熒光PCR同步檢測(cè)細(xì)小脲原體和沙眼衣原體及解脲支原體基因分群分型研究-武漢百泰基因課件

王業(yè)富教授/博導(dǎo)國(guó)家重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目：2008ZX10004-006

FQ-PCR同步檢測(cè)細(xì)小脲原體和沙眼衣原體及解脲支原體基因分群分型研究主要內(nèi)容(2)研究目的(3)研究?jī)?nèi)容(4)研究總結(jié)與創(chuàng)新點(diǎn)(5)研究成果(1)研究背景研究背景解脲支原體和沙眼衣原體是常見(jiàn)的性傳播疾病病原體，在臨床非淋菌性尿道炎（NGU）病人中，二者常常呈共同感染狀態(tài)。近年來(lái)，解脲支原體的致病機(jī)理和流行病學(xué)研究得到了充分的重視。最近的研究表明，解脲支原體應(yīng)該分為兩個(gè)獨(dú)立的種，即細(xì)小脲原體（原解脲支原體生物一群）和解脲脲原體（原解脲支原體生物二群），從生殖道分離到的解脲支原體以細(xì)小脲原體為主。PCR法：近年來(lái)PCR法在解脲支原體和沙眼衣原體的臨床樣品檢測(cè)中被廣泛使用，但是PCR法需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行后處理，不僅費(fèi)時(shí)而且交叉污染容易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，并且會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員造成潛在的危害。傳統(tǒng)的解脲支原體檢測(cè)主要是選擇培養(yǎng)法，常規(guī)的沙眼衣原體檢測(cè)方法是免疫學(xué)方法。這些方法勞動(dòng)量大，耗時(shí)，而且靈敏度低或特異性差。M1M2M4M3以上檢測(cè)方法均不能對(duì)起始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量??！實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)強(qiáng)度，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，通過(guò)分析每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值），結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光域值（threshold）的設(shè)定：熒光域值是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介Ct值的重現(xiàn)性：PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期，此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。右圖為：相同模板在同一臺(tái)PCR儀上進(jìn)行96次擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖，終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；Ct值則極具重現(xiàn)性。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介

TaqMan探針：該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

TaqMan探針熒光探針和熒光染料TaqMan－MGB探針技術(shù)是在TaqMan探針基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù),TaqMan探針的3′端結(jié)合上MGB，即DNA小溝結(jié)合物。其能嵌入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的小溝形成非共價(jià)結(jié)合,有效提高探針的退火溫度。TaqMan－MGB探針較TaqMan探針具有更高的敏感性和特異性，是分析單核苷酸突變的有效工具。

TaqMan－MGB探針熒光探針和熒光染料利用實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR技術(shù)和雙重PCR技術(shù)，研發(fā)出雙重實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系，可以用于臨床上快速、高特異性、高靈敏度、精確定量、同步檢測(cè)細(xì)小脲原體和沙眼衣原體；本項(xiàng)研究設(shè)計(jì)了兩套實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系，利用兩套特異性引物和TaqMan-MGB探針，可以分別對(duì)細(xì)小脲原體和解脲脲原體進(jìn)行快速鑒別分群和定量檢測(cè)，可以迅速鑒定臨床樣品中是生物一群或/和生物群二，以及各群的精確數(shù)量；本項(xiàng)研究設(shè)計(jì)了兩套雙重實(shí)時(shí)TaqMan熒光PCR反應(yīng)體系，利用一對(duì)通用引物和四條特異性TaqMan-MGB探針，通過(guò)兩個(gè)雙重?zé)晒釶CR可以快速對(duì)細(xì)小脲原體四個(gè)血清型進(jìn)行檢測(cè)和分型。本研究目的研究目的研究?jī)?nèi)容第一部分雙重實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR同步檢測(cè)細(xì)小脲原體和沙眼衣原體TaqMan探針和引物序列設(shè)計(jì)目標(biāo)檢測(cè)基因：解脲支原體－ure基因

沙眼衣原體－trp基因在NCBI獲得解脲支原體14個(gè)血清型的脲酶基因序列，沙眼衣原體14個(gè)血清型的trp基因序列。在

在線分別對(duì)解脲支原體14個(gè)血清型的脲酶基因序列和沙眼衣原體14個(gè)血清型的trp基因序列進(jìn)行序列比對(duì)。用TaqMan熒光PCR的專業(yè)設(shè)計(jì)軟件PrimerExpress2.0software(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)設(shè)計(jì)解脲支原體和沙眼衣原體的候選引物、探針序列。

研究?jī)?nèi)容名稱序列正向引物5‘-TTCAGTTGGGCCAGATCATG-3’反向引物5‘-CTCTTCATCGGTGGCTAATGTATAAA-3’TaqMan熒光探針5‘-(FAM)-AGGCTCGTCCTGACTCATGCATTTCG-(TAMRA)-3’

經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最后確定的沙眼衣原體引物、探針序列為：

FAM的吸收光波長(zhǎng)為494nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為525nm。TaqMan探針和引物序列設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容名稱序列正向引物5‘-CATTGATGTTGCACAAGGAGAAA-3’反向引物5‘-TTAGCACCAACATAAGGAGCTAAATC-3’TaqMan-MGB熒光探針5‘-(HEX)-TTGACCACCCTTACGAG-(MGB)-3’

經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最后確定的細(xì)小脲原體引物、探針序列為：HEX的吸收光波長(zhǎng)為535nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為556nm。TaqMan探針和引物序列設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容細(xì)小脲原體引物探針在線分析研究?jī)?nèi)容名稱PCR擴(kuò)增的序列沙眼衣原體ttcagttgggccagatcatgccgaaatgcatgagtcaggacgagccttttatacattagccaccgatgaagag73細(xì)小脲原體cattgatgttgcacaaggagaaaaaattcctcgtaagggtggtcaaggratgattaaatcagayttatttattattaataaagttgatttagctccttatgttggtgctaa111r：g或者a；y：t或者c。研究?jī)?nèi)容沙眼衣原體在線比對(duì)分析研究?jī)?nèi)容細(xì)小脲原體常規(guī)PCR反應(yīng)體系（50μl）沙眼衣原體常規(guī)PCR反應(yīng)體系（50μl）試劑名稱加入量（μl）終濃度加入量（μl）終濃度10×PCRbuffer51×PCRbuffer51×PCRbufferMgCl2（25mM）42mM42mMdNTPs(10mM)10.2mM10.2mMTaq酶(5U/μl)0.31.5U0.31.5U上游引物(10μM)2.50.50μM1.750.35μM下游引物(10μM)2.50.50μM1.750.35μMddH2O33.735.2模板11常規(guī)PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究?jī)?nèi)容

ABCDEFGA：DNAsizemarker500,400,350,300,250,200,150,100,50bpB：雙重PCR產(chǎn)物C：雙重PCR陰性對(duì)照；D：沙眼衣原體PCR產(chǎn)物E：沙眼衣原體陰性對(duì)照F：細(xì)小脲原體PCR產(chǎn)物G：細(xì)小脲原體陰性對(duì)照細(xì)小脲原體和沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)株單個(gè)和雙重PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖研究?jī)?nèi)容

常規(guī)PCR產(chǎn)物經(jīng)回收，純化，AT連接至pUCm-T載體中，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。培養(yǎng)后用藍(lán)白斑法篩選含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆，然后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)和質(zhì)粒提取，提取的質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和BamHI雙酶切鑒定后再進(jìn)行雙向序列測(cè)定。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備和鑒定研究?jī)?nèi)容

ABCA：含細(xì)小脲原體目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物219（108＋111）bpB：含沙眼衣原體目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物181（108＋73）bpC：DNAsizemarker500,400,350,300,250,200,150,100,50bp

含細(xì)小脲原體和沙眼衣原體目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒雙酶切凝膠電泳圖研究?jī)?nèi)容右圖：TheiCycleriQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)可重復(fù)性研究結(jié)果。熒光PCR反應(yīng)Ct值可重復(fù)性研究研究?jī)?nèi)容熒光PCR反應(yīng)特異性研究當(dāng)同時(shí)以細(xì)小脲原體和沙眼衣原體陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)株作為模板進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)，iCycleriQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)可以同時(shí)產(chǎn)生2種熒光擴(kuò)增曲線（FAM和HEX）；當(dāng)只以細(xì)小脲原體或沙眼衣原體陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)株作為模板進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)，iCycleriQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)只產(chǎn)生相應(yīng)的熒光擴(kuò)增曲線（FAM或HEX）；當(dāng)以4個(gè)陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株和無(wú)菌水作為模板進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)，iCycleriQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)在40個(gè)PCR循環(huán)后仍不能產(chǎn)生熒光擴(kuò)增曲線，表明該雙重實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)具有很好的特異性。研究?jī)?nèi)容

由于細(xì)小脲原體和沙眼衣原體雙重?zé)晒釶CR體系中，引物與探針之間難以避免的相互干擾作用，細(xì)小脲原體和沙眼衣原體雙重?zé)晒釶CR的有效檢測(cè)范圍降低了1－2個(gè)數(shù)量級(jí)，只有101－106拷貝/微升左右。右圖為：雙重?zé)晒釶CR體系中細(xì)小脲原體的熒光曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，有效檢測(cè)范圍為101－106

拷貝/微升。靈敏度為10拷貝/微升。定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度分析研究?jī)?nèi)容

右圖為：雙重?zé)晒釶CR體系中沙眼衣原體的熒光曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，有效檢測(cè)范圍為102－106拷貝/微升。靈敏度為102拷貝/微升。定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度分析研究?jī)?nèi)容雙重?zé)晒釶CR臨床標(biāo)本檢測(cè)應(yīng)用研究?jī)?nèi)容實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR定量檢測(cè)與鑒別細(xì)小脲原體和解脲脲原體第二部分研究?jī)?nèi)容TaqMan-MGB探針和引物序列設(shè)計(jì)名稱序列正向引物5-cattgatgttgcacaaggagaaa-3反向引物5-ttagcaccaacataaggagctaaatc-3TaqMan-MGB熒光探針5-(FAM)-ttgaccacccttacgag-(MGB)-3選擇脲酶基因作為目標(biāo)基因，經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最后確定的細(xì)小脲原體和解脲脲原體引物、TaqMan-MGB探針序列如下：細(xì)小脲原體：研究?jī)?nèi)容名稱序列正向引物正向引物：5-atCgaCgttgcCcaaggGga-3反向引物5-ttagcaccaacataaggagctaaatc-3TaqMan-MGB熒光探針5-(FAM)-ttgTccGccTttacgag-(MGB)-3解脲脲原體：解脲脲原體引物和探針中大寫(xiě)字母表示細(xì)小脲原體和解脲脲原體之間不同的堿基。TaqMan-MGB探針和引物序列設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容（1）（2）（3）細(xì)小脲原體及解脲脲原體基因序列比對(duì)分析研究?jī)?nèi)容陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株模板進(jìn)行常規(guī)PCR，使用與實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系中相同的引物對(duì)，以便將常規(guī)PCR檢測(cè)和實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)直接進(jìn)行比較。常規(guī)PCR及PCR產(chǎn)物克隆研究?jī)?nèi)容細(xì)小脲原體常規(guī)PCR反應(yīng)體系(50μl)解脲脲原體常規(guī)PCR反應(yīng)體系(50μl)試劑名稱加入量（μl）終濃度加入量（μl）終濃度10×PCRbuffer51×PCRbuffer51×PCRbufferMgCl2（25mM）52.5mM52.5mMdNTPs(10mM)10.2mM10.2mMTaq酶(5U/μl)0.31.5U0.31.5U上游引物(10μM)1.750.35μM1.50.30μM下游引物(10μM)1.750.35μM1.50.30μMddH2O32.733.2模板2.52.5PCR反應(yīng)條件1cycle：94℃，3min;40cycles：94℃，15s,58℃，30s；72℃，5min。常規(guī)PCR及PCR產(chǎn)物克隆研究?jī)?nèi)容陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)CR產(chǎn)物用于構(gòu)建克隆。含陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)小脲原體血清型6和解脲脲原體血清型2目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI分別進(jìn)行雙酶切的產(chǎn)物凝膠電泳圖。A：DNAsizemarker622，527，404，309，242，201，190，160，147，123bpB：含細(xì)小脲原體目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

219（108＋111）bpC：含和解脲脲原體目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

218（108＋110）bp

ABC常規(guī)PCR及PCR產(chǎn)物克隆研究?jī)?nèi)容A7瓊脂法：解脲支原體(包括細(xì)小脲原體和和解脲脲原體)會(huì)形成15μm—100μm的棕黑色海膽狀菌落。培養(yǎng)法不能區(qū)別鑒別細(xì)小脲原體和和解脲脲原體。臨床標(biāo)本的培養(yǎng)法檢測(cè)研究?jī)?nèi)容熒光PCR體系的優(yōu)化細(xì)小脲原體熒光定量PCR反應(yīng)體系(50μl)解脲脲原體熒光定量PCR反應(yīng)體系(50μl)試劑名稱加入量（μl）終濃度加入量（μl）終濃度10×PCRbuffer51×PCRbuffer51×PCRbufferMgCl2（25mM）73.5mM52.5mMdNTPs(10mM)10.2mM10.2mMHotstar酶(5U/μl)0.10.5U0.10.5U上游引物(10μM)1.750.35μM1.50.30μM下游引物(10μM)1.750.35μM1.50.30μMTaqMan－MGB探針(10μM)10.20μM10.20μMddH2O31.432.4模板12.5PCR反應(yīng)條件1cycle：94℃，10min

；40cycles：94℃，15s,58℃，30s。熒光PCR反應(yīng)使用的儀器為：Rotor-Gene實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為：檢測(cè)樣品的Ct值≤32時(shí)，為陽(yáng)性結(jié)果；檢測(cè)樣品的Ct值＞32時(shí)，為陰性結(jié)果。研究?jī)?nèi)容Rotor-Gene實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)可重復(fù)性研究結(jié)果。以含細(xì)小脲原體目標(biāo)片段重組質(zhì)粒的104拷貝/微升標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，以完全相同的反應(yīng)體系，同時(shí)進(jìn)行5個(gè)并列的實(shí)驗(yàn)，得到的熒光擴(kuò)增曲線圖熒光PCR反應(yīng)Ct值可重復(fù)性研究研究?jī)?nèi)容

實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR的特異性我們使用2個(gè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)小脲原體血清型6和解脲脲原體血清型2，12個(gè)臨床分離株，3個(gè)陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株和陰性對(duì)照（無(wú)菌水）來(lái)驗(yàn)證這2個(gè)實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)體系的特異性。在細(xì)小脲原體實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系中，只有細(xì)小脲原體血清型6和9個(gè)細(xì)小脲原體臨床分離株可以產(chǎn)生擴(kuò)增熒光曲線。在解脲脲原體實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系中，只有解脲脲原體血清型2和3個(gè)解脲脲原體臨床分離株可以產(chǎn)生擴(kuò)增熒光曲線。3個(gè)陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株和陰性對(duì)照（無(wú)菌水）在40個(gè)循環(huán)時(shí)仍沒(méi)有擴(kuò)增熒光曲線出現(xiàn)，表明這2個(gè)實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)體系具有很好的特異性。研究?jī)?nèi)容用含細(xì)小脲原體目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒108－101拷貝/微升十倍系列梯度稀釋做模板，構(gòu)建細(xì)小脲原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性相關(guān)系數(shù)為0.9895檢測(cè)極限（靈敏度）為101個(gè)拷貝/反應(yīng)體系。

定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度分析研究?jī)?nèi)容用含解脲脲原體目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒107－101拷貝/微升10倍系列梯度稀釋做模板，構(gòu)建解脲脲原體實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性相關(guān)系數(shù)為0.9956檢測(cè)極限（靈敏度）為10個(gè)拷貝/反應(yīng)體系。定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度分析研究?jī)?nèi)容熒光PCR和培養(yǎng)法、常規(guī)PCR檢測(cè)臨床樣品結(jié)果的比較研究?jī)?nèi)容第三部分雙重實(shí)時(shí)TaqMan熒光PCR同步檢測(cè)和基因分型細(xì)小脲原體研究?jī)?nèi)容目標(biāo)基因序列的確定：通過(guò)分析解脲支原體的多條帶抗原（mba）基因序列，我們發(fā)現(xiàn)mba基因作為解脲支原體的重要抗原基因，其堿基序列既具有保守性，同時(shí)在不同血清型之間具有一定的變異，使用TaqMan-MGB探針技術(shù)，這些變異足夠用來(lái)區(qū)分細(xì)小脲原體各血清型。TaqMan-MGB探針和引物序列設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，從多對(duì)候選引物探針組合中，最后確定的細(xì)小脲原體通用引物和型特異性TaqMan－MGB探針序列如下：細(xì)小脲原體四種血清型通用引物：名稱序列上游引物5-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3下游引物5-TCCAGCTCCAACTAAGGTAAC-3

細(xì)小脲原體血清型1，3，14的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為216bp，細(xì)小脲原體血清型6的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為217bp。TaqMan-MGB探針和引物序列設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容細(xì)小脲原體型特異性TaqMan－MGB探針序列如下：名稱序列細(xì)小脲原體血清型15-(FAM)-TGTAAGATTGCTAAATC-(MGB)-3細(xì)小脲原體血清型35-(HEX)-TGTAAGATTACCAAATC-(MGB)-3細(xì)小脲原體血清型65-(FAM)-AGTGTTCATATTTTTTACTAG-(MGB)-3細(xì)小脲原體血清型145-(HEX)-TCTTAGCTATGACATTAG-(MGB)-3TaqMan-MGB探針和引物序列設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容用A7瓊脂法從臨床標(biāo)本中分離得到解脲支原體單菌落（棕黑色海膽狀菌落）放大培養(yǎng)。利用上一部分中，我們建立的實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系，將解脲支原體分群為細(xì)小脲原體和解脲脲原體，只選擇其中的細(xì)小脲原體。本方法得到的臨床株為細(xì)小脲原體株型。臨床株的分離培養(yǎng)研究?jī)?nèi)容常規(guī)PCR及PCR產(chǎn)物克隆細(xì)小脲原體常規(guī)PCR反應(yīng)體系(50μl)試劑名稱加入量（μl）終濃度10×PCRbuffer51×PCRbufferMgCl2（25mM）52.5mMdNTPs(10mM)10.2mMTaq酶(5U/μl)0.31.5U上游引物(10μM)1.750.35μM下游引物(10μM)1.750.35μMddH2O32.7模板2.5PCR反應(yīng)條件1cycle：95℃，5min;40cycles：94℃，15s，52℃，60s；72℃，延伸5min。研究?jī)?nèi)容陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株P(guān)CR產(chǎn)物均用于構(gòu)建克隆，以驗(yàn)證陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株的型別和確定細(xì)小脲原體具體屬于哪個(gè)型。本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR體系不使用系列梯度稀釋的重組質(zhì)粒制備定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，不對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。TaqMan-MGB探針和引物序列設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容含陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)小脲原體血清型1和臨床分離株Upcis-001目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切的產(chǎn)物凝膠電泳圖

A：DNAsizemarker622，527，404，309，242，201，190，160，147，123bpB：含細(xì)小脲原體血清型1目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物（108+216=324bp）C：含臨床分離株Upcis-001（血清型3）目標(biāo)片斷的重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物（108+216=324bp）

ABCTaqMan-MGB探針和引物序列設(shè)計(jì)研究?jī)?nèi)容雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法建立細(xì)小脲原體－1/14雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系(50μl)細(xì)小脲原體－3/6雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系(50μl)試劑名稱加入量（μl）終濃度加入量（μl）終濃度10×PCRbuffer51×PCRbuffer51×PCRbufferMgCl2（25mM）73.0mM72.5mMdNTPs(10mM)1.250.25mM10.2mMHotstar酶(5U/μl)0.10.5U0.10.5U上游引物(10μM)2.250.45μM2.250.45μM下游引物(10μM)2.250.45μM2.250.45μMUP1/UP3TaqMan－MGB探針(10μM)1.250.25μM1.750.35μMUP14/UP6TaqMan－MGB探針(10μM)1.50.30μM1.50.30μMddH2O27.427.15模板22PCR反應(yīng)條件1cycle：94℃，5min

；40cycles：94℃，15s,58℃，60s。熒光PCR反應(yīng)使用的儀器為：iCycleriQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀，檢測(cè)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為：檢測(cè)樣品的Ct值≤32時(shí)，為陽(yáng)性結(jié)果；檢測(cè)樣品的Ct值＞32時(shí)，為陰性結(jié)果。研究?jī)?nèi)容我們使用細(xì)小脲原體標(biāo)準(zhǔn)株血清型1、3、6、14，4個(gè)陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株，24個(gè)細(xì)小脲原體臨床分離株和無(wú)菌水陰性對(duì)照作為模板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證“細(xì)小脲原體－1/14雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系”和“細(xì)小脲原體－3/6雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系”的特異性。雙重實(shí)時(shí)熒光PCR特異性研究研究?jī)?nèi)容當(dāng)血清型1和14模板同時(shí)加入“細(xì)小脲原體－1/14雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系”時(shí)，iCycleriQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀可以同時(shí)產(chǎn)生2條擴(kuò)增熒光曲線（FAM和HEX）。當(dāng)血清型1或14模板加入“細(xì)小脲原體－1/14雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系”時(shí)，iCycleriQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀可以產(chǎn)生1條相應(yīng)的擴(kuò)增熒光曲線（FAM或HEX）當(dāng)血清型3或6，或無(wú)菌水，或4個(gè)陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)株作為模板加入“細(xì)小脲原體－1/14雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系”時(shí)，iCycleriQTM多色實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)儀經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)后都不能產(chǎn)生擴(kuò)增熒光曲線。由此表明，“細(xì)小脲原體－1/14雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系”具有很好的特異性。按照以上方案進(jìn)行的特異性評(píng)估實(shí)驗(yàn)證明“細(xì)小脲原體－3/6雙重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系”的特異性也很高。研究?jī)?nèi)容臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果分析研究?jī)?nèi)容通過(guò)整合實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行基因定量的功能、TaqMan-MGB探針有效區(qū)分單核苷酸變異進(jìn)行基因分型的功能和雙重PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)一系列的創(chuàng)造性研究工作和反復(fù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn),研究總結(jié)與創(chuàng)新點(diǎn)Title我們研發(fā)的“雙重實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系”可以用于臨床上快速、同步、定量檢測(cè)細(xì)小脲原體和沙眼衣原體；我們研發(fā)的“兩套單個(gè)實(shí)時(shí)TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系”可以用于迅速鑒定臨床樣品是生物一群或/和生物二群，以及確定各群的精確數(shù)量；我們研發(fā)的“兩套雙重實(shí)時(shí)TaqMan熒光PCR反應(yīng)體系”可以用于快速對(duì)細(xì)小脲原體進(jìn)行定性檢測(cè)和基因分型。TitleTitle以上分子生物學(xué)檢測(cè)方法和基因分群分型方法對(duì)細(xì)小脲原體和沙眼衣原體的臨床診斷及治療具有重要意義，對(duì)解脲支原體感染的致病機(jī)理和流行病學(xué)研究至關(guān)重要。主要研究成果達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平獲得的國(guó)家專利快速檢測(cè)沙眼衣原體的熒光定量PCR試劑盒，

發(fā)明人：曹軒；王業(yè)富，專利號(hào)：ZL200610018766.8快速檢測(cè)細(xì)小脲原體的熒光定量PCR試劑盒，發(fā)明人：曹軒；王業(yè)富，專利號(hào)：ZL200610018767.2同步檢測(cè)沙眼衣原體和細(xì)小脲原體的熒光定量PCR試劑盒，發(fā)明人：王業(yè)富；曹軒，專利號(hào)：ZL200610018768.7主要研究成果主要研究成果項(xiàng)目已發(fā)表的SCI論文CaoX,JiangZ,WangY,GongR,ZhangC.,“Twomultiplexreal-timeTaqManpolymerasechainreactionsystemsforsimultaneousdetectingandserotypingofUreaplasmaparvum.”DiagnMicrobiolInfectDis.2007（59）109–111.（IF=2.553）

CaoX,WangY,HuX,QingH,WangH.,“Real-timeTaqManpolymerasechainreactionassaysforquantitativedetectionanddifferentiationofUreaplasmaurealyticumandUreaplasmaparvum.”,DiagnMicrobiolInfectDis.200757(4):373-8.（IF=2.553）

CaoX,WangYF,ZhangCF,GaoWJ.,“VisualDNAmicroarraysforsimultaneousdetectionofUreaplasmaurealyticumandChlamydiatrachomatiscoupledwithmultiplexasymmetricalPCR.”,BiosensBioelectron.2006;22(3):393-8.(IF=5.061)JingfengTang,LiZhou,YefuWang.Novelmultiplexreal-timePCRsystemusingtheSNPtechnologyforthesimultaneousdiagnosisofChlamydiatrachomatis,UreaplasmaparvumandUreaplasmaurealyticumandgenetictypingofserovarsofC.trachomatisandU.parvuminNGU.MolecularandCellularProbes25(2011)55-59.（IF=2.553

）JingfengTang,ZhenghuiYefuWang.RapidandSimultaneousDetectionofUreaplasmaParvumandChlamydiaTrachomatisAntibodiesbasedonVisualProteinMicroarrayusingGoldNanoparticlesandSilverEnhancement,DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease67(2010)122–128.（IF=2.553

）主要研究成果項(xiàng)目已發(fā)表的SCI論文主要研究成果雙重FQ-PCR鑒別檢測(cè)細(xì)小脲原體和解脲脲原體及其分型研究目視化基因芯片同步鑒別檢測(cè)細(xì)小脲原體和沙眼衣原體項(xiàng)目已發(fā)表的SCI論文主要研究成果目視化蛋白芯片同步鑒別檢測(cè)細(xì)小脲原體和沙眼衣原體基于SNP技術(shù)鑒別檢測(cè)細(xì)小脲原體、解脲脲原體、沙眼衣原體及對(duì)沙眼衣原體的分型研究項(xiàng)目已發(fā)表的SCI論文主要研究成果部分研究成果已形成產(chǎn)品主要研究成果主要研究成果已獲產(chǎn)品注冊(cè)證書(shū)I、病原體檢測(cè)系列淋球菌（