生物大分子的提取與沉淀分離技術(shù)課件

生物大分子的提取與沉淀分離技術(shù)生物大分子的提取與沉淀分離技術(shù)1第一節(jié)

細胞破碎細胞破碎的原因：破碎的主要方法：機械法、物理法、化學(xué)法、酶法第一節(jié)細胞破碎細胞破碎的原因：21機械破碎方法1.

1高速組織搗碎機原理操作：裝料，低速→高速效果：作用強烈，活性物質(zhì)易受破壞1.

2勻漿器原理：效果：破碎程度較搗碎機高，破壞較少1.

3研磨器1機械破碎方法1.

1高速組織搗碎機32物理破碎2.1溫度差破碎法2.2壓力差破碎法2.3超聲波破碎法影響因素：樣品濃度、超聲波頻率、功率、破碎時間操作：冰浴、間歇進行適用于懸浮細胞破碎2物理破碎2.1溫度差破碎法43化學(xué)破碎法原理：化學(xué)試劑改變或破壞細胞膜結(jié)構(gòu)常用試劑：有機溶劑、表面活性劑4酶學(xué)破碎法外加酶制劑或自溶法3化學(xué)破碎法5第二節(jié)提取1提取的基本概念與影響因素提?。ǔ樘峄蜉腿。褐饕绊懸蛩兀篴欲提取的物質(zhì)在所用的溶劑中的溶解度；b該物質(zhì)向溶劑擴散的難易溶解度大?。篴溶劑：相似相溶；b溫度c等電點2蛋白質(zhì)和酶的提取提取方法：水溶液提取、有機溶劑提取、混合提取選擇方法依據(jù)：存在部位、分子結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)第二節(jié)提取1提取的基本概念與影響因素62.1水溶液提取水、稀鹽、稀酸、稀堿溶液常用稀鹽溶液和緩沖液，應(yīng)注意控制鹽濃度、溫度、pH2.1.1鹽濃度的選擇一般用等滲鹽溶液。但根據(jù)溶解度，有些蛋白質(zhì)要用較高濃度鹽溶液提取，而有些則用純水提取。2.1水溶液提取水、稀鹽、稀酸、稀堿溶液72.1.2pH的選擇不在等電點附近，但不宜太高或太低。pH3~4有利于離子鍵分離2.1.3溫度的選擇一般0~10℃（常用4℃），對于耐高溫的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，可使雜蛋白變性分離，有利于提取和進一步純化。2.1.4添加底物或輔酶有利于酶的提取2.1.2pH的選擇82.2有機溶劑提取常用有機溶劑：乙醇、丙酮、丁醇等注意：蛋白質(zhì)提取應(yīng)根據(jù)不同蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)選用不同的提取條件2.2有機溶劑提取93核酸的提取類化合物都溶于水而不溶于有機溶液，一般用水溶液提取。提取的一般都是核蛋白。DNA-Pro.與RNA-Pro.在不同濃度電解質(zhì)溶液中溶解度有明顯差別：0.14mol/LNaCl:RNA-Pro.溶解度相當(dāng)大，DNA-Pro.溶解度僅為水中1％。1mol/LNaCl:RNA-Pro.溶解度小，DNA-Pro.溶解度比水中大2倍。DNA-Pro.與RNA-Pro.在不同pH下溶解度不同RNA-Pro.PH2.0-2.5S最小DNA-Pro.PH4.2S最小應(yīng)選擇不同的條件提取分離DNA-Pro.與RNA-Pro.3核酸的提取類化合物都溶于水而不溶于有機溶液，一般用水溶液103.1RNA提取細胞破碎→水溶→過濾去渣→調(diào)pH5→tRNA↓mRNA，rRNA:3.1.1稀鹽溶液提取細胞破碎→勻漿0.14mol/LNaCl→RNA-Pro提取液→分離DNA-Pro、Pro、多糖RNA：tRNA15%，mRNA5%，rRNA80%3.1RNA提取細胞破碎→水溶→過濾去渣→調(diào)pH5113.1.2苯酚水溶液提取細胞破碎→勻漿等體積90％苯酚水溶液振蕩→RNA、Pro分開→RNA、多糖（水層）；DNA、Pro（苯酚層）冷酚法、熱酚法，注意苯酚除雜3.2DNA提取濃鹽法：1mol/L氯化鈉溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)或：先用稀鹽除去RNA－Pro，再用濃鹽提取也可用苯酚法，苯酚層得到DNA、Pro3.1.2苯酚水溶液提取12第三節(jié)沉淀分離

分離純化：除去各種雜質(zhì)，獲得較高純度物質(zhì)的過程蛋白質(zhì)和酶分離提純方法：沉淀分離、層析分離、電泳分離、超離心分離等。沉淀分離：通過改變某些條件或加入某種物質(zhì)，使溶液中某種溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出的技術(shù)。包括鹽析沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、復(fù)合沉淀法、金屬鹽沉淀法、選擇性變性沉淀等。

第三節(jié)沉淀分離分離純化：除去各種雜質(zhì)，獲得較高純度物質(zhì)的133.1鹽析沉淀法蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度受鹽濃度影響鹽溶：鹽析：

鹽濃度改變蛋白質(zhì)溶解度：改變蛋白質(zhì)分子表面電荷，同時改變?nèi)芤褐兴幕疃?，改變水?.1鹽析沉淀法蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度受鹽濃度影響14蛋白質(zhì)溶解度與溶液中離子強度關(guān)系：lg(S/S0)=-ksIlgS=lgS0-ksI=β-ksIβ為常數(shù)，取決于蛋白性質(zhì)、T、pHks為鹽析常數(shù)，與鹽性質(zhì)（離子價數(shù)、離子半徑等）、蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)ks越大，鹽析效果越好I=(1/2)∑mizi2一定條件下，S取決于I分段鹽析：ks分段鹽析（β一定，pH、T一定）；β分段鹽析（ks、I一定，改變pH、T）蛋白質(zhì)溶解度與溶液中離子強度關(guān)系：153.1.2鹽的選擇通常采用中性鹽，最常用（NH4）2SO4，原因：水中S大，溫度對S影響小，廉價易得，不易引起蛋白質(zhì)變性，分段效果好。3.1.2鹽的選擇163.1.3鹽析注意事項（1）

鹽純度高，沉淀完全后再分離；（2）

分段鹽析分離幾種蛋白質(zhì)，與等電點沉淀配合；（3）

室溫或低溫進行；（4）

選擇合適濃度的樣品；（5）

脫鹽（透析、電滲析、凝膠層析、超濾）3.1.3鹽析注意事項（1）

鹽純度高，沉淀完全后173.2等電點沉淀法3.3有機溶劑沉淀法常用丙酮、異丙酮、乙醇、甲醇等適用范圍：缺點：易變性操作：低溫，沉淀分離后快稀釋，添加少量無機鹽，pH接近pI，用量試驗確定，可先濃縮。

3.4選擇性變性沉淀雜蛋白變性沉淀，不影響所需蛋白3.2等電點沉淀法18三核酸的沉淀分離溫度：0～4℃

，防止變性和降解加入核酸酶抑制劑防止核酸酶引起的水解1有機溶液沉淀法乙醇2等電點沉淀法3鈣鹽沉淀法（氯化鈣＋乙醇）4選擇性溶劑沉淀法三核酸的沉淀分離溫度：0～4℃，防止變性和降解19生物大分子的提取與沉淀分離技術(shù)生物大分子的提取與沉淀分離技術(shù)20第一節(jié)

細胞破碎細胞破碎的原因：破碎的主要方法：機械法、物理法、化學(xué)法、酶法第一節(jié)細胞破碎細胞破碎的原因：211機械破碎方法1.

1高速組織搗碎機原理操作：裝料，低速→高速效果：作用強烈，活性物質(zhì)易受破壞1.

2勻漿器原理：效果：破碎程度較搗碎機高，破壞較少1.

3研磨器1機械破碎方法1.

1高速組織搗碎機222物理破碎2.1溫度差破碎法2.2壓力差破碎法2.3超聲波破碎法影響因素：樣品濃度、超聲波頻率、功率、破碎時間操作：冰浴、間歇進行適用于懸浮細胞破碎2物理破碎2.1溫度差破碎法233化學(xué)破碎法原理：化學(xué)試劑改變或破壞細胞膜結(jié)構(gòu)常用試劑：有機溶劑、表面活性劑4酶學(xué)破碎法外加酶制劑或自溶法3化學(xué)破碎法24第二節(jié)提取1提取的基本概念與影響因素提?。ǔ樘峄蜉腿。褐饕绊懸蛩兀篴欲提取的物質(zhì)在所用的溶劑中的溶解度；b該物質(zhì)向溶劑擴散的難易溶解度大?。篴溶劑：相似相溶；b溫度c等電點2蛋白質(zhì)和酶的提取提取方法：水溶液提取、有機溶劑提取、混合提取選擇方法依據(jù)：存在部位、分子結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)第二節(jié)提取1提取的基本概念與影響因素252.1水溶液提取水、稀鹽、稀酸、稀堿溶液常用稀鹽溶液和緩沖液，應(yīng)注意控制鹽濃度、溫度、pH2.1.1鹽濃度的選擇一般用等滲鹽溶液。但根據(jù)溶解度，有些蛋白質(zhì)要用較高濃度鹽溶液提取，而有些則用純水提取。2.1水溶液提取水、稀鹽、稀酸、稀堿溶液262.1.2pH的選擇不在等電點附近，但不宜太高或太低。pH3~4有利于離子鍵分離2.1.3溫度的選擇一般0~10℃（常用4℃），對于耐高溫的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，可使雜蛋白變性分離，有利于提取和進一步純化。2.1.4添加底物或輔酶有利于酶的提取2.1.2pH的選擇272.2有機溶劑提取常用有機溶劑：乙醇、丙酮、丁醇等注意：蛋白質(zhì)提取應(yīng)根據(jù)不同蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)選用不同的提取條件2.2有機溶劑提取283核酸的提取類化合物都溶于水而不溶于有機溶液，一般用水溶液提取。提取的一般都是核蛋白。DNA-Pro.與RNA-Pro.在不同濃度電解質(zhì)溶液中溶解度有明顯差別：0.14mol/LNaCl:RNA-Pro.溶解度相當(dāng)大，DNA-Pro.溶解度僅為水中1％。1mol/LNaCl:RNA-Pro.溶解度小，DNA-Pro.溶解度比水中大2倍。DNA-Pro.與RNA-Pro.在不同pH下溶解度不同RNA-Pro.PH2.0-2.5S最小DNA-Pro.PH4.2S最小應(yīng)選擇不同的條件提取分離DNA-Pro.與RNA-Pro.3核酸的提取類化合物都溶于水而不溶于有機溶液，一般用水溶液293.1RNA提取細胞破碎→水溶→過濾去渣→調(diào)pH5→tRNA↓mRNA，rRNA:3.1.1稀鹽溶液提取細胞破碎→勻漿0.14mol/LNaCl→RNA-Pro提取液→分離DNA-Pro、Pro、多糖RNA：tRNA15%，mRNA5%，rRNA80%3.1RNA提取細胞破碎→水溶→過濾去渣→調(diào)pH5303.1.2苯酚水溶液提取細胞破碎→勻漿等體積90％苯酚水溶液振蕩→RNA、Pro分開→RNA、多糖（水層）；DNA、Pro（苯酚層）冷酚法、熱酚法，注意苯酚除雜3.2DNA提取濃鹽法：1mol/L氯化鈉溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質(zhì)或：先用稀鹽除去RNA－Pro，再用濃鹽提取也可用苯酚法，苯酚層得到DNA、Pro3.1.2苯酚水溶液提取31第三節(jié)沉淀分離

分離純化：除去各種雜質(zhì)，獲得較高純度物質(zhì)的過程蛋白質(zhì)和酶分離提純方法：沉淀分離、層析分離、電泳分離、超離心分離等。沉淀分離：通過改變某些條件或加入某種物質(zhì)，使溶液中某種溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出的技術(shù)。包括鹽析沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、復(fù)合沉淀法、金屬鹽沉淀法、選擇性變性沉淀等。

第三節(jié)沉淀分離分離純化：除去各種雜質(zhì)，獲得較高純度物質(zhì)的323.1鹽析沉淀法蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度受鹽濃度影響鹽溶：鹽析：

鹽濃度改變蛋白質(zhì)溶解度：改變蛋白質(zhì)分子表面電荷，同時改變?nèi)芤褐兴幕疃?，改變水?.1鹽析沉淀法蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度受鹽濃度影響33蛋白質(zhì)溶解度與溶液中離子強度關(guān)系：lg(S/S0)=-ksIlgS=lgS0-ksI=β-ksIβ為常數(shù)，取決于蛋白性質(zhì)、T、pHks為鹽析常數(shù)，與鹽性質(zhì)（離子價數(shù)、離子半徑等）、蛋白結(jié)構(gòu)有關(guān)ks越大，鹽析效果越好I=(1/2)∑mizi2一定條件下，S取決于I分段鹽析：ks分段鹽析（β一定，pH、T一定）；β分段鹽析（ks、I一定，改變pH、T）蛋白質(zhì)溶解度與溶液中離子強度關(guān)系：343.1.2鹽的選擇通常采用中性鹽，最常用（NH4）2SO4，原因：水中S大，溫度對S影響小，廉價易得，不易引起蛋白質(zhì)變性，分段效果好。3.1.2鹽的選擇353.1.3鹽析注意事項（1）

鹽純度高，沉淀完全后再分離；（2）

分段鹽析分離幾種蛋白質(zhì)，與等電點沉淀配合；（3）

室溫或低溫進行；（4）

選擇合適濃度的樣品；（5）

脫鹽（透析、電滲析、凝膠層析、超濾）3.1.3鹽析注意事項（1）

鹽純度高，沉淀完全后