抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用免疫學導論

關(guān)于抗原抗體反應(yīng)的應(yīng)用免疫學導論第一頁，共五十九頁，2022年，8月28日免疫沉淀和免疫凝集

免疫沉淀和免疫凝集利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對抗原或抗體進行量或質(zhì)的測定分析是最經(jīng)典的血清學方法。第二頁，共五十九頁，2022年，8月28日溶液中的沉淀反應(yīng)在體外，當抗體與相應(yīng)抗原二者濃度比例適當時，會發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)，可用于抗原或抗體的定性及定量分析。在液相中形成的沉淀不易觀察判斷，利用抗原和抗體溶液之間的界面形成的沉淀線便于判斷，即環(huán)狀沉淀試驗。第三頁，共五十九頁，2022年，8月28日第四頁，共五十九頁，2022年，8月28日環(huán)狀沉淀試驗原理將抗原溶液疊加在細小玻璃管中抗體溶液上面，抗原與抗體在兩液交界面處特異性結(jié)合，形成白色沉淀環(huán)

?！驹u價】：簡便快速只能定性敏感性低第五頁，共五十九頁，2022年，8月28日凝膠中沉淀反應(yīng)抗原分子和抗體分子在凝膠介質(zhì)中自由擴散形成梯度濃度，抗原與抗體在比例合適的一定擴散部位相遇形成沉淀線?？捎糜跍y定抗原與抗體的相對濃度，也可用于比較不同抗原的特異性、純度及相互關(guān)系。主要有兩種方法：單向免疫擴散、雙向免疫擴散第六頁，共五十九頁，2022年，8月28日單向免疫擴散基本原理

待測抗原從局部含有相應(yīng)定量抗體的凝膠內(nèi)自由向周圍擴散，抗原抗體特異性結(jié)合，在二者比例合適的部位，形成白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原的濃度成正相關(guān)。

第七頁，共五十九頁，2022年，8月28日方法：將適當濃度的抗體混于瓊脂（0.8%~1%）中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔開始向周圍擴散，并在小孔周圍合適的位置形成沉淀。沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關(guān)。單向免疫擴散第八頁，共五十九頁，2022年，8月28日?影響因素1.抗原分子量：與擴散速度、沉淀環(huán)反相關(guān)

2.抗體種類：兔抗血清優(yōu)于馬、羊

3.抗體稀釋度：抗體濃度大沉淀環(huán)小

4.擴散時間：抗原含量高，擴散時間長

5.擴散溫度：4～37℃內(nèi)溫度與擴散速度正相關(guān)

6.瓊脂板厚度：與沉淀環(huán)反相關(guān)第九頁，共五十九頁，2022年，8月28日雙向免疫擴散【原理】：將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成沉淀線。第十頁，共五十九頁，2022年，8月28日染色標本圖1.抗原抗體雙向自由擴散2.24小時出結(jié)果3.呈現(xiàn)沉淀線或弧模擬圖第十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日結(jié)果分析：抗原或抗體是否存在；抗原或抗體的純度：若在兩孔內(nèi)有兩對或兩對以上的抗原抗體系統(tǒng)，就能產(chǎn)生相應(yīng)數(shù)量的分離的沉淀線?？乖蚩贵w相對濃度：抗原濃度越高，形成的沉淀線距離抗原孔越遠，抗體濃度越高，形成的沉淀線距抗體孔越遠；抗原或抗體相對分子量：抗原或抗體在瓊脂內(nèi)的擴散受分子量影響，分子量大者擴散速度慢，擴散圈小，局部濃度高，因此形成的沉淀圈彎向分子量大的一方，若二者分子量相等，則沉淀線呈直線；第十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日抗原性質(zhì)：觀察兩個鄰近孔的抗原與抗體所形成的兩條線是交叉抑或相連，可用來判斷該兩抗原是否有共同成分。同樣的純抗原a放在兩個鄰近的孔中，對應(yīng)抗體放在中央孔中，兩條沉淀線在其相鄰的末端會互相連接和融合；若兩個不同的抗原a和b，則兩線互相交叉；若兩個抗原有部分相同成分a和ab，則兩線除有相連部分以外還有一伸出部分。滴定抗體效價：固定抗原濃度，稀釋抗體，出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋度為該抗體的效價。第十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日抗原、抗體相對分子量Ag分子量大于AbAb分子量大于AgAg分子量等于Ab第十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日抗原決定簇部分相同抗原決定簇完全相同抗原性質(zhì)分析兩個抗原的抗原決定簇完全不同第十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日雙向瓊脂擴散試驗的應(yīng)用1.檢測未知抗原或抗體2.抗原性質(zhì)分析3.抗體效價滴定4.抗原或抗體純度鑒定第十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日電泳條件下的沉淀反應(yīng)免疫電泳是利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移率不同能被分離的特性與免疫擴散結(jié)合進行分析的方法。原理：混合的蛋白質(zhì)抗原在ＰＨ８．６時帶負電荷，在電場的作用下，由負極向正極遷移，使混合的抗原組分得以分離?？贵w可以通過自由擴散，也可以通過電泳與分離的抗原形成相應(yīng)的特異性沉淀線，從而提高免疫沉淀的靈敏度。常用的免疫方法有：血清免疫電泳、火箭電泳和對流免疫電泳第十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日血清免疫電泳將患者血清和正常人血清分別放在凝膠上近負極端的小孔中進行電泳分離后，在兩中抗原之間沿電泳方向挖一條平行的小槽，加入抗血清進行雙擴散。第十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日-+免疫電泳示意圖第十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日根據(jù)沉淀線的位置及粗細，可分析樣品中的抗原含量；根據(jù)蛋白質(zhì)的電泳遷移率，免疫特性及其它特性，可以確定該復合物中含有某種蛋白質(zhì)。第二十頁，共五十九頁，2022年，8月28日火箭電泳

將單向免疫擴散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測技術(shù)。

原理：電泳時，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動，而在電場的作用下促使樣品中的抗原向正極泳動。當抗原與抗體分子達到適當比例時，形成一個形狀如火箭的不溶性免疫復合物沉淀峰，峰的高度與樣本中的抗原濃度呈正相關(guān)。第二十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日第二十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日注意要點：選擇無電滲或電滲很小的瓊脂糖，否則火箭形狀不規(guī)則；若火箭頂部形狀呈不清晰的云霧狀，提示電泳時間不夠，未到達終點；作IgG定量時，由于瓊脂中的抗IgG抗體也是IgG，免疫反應(yīng)中的抗原抗體性質(zhì)相同，由于電滲作用影響了待測IgG的泳動，火箭峰呈紡錘狀。為了抵消電滲作用，可用甲醛使樣本IgG上的氨基甲酰化，使本來帶兩性電荷的IgG只帶負電荷，加快泳動速度，出現(xiàn)伸向陽極的火箭峰。火箭電泳的檢測靈敏度在μg/ml水平?？刹捎酶偁幏ǚ派渥燥@影技術(shù)來進行火箭免疫電泳，靈敏度可達ng/ml。第二十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日對流免疫電泳在pH8.6的瓊脂凝膠中，大部分蛋白質(zhì)抗原在堿性溶液中帶負電荷，且分子較小，電泳時，泳向正極。

抗體帶弱負電荷，但分子量大，電泳力小于電滲力，泳向負極。

抗原和抗體相遇，比例合適時形成肉眼可見的沉淀線。第二十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日AgAb-+1.Ag陽性2.Ag弱陽性3.Ag強陽性4.Ag強陽性對流免疫電泳示意圖第二十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日免疫共沉淀在溶液中兩種或兩種以上蛋白質(zhì)相互作用，可以通過免疫共沉淀驚醒鑒定和分離。蛋白質(zhì)相互作用通過非共價結(jié)合，用針對其中一種蛋白質(zhì)的特異性抗體進行的免疫沉淀，與該蛋白相互作用的其他蛋白也同時被沉淀下來。如果第一抗體結(jié)合后再加入第二抗體或A蛋白可使抗原抗體形成更大的復合物易于沉淀，也可通過加入聚乙二醇破壞水化膜加速沉淀形成。第二十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日免疫共沉淀原理圖解第二十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日關(guān)鍵因素1.抗原的豐富度2.抗體的結(jié)合能力3.蛋白質(zhì)和抗體的可接觸性第二十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日免疫凝集

大顆粒性抗原如細胞或細菌等與相應(yīng)的抗體結(jié)合后能使康媛顆粒發(fā)生凝集，形成肉眼易見的凝集小塊，即為免疫凝集。凝集反應(yīng)的發(fā)生分為兩個階段：1、抗原抗體的特異性結(jié)合階段；2、出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。第二十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日最常見的免疫凝集反應(yīng)是紅細胞凝集，即血凝反應(yīng)。血凝反應(yīng)的抗體識別的抗原可以是紅細胞表面的天然抗原，如血凝鑒定試驗；也可以通過交聯(lián)將紅細胞連接上其他抗原，如早期的HBsAg血凝試驗。第三十頁，共五十九頁，2022年，8月28日細菌的血凝試驗常用來對細菌進行鑒定與分型，如沙門菌鞭毛抗原的分析等。免疫凝集試驗雖然簡便，但是受反應(yīng)靈敏度的限制，在實際應(yīng)用越來越少。第三十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日女科學家R.Yalow（美,1921~）1950’末發(fā)明（胰島素），1977年獲諾貝爾醫(yī)學獎1.基本原理（1）競爭結(jié)合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2.常用標記核素：（1）125I：γ射線，半衰期60天（2）3H：β射線，半衰期12.3年3.測量儀器（1）γ計數(shù)儀（2）β液閃儀免疫標記一、放射免疫分析（RIA）第三十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日一、放射免疫分析（RIA）基本原理采用定量的標記抗原（Ag＋）和非標記抗原（Ag）競爭性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)。采用定量的標記抗原（Ag＋）和非標記抗原（Ag）競爭性結(jié)合有限量特異性抗體（Ab）的反應(yīng)第三十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日4.基本試劑（1）標準品與質(zhì)控品a.

意義：放射免疫定量分析的尺度、質(zhì)量控制的依據(jù)b.

要求：化學結(jié)構(gòu)上——與待測物有相同的化學結(jié)構(gòu)化學純度上——對競爭反應(yīng)有干擾的雜質(zhì)的含量低含量準確注意不變質(zhì)與降解：在運輸、保存時尤應(yīng)注意；注意有效期c.

種類：國際標準、國家標準、企業(yè)標準第三十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日（2）標記物a.對標記物的要求比活度高：即單位物質(zhì)的放射性強度高生物活性及免疫活性與標記前改變小

放射化學純度高：應(yīng)>95%穩(wěn)定性好：標記的同位素不易脫落第三十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日b.

標記方法：氯胺-T法：最常用的125I標記法，I與酪氨酸共價結(jié)合，方法簡便，但易造成蛋白質(zhì)的損傷乳過氧化酶法：

Iodogen（氯甘脲）法：固相法，標記率較高，損傷小，反應(yīng)時間長置換法：3H最常用c.標記產(chǎn)物的純化：常用Sephadex層析，也可用硅膠G薄板層析或HPLC分離d.標記產(chǎn)物的鑒定：常用RIA法最大結(jié)合百分率標準曲線比較法e.半抗原的標記：必須先連接載體，常用牛血清白蛋白（BSA），再對載體作標記第三十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日（3）特異性結(jié)合抗體a.

對特異性結(jié)合抗體的要求：親和力（affinity）高：指單個抗體分子與抗原決定簇特異結(jié)合的能力，用K值表示，反映靈敏度特異性高：與待測抗原的結(jié)合力高，而與待測抗原類似物的結(jié)合能力（交叉反應(yīng)）低滴度（效價）高：指結(jié)合50%標記抗原時抗體的稀釋度高穩(wěn)定性好：能長期保存，化學性質(zhì)、效價穩(wěn)定b.

抗體的制備選擇合適的免疫動物：兔、鼠、羊

應(yīng)用佐劑：福氏完全佐劑與不完全佐劑（羊毛脂、石蠟油+卡介苗）選擇合適的免疫方法：劑量、接種途徑（腹股溝、腋窩、脊柱兩側(cè)皮內(nèi)多點）、間隔時間（加強）與次數(shù)第三十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日

c.抗體的純化去除雜抗體：用抗原吸附法提取特異性IgG：先用鹽析法粗提，再用離子交換層析或親和層析純化d.抗體的鑒定鑒定內(nèi)容：效價、親和力、特異性鑒定方法：效價（瓊脂單擴）、特異性（瓊脂雙擴）、RIAe.單克隆抗體的使用：用于IRMA或RIA，特異性高不一定優(yōu)于傳統(tǒng)的多克隆抗體第三十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日非放射性免疫標記方法由于比放射性標記更為簡便，同時又保持了靈敏快速的特點而得到了發(fā)展，其中酶標記免疫試驗是廣泛使用的方法。用于標記酶的種類也越來越多，常用的有堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和脲酶。酶聯(lián)免疫吸附試驗第三十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日酶免疫試驗法有兩類：1.均相法：抗原與抗體反應(yīng)后，不必將游離的與結(jié)合的抗原抗體分離，就可測定被測分子的含量。固相法：將抗原抗體吸附在固相表面，抗原抗體反應(yīng)后，將固相與液相分離出去游離的抗原抗體，而結(jié)合的抗原或抗體上被標記的酶仍保持活性，催化底物形成有色產(chǎn)物，即酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA).第四十頁，共五十九頁，2022年，8月28日ELISA有直接發(fā)、間接法及夾心法等不同反應(yīng)方式直接法第四十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日間接法第四十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日夾心法第四十三頁，共五十九頁，2022年，8月28日特點：非競爭結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇

第四十四頁，共五十九頁，2022年，8月28日熒光與發(fā)光免疫分析用于標記抗體的熒光化合物有異硫氰熒光素（FITC）和羅丹明熒光素等。目前較好的是時間分辨熒光免疫分析法（TrFIA），提高了免疫分析技術(shù)的靈敏度和特異性。第四十五頁，共五十九頁，2022年，8月28日直接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。第四十六頁，共五十九頁，2022年，8月28日間接法優(yōu)點：靈敏度高，在不同抗原的檢測中只需應(yīng)用一種熒光抗體。既可檢測抗原，也可檢測抗體。第四十七頁，共五十九頁，2022年，8月28日親和標記免疫分析金黃色葡萄球菌的A蛋白與IgGFc段有高度的親和力。用酶、同位素、熒光素等標記A蛋白，替代第二抗體直接與抗體結(jié)合，可用于抗原抗體反應(yīng)的分析。第四十八頁，共五十九頁，2022年，8月28日免疫定位分析免疫熒光定位分析：常用的熒光素異硫氰熒光素和異硫氰四甲基羅丹明等具有特殊的激發(fā)波長和發(fā)射波長。用熒光抗體鑒別淋巴細胞亞群，尤其是CD4+T細胞核CD8+T細胞亞群，在臨床上有重要意義。第四十九頁，共五十九頁，2022年，8月28日抗原抗體反應(yīng)的其他應(yīng)用免疫親和色譜

原理：利用抗原與抗體的高親和力、高專一性和可結(jié)合的特點以及色譜技術(shù)的差速遷移理論而建立的一種新型色譜技術(shù)。就是將被測物的特異性抗體固定在適當?shù)墓滔噍d體上，制備成免疫親和色譜的固定相（免疫親和色譜柱），根據(jù)被測物的反應(yīng)原性、抗原抗體結(jié)合的特異性記憶，抗原抗體復合物在一定條件下能夠可逆解離的特性進行色譜分離。第五十頁，共五十九頁，2022年，8月28日一種高效、簡便的樣品前處理技術(shù)，大大簡化了提取、凈化、衍生化等復雜的前處理過程，在食品分析中屬于痕量檢測，檢測線非常低（達10-12數(shù)量級）。生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合，生物分子間的這種特異性相互作用稱為親和作用。生物分子間的親和識別包括抗體-抗原、酶-底物、激素-受體等親和作用。第五十一頁，共五十九頁，2022年，8月28日影響親和作用的因素1、離子強度：一般來說，提高離子強度，親和作用減弱或完成破壞。2、PH：在適當?shù)腜H下，親和結(jié)合作用較高，在其它PH下，親和作用減弱或完成破壞。3、抑制氫鍵形成的物質(zhì)：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用4、溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；但是，疏水性相互作用增強5、液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱6、螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失第五十二頁，共五十九頁，2022年，8月28日免疫親和色譜的特點選擇性，專屬性強因為IAC是