加速運動的感覺。固然大鼠的外半規(guī)管壺腹嵴與人類、猴、豚鼠等實驗動物同樣呈馬鞍形[3],但是大鼠的上半規(guī)管和后半規(guī)管壺腹嵴卻被從嵴13D-F〕，這種構(gòu)造到底具有什么特殊的生理學(xué)意義，當(dāng)前尚不清楚。大鼠前庭各個感受器的構(gòu)造基本一樣，分布在各個感受器外表的Ⅰ型或Ⅱ型感覺毛細(xì)胞的底層均為一層支持細(xì)胞〔圖1D〕。這些支持細(xì)胞構(gòu)成了一道明顯的分界限，所有的前庭神經(jīng)纖維在穿越支持細(xì)胞之前都脫去髓鞘才能進入到前庭感覺上皮區(qū)實現(xiàn)與毛細(xì)胞之間的突觸聯(lián)絡(luò)。來自前庭神經(jīng)元的具有大神經(jīng)纖維特征的傳入神經(jīng)末梢以高腳酒杯的形態(tài)特征將形似細(xì)頸花瓶的Ⅰ型毛細(xì)胞自底部一直包裹到頸部；具有小神經(jīng)纖維特征的前庭神經(jīng)末梢則僅在細(xì)胞底部與柱狀的Ⅱ型毛細(xì)胞構(gòu)成突觸聯(lián)絡(luò)[1,2].支配或接受前庭上半規(guī)管壺腹嵴、外半規(guī)管壺腹嵴、橢圓囊斑以及球囊斑鉤部的神經(jīng)纖維均經(jīng)上篩斑會聚到前庭上神經(jīng)束〔圖1D〕入顱，而支配或接受球囊斑主體部分和后半規(guī)管壺腹嵴的神經(jīng)纖維末梢則分別經(jīng)中篩斑和下篩斑會聚到前庭下神經(jīng)束〔圖2B〕。另外，球囊和橢圓囊還有一個最大的不同在于橢圓囊斑感覺上皮周圍具有豐富的暗細(xì)胞群，而球囊內(nèi)部卻沒有暗細(xì)胞〔圖1D〕。球囊因而而不能產(chǎn)生內(nèi)淋巴液，只能依靠從連合管接受由血管紋分泌的來自蝸管的內(nèi)淋巴液，其內(nèi)淋巴液的吸收則也只能通過內(nèi)淋巴管聚集到內(nèi)淋巴囊，這可能就是構(gòu)成內(nèi)淋巴液縱向流動循環(huán)的主要原因。與內(nèi)淋巴液縱向流動循環(huán)截然不同的是，橢圓囊囊壁上的上皮細(xì)胞中含有大量的暗細(xì)胞，因而橢圓囊及三個半規(guī)管內(nèi)的內(nèi)淋巴液分泌和吸收大都以輻射流循環(huán)的方式來完成，也就是講，在橢圓囊和三個半規(guī)管壺腹內(nèi)的內(nèi)淋巴液主要由周圍的暗細(xì)胞分泌也由這些暗細(xì)胞吸收，這可能就是為什么毀壞內(nèi)淋巴囊僅僅造成球囊和蝸管內(nèi)積水但是卻不能造成橢圓囊和半規(guī)管積水的重要原因[7].2大鼠內(nèi)耳的解剖步驟觀察大鼠內(nèi)耳的病理變化通常能夠采取顳骨切片和膜迷路取材及鋪片兩種方式。顳骨切片方式方法能夠顯示動物內(nèi)耳的立體構(gòu)造，充分展示內(nèi)耳深部構(gòu)造各個終器之間的相對位置關(guān)系；既能夠證明耳蝸和前庭毛細(xì)胞的病理學(xué)改變，可以以觀察位于螺旋管內(nèi)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和位于上篩斑和中篩斑骨壁內(nèi)側(cè)的前庭上神經(jīng)元和前庭下神經(jīng)元病變，而且還能夠評估血管紋、半規(guī)管、內(nèi)淋巴管及內(nèi)淋巴囊內(nèi)的病理學(xué)改變。膜迷路取材及鋪片方式方法除了能夠?qū)Ω鞲杏X終器提供全面完好地定量分析之外，還能為進一步應(yīng)用分子生物學(xué)研究手段提供純粹的內(nèi)耳實驗樣品，因而，膜迷路取材技術(shù)更有助于開展在基因水平和蛋白質(zhì)水平上的研究[8-12].自1966年Engstrom重新提倡使用耳蝸鋪片技術(shù)以來[13],很多研究者對耳蝸鋪片技術(shù)進行了不斷改良。我們于1979年在戴樹宏教師最早在中國舉辦的耳蝸鋪片學(xué)習(xí)班學(xué)會了Engstrom的經(jīng)典耳蝸軟鋪片技術(shù)，我們在這里基礎(chǔ)上首先提出了改進耳蝸硬鋪片技術(shù)[14],隨后又拓展了耳蝸螺旋韌帶鋪片[15]和前庭各終器鋪片[16]乃至全內(nèi)耳膜迷路鋪片等一系列耳蝸膜迷路取材技術(shù)[17].由于不同動物的內(nèi)耳解剖構(gòu)造存在著一定差異，因而大鼠內(nèi)耳的取材步驟與豚鼠內(nèi)耳膜迷路取材并不一樣[3].我們通過總結(jié)先前積累的實踐經(jīng)歷體驗，介紹兩種不同的大鼠內(nèi)耳膜迷路取材及鋪片技術(shù)如下。大鼠內(nèi)耳取材技術(shù)能夠分為不經(jīng)脫鈣的膜迷路取材方式方法和經(jīng)脫鈣的膜迷路取材方式方法。前者主要適用于內(nèi)耳膜迷路基因轉(zhuǎn)染實驗中對轉(zhuǎn)染基因標(biāo)記及轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)的觀察、各種熒光免疫組織化學(xué)觀察、以及為各種分子生物學(xué)研究提供不同的內(nèi)耳組織材料。后者固然在顯微操作上相對容易，但由于脫鈣經(jīng)過造成的酶蛋白失活和抗原抗體反響減弱或丟失以及染色標(biāo)記褪色等問題，脫鈣后取材的方式方法大多僅適用于常規(guī)病理學(xué)檢查。根據(jù)不同的實驗需求和染色標(biāo)記步驟，樣品染色或標(biāo)記有時可能需要布置在組織固定之前有時需要布置在組織固定之后，這主要取決于標(biāo)記信號能否需要進行活細(xì)胞標(biāo)記以及標(biāo)記物能否在脫鈣經(jīng)過中保存。例如琥珀酸脫氫酶不能耐受醛類化學(xué)固定劑，因此應(yīng)用四唑鹽法標(biāo)記琥珀酸脫氫酶就必須對耳蝸施行先灌流染色然后再固定，由于四唑鹽法產(chǎn)生的酶組織化學(xué)藍(lán)色甲臜〔formazan〕沉淀物能夠耐受脫鈣處理，因而合適應(yīng)用脫鈣后取材的方式方法并根據(jù)軟鋪片的方式方法來制備樣品；然而經(jīng)轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的綠色熒光蛋白以及各種探針熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)大多不能耐受脫鈣，它們或者會在脫鈣經(jīng)過中喪失抗原抗體反響性，或者會在脫鈣經(jīng)過中發(fā)生熒光信號的淬滅，因此對施行熒光免疫組織化學(xué)染色的樣品，我們主張采用不脫鈣的方式方法來制備樣品。2.1硬鋪片法將固定后的顳骨置于盛有蒸餾水的玻璃皿中。在解剖顯微鏡下，用鑷尖刺破蝸尖骨壁，將分離針探入頂回螺旋韌帶與蝸殼之間并沿著螺旋韌帶的背側(cè)分離蝸殼，鼓室側(cè)蝸殼較薄，在確保蝸殼與螺旋韌帶完全分離后能夠輕易摘除已分離的蝸殼；顳骨巖部側(cè)的蝸殼骨壁較厚，則需要先將螺旋韌帶與骨壁分離，然后再用剪刀剪除顳骨巖部側(cè)骨壁，直至暴露整個耳蝸膜迷路〔圖4A、B〕。用分離刀探入基底膜底面與骨性螺旋板之間的縫隙中，沿骨性螺旋板將基底膜從鼓階朝蝸管方向輕抬，使耳蝸基底膜與蝸軸分離，此經(jīng)過能夠從蝸尖開場逐步向蝸底進行或者從蝸底開場向蝸尖推進。由于基底膜的外表沒有骨組織阻擋，分離開的基底膜朝著蝸管方向彎曲不會造成基底膜折斷，同時由于操作器械是從基底膜的反面向上抬，因而也不會造成Corti器的機械損傷。取出耳蝸膜迷路之后，可用顯微剪將螺旋韌帶剪除〔圖5E〕，可以以將基底膜的頂回、中回和底回分別切斷，然后再用分離刀沿著基底膜的外側(cè)緣將螺旋韌帶切下，最后用游絲鑷摘除覆蓋在Corti器外表的蓋膜〔圖5F〕并完成耳蝸基底膜鋪片〔圖2C、3A〕。解剖前庭各個終器的方式方法是在摘除鐙骨底板后，沿著卵圓窗邊緣打開前庭池外壁充分暴露前庭池。在前庭池內(nèi)壁前下方可見鉤形的球囊斑，在前庭池的后上方可見扇形的橢圓囊斑，由于這兩個囊斑的外表均覆蓋著白色的耳石膜使之成為兩個囊斑的最奪目標(biāo)志，因而很容易分辨體認(rèn)。橢圓囊斑和上半規(guī)管及外半規(guī)管壺腹均位于面神經(jīng)管內(nèi)側(cè)深部。需要先打開面神經(jīng)管外側(cè)壁摘除面神經(jīng)，再打開面神經(jīng)管內(nèi)側(cè)骨壁才能充分暴露橢圓囊的囊斑和兩個膜壺腹〔圖4B〕。球囊斑與前庭池內(nèi)壁的附著較為嚴(yán)密，需要用分離針探入球囊內(nèi)側(cè)壁和骨壁之間進行分離，然后取下被分離的整個球囊。橢圓囊和上半規(guī)管、外半規(guī)管壺腹相對游離，與橢圓囊斑和外壺腹嵴及上壺腹嵴相聯(lián)絡(luò)的神經(jīng)纖維從上篩斑外表的小孔進入骨壁會聚成前庭上神經(jīng)束，因而只要將橢圓囊斑和兩個膜壺腹進入上篩斑的神經(jīng)纖維和血管在上篩斑處截斷就能夠?qū)E圓囊斑和外半規(guī)管及上半規(guī)管壺腹取下。后半規(guī)管壺腹的位置埋藏在蝸管底回hook后方的骨壁深部〔圖2A、B〕，需要撬開周圍骨壁方可暴露，然后將后壺腹通向下篩斑的神經(jīng)纖維截斷即可將后壺腹完好取出。獲得所有前庭終器后，還需打開球囊和橢圓囊的囊膜并切除囊斑周圍多余的膜性組織，再用游絲鑷去除兩個囊斑外表覆蓋的耳石膜，使兩個囊斑外表的感覺毛細(xì)胞充分暴露。撕開三個膜壺腹充分暴露壺腹嵴，最后將囊斑和壺腹嵴的正面朝上鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片〔圖2D、3B-F〕。2.2軟鋪片法經(jīng)過脫鈣處理，骨組織中原先含有的鈣鹽基質(zhì)被除去，由于原先堅硬的骨組織變成了軟組織，因而脫鈣后施行膜迷路取材的難度要比不脫鈣取材容易。將顳骨置于盛有蒸餾水的玻璃皿中，以類似不脫鈣分離的解剖手法，先分離蝸殼與螺旋韌帶，由于骨組織經(jīng)脫鈣后已經(jīng)變軟，分離時需要將分離針沿著蝸殼和螺旋韌帶之間的間隙進行分離，同時要注意防止撕扯骨壁，以免牽拉造成耳蝸變形而撕裂基底膜。暴露整個膜迷路后，用游絲鑷從聽神經(jīng)孔取下蝸軸。再用游絲鑷和分離刀將整條耳蝸基底膜按底回、中回和頂回截成三個片段〔圖5A-C〕。用游絲鑷夾持蝸軸，再用分離刀沿著基底膜的內(nèi)側(cè)緣切除蝸軸〔圖5D〕。然后用分離刀沿著基底膜與螺旋韌帶交界處插入，用游絲鑷沿著分離刀的刀刃將螺旋韌帶與基底膜分開〔圖5E〕。最后用游絲鑷摘除蓋膜〔圖5F〕并完成耳蝸基底膜鋪片〔圖2C〕。由于很多藥物造成的耳蝸毛細(xì)胞損害都表現(xiàn)出一個從耳蝸底回開場逐步向耳蝸頂回擴展的病變形式[18-23],因而選自耳蝸基底膜上某一部位的照片并不能有效表示出整個耳蝸的病理學(xué)改變特征。我們主張在放大400倍的光學(xué)顯微鏡下，以目鏡中長度單位為0.24毫米的顯微測微尺從耳蝸頂回向底回依次測量基底膜的長度并對逐個測微尺視野內(nèi)的內(nèi)外毛細(xì)胞進行計數(shù)，同時將計數(shù)結(jié)果輸入到計算機與大鼠耳蝸圖軟件中的正常值進行比擬，進而建立全耳蝸毛細(xì)胞損失百分比的曲線分析圖。我們以為只要施行全耳蝸毛細(xì)胞計數(shù)并