離子交換層析課件

層析8.1概述8.2層析的基本原理與基本概念8.3層析分離方法介紹凝膠過濾，離子交換，疏水，羥基磷灰石，共價，反相及親和層析等。層析8.1概述1層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進行分離的方法又稱色譜法，層離法，層析法;可用于生產(chǎn)規(guī)模，也可作為分析檢測，控制產(chǎn)品的質(zhì)量。㈠層析的概念8.1概述層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，21903年，俄國植物學(xué)家Tswett提出色層分離法的概念1931年，Kuhn和Lederr在氧化鋁和碳酸鈣柱體上，以制備規(guī)模分離胡羅卜素和葉黃素。1938年，適用范圍擴展到無色物質(zhì)。1940～1943年間，Tswett提出了前流分析和置換分析法。50年代，氣相色譜Martin和Synge，60年代，液相色譜DNA重組技術(shù)的發(fā)展，制備色譜研究成為熱點㈡層析的發(fā)展歷程8.1概述1903年，俄國植物學(xué)家Tswett提出色層分離法的概念㈡層3英國生物學(xué)家Martin和Synge(1952諾貝爾化學(xué)獎

他們首先提出了色譜塔板理論。以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據(jù)液－液逆流萃取的原理，發(fā)明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠見卓識的預(yù)言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數(shù))，這將會大大提高分離效率。㈡層析的發(fā)展歷程8.1概述英國生物學(xué)家Martin和Synge(1952諾貝爾化學(xué)獎4分離效率高：每米柱可達幾千至幾十萬的塔板數(shù)，適于極復(fù)雜混合物的分離。應(yīng)用范圍廣選擇性強：通過操作方法，洗脫方式和操作條件來實現(xiàn)。高靈敏度的在線檢測：紫外、熒光、折光等快速分離：高效層析劑和高壓液相色譜過程的自動化操作㈢層析的特點8.1概述分離效率高：每米柱可達幾千至幾十萬的塔板數(shù)，適于極復(fù)雜混合物5色譜分離的規(guī)模：色譜分析：<10mg半制備：10～50mg制備：0.1～10g工業(yè)生產(chǎn)：>20g/d㈣生物工業(yè)中的色譜分離8.1概述色譜分離的規(guī)模：㈣生物工業(yè)中的色譜分離8.1概述6分析色譜與制備及工業(yè)色譜的比較：應(yīng)用色譜技術(shù)范圍不同：分析（柱，紙和薄板）；制備（柱）操作上不同：分析（進樣量越小越好，檢測靈敏度越高越佳；制備（進樣量越大越好，色譜柱適當(dāng)大）色譜分離理論不同：理論塔板數(shù)的不同；分配系數(shù)不同；樣品保留值與峰高的不同㈣

生物工業(yè)中的色譜分離分析色譜與制備及工業(yè)色譜的比較：㈣生物工業(yè)中的色譜分離7原理：層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進行分離的方法；互不混溶的兩相分別稱為固定相和流動相；料液中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間發(fā)生擴散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡，分配系數(shù)大的溶質(zhì)隨流動相移動的速度小。8.2原理與基本概念原理：8.2原理與基本概念8離子交換層析課件9離子交換層析課件10層析分類

流動相與固定相固定相的形狀壓力流動相的流動方向分離操作方式分配機理

層析分類流動相與固定相111.流動相與固定相根據(jù)流動相的相狀態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法；固定相為液體的分配層析法、固定相為固體的吸附層析法以及固定相為固定于固體表面的液體薄層(以固體為載體)的分配層析法等。層析分類

1.流動相與固定相層析分類122.固定相的形狀根據(jù)固定相或?qū)游鲅b置形狀的不同，液相層析法又分紙層析法、薄層層析法和柱層析法紙層析和薄層層析多用于分析目的，而柱層析易于放大，適用于大量制備分離，是主要的層析分離手段。

層析分類

2.固定相的形狀層析分類133.壓力在以固體為固定相的液相柱層析中，根據(jù)操作壓力的不同，分為低壓(壓力一般小于0.5MPa)、中壓(壓力為0.5～4.OMPa)和高壓(壓力為4.0～40MPa)液相層析法；高壓液相層析法中層析介質(zhì)(固定相)微細，分離精度高、速度快，主要用于成分分析。大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法。層析分類

3.壓力層析分類144.流動相的流動方向軸向流層析；徑向流層析：溶質(zhì)在半徑方向上得到分離，優(yōu)點是規(guī)模放大時，半徑不變，通過增加柱高提高處理能力，且壓降不會增加，適于大規(guī)模；但造價高。層析分類

4.流動相的流動方向?qū)游龇诸?55.分離操作方式

洗脫展開(elutiondevelopment)迎頭分析(frontanalysis)頂替展開

(Elutionchromatography)

層析分類

5.分離操作方式層析分類16層析分類

5.分離操作方式：洗脫展開降樣品盡量濃縮，引入色譜柱上部，用溶劑洗脫（溶劑與固定相無親和力），依親和力的大小而速度不同，前進靠溶劑的推動。層析分類5.分離操作方式：洗脫展開17層析分類

5.分離操作方式：洗脫展開恒定洗脫法：不改變洗脫劑組成，優(yōu)點是操作簡單，不需要較復(fù)雜的設(shè)備；但洗脫劑組成需實驗確定，太弱的洗脫劑不能有效洗脫，太強的洗脫劑，分辨率較差。逐次洗脫法：洗脫劑組成至少改變一次，優(yōu)點是操作簡單，重現(xiàn)性好，但洗脫條件一次改變后，有些組分會共同洗下，影響分離效果。梯度洗脫：逐次改變洗脫劑的組成，優(yōu)點是消除重疊峰現(xiàn)象，但洗脫體積過大，組分濃度變稀。層析分類5.分離操作方式：洗脫展開185.分離操作方式：迎頭分析又稱前流，前沿分析法，將待分離的混合物不斷輸入柱中，讓它一直流下去，直到過程結(jié)束。親和力小的先流出，一般不能達到組分的分離，只有作用力最弱的組分為純品。適于除痕量雜質(zhì)，組分濃度不會被稀釋。層析分類

CABA+B5.分離操作方式：迎頭分析層析分類CABA+B195.分離操作方式:頂替展開又稱置換，排代展開，利用一種與固定相作用力極強的置換劑作流動相，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。優(yōu)點是濃縮，單位柱長固定相的利用率最高。但各組分一個連一個的流出，界線不明，分離不理想；合適的置換劑不易找到。層析分類

DABD：置換劑5.分離操作方式:頂替展開層析分類DABD：置換劑206.分配機理凝膠過濾層析、離子交換層析、反相層析；疏水性相互作用層析和親和層析等。層析分類

6.分配機理層析分類21基本概念

1.分配系數(shù)：kd＝q/c2.阻滯因數(shù)Rf：溶質(zhì)的遷移速率與一理想標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（既不吸附也不溶解）的移動速率之比，移動長度一樣時：tm，

ts：理想物質(zhì)和溶質(zhì)的消耗時間tR：保留時間基本概念1.分配系數(shù)：kd＝q/ctm，ts：理想物質(zhì)22基本概念

2.阻滯因數(shù)Rf：基本概念2.阻滯因數(shù)Rf：23基本概念

3.洗脫體積VR：溶質(zhì)達最大濃度時，已流出的流動相體積，VR＝Vm＋kdVs滯留時間：溶質(zhì)流出色譜柱所需的時間tR＝VR/Qet0＝Vm/QeQe:洗脫劑的流量t0：死時間基本概念3.洗脫體積VR：溶質(zhì)達最大濃度時，已流出的流動24基本概念

4.容量因子k：是固定相和流動相溶質(zhì)數(shù)量之比容量因子是吸附劑對溶質(zhì)親和力的量度，k越低，從柱中流出的越早基本概念4.容量因子k：是固定相和流動相溶質(zhì)數(shù)量之比容量25基本概念

5.選擇性α：α＝kd1/kd26.分離度（分辨率）Rs：表達兩種洗脫曲線相鄰的溶質(zhì)相互分離的程度。為提高溶質(zhì)之間的分離度，可以采用增大峰間距離或降低峰寬的方法?；靖拍?.選擇性α：26分離度

分離度27層析過程理論基礎(chǔ)

平衡模型：假定不存在傳質(zhì)阻力，分配平衡瞬間完成。理論板模型：認為分配平衡不能瞬間完成，需一定柱高，即一個理論板。適合低濃度料液，不能確定層析柱分離性能的影響因素。軸向擴散模型：假定每一截面有均勻徑向濃度；每一截面及流動方向上，流體速率與軸向擴散系數(shù)均為定值；溶質(zhì)濃度為流動距離的連續(xù)函數(shù)。

層析過程理論基礎(chǔ)平衡模型：假定不存在傳質(zhì)阻力，分配平衡瞬間28原理與操作

凝膠過濾介質(zhì)

影響分離特性的因素

應(yīng)用

特點

8.3層析方法介紹㈠凝膠過濾層析原理與操作8.3層析方法介紹㈠凝膠過濾層析29凝膠層析（gelchromatography）又稱為凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）、分子篩層析（molecularsievechromatography）、凝膠過濾（gelfiltration）、凝膠滲透層析（gelpermeationchromatography）等。

8.3層析方法介紹㈠凝膠過濾層析凝膠層析（gelchromatography）又稱為凝膠排30原理與操作凝膠過濾層析(GFC)利用凝膠粒子為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進行分離的液相層析法；GFC操作中溶質(zhì)的分配系數(shù)m只是溶質(zhì)相對分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu)(孔徑分布)的函數(shù)，與所用洗脫液的pH值和離子強度等物性無關(guān)。原理與操作凝膠過濾層析(GFC)利用凝膠粒子為固定相，根據(jù)料31離子交換層析課件32原理與操作限定條件下，Vt，V0一定，Ve隨分離物質(zhì)分子量變化而變化，分子量增加，分配系數(shù)降低。兩種溶質(zhì)，kav差異大，分離效果好。原理與操作限定條件下，Vt，V0一定，Ve隨分離物質(zhì)分子量變33凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；穩(wěn)定性強，在較寬的pH和離子強度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長；具有一定的孔徑分布范圍；機械強度高，允許較高的操作壓力(流速)。凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：34凝膠過濾介質(zhì)常用的凝膠過濾介質(zhì)

凝膠過濾介質(zhì)常用的凝膠過濾介質(zhì)35凝膠過濾介質(zhì)凝膠特性參數(shù)排阻極限(exclusionlimit)分級范圍(fractionationrange)溶脹率：每g干凝膠吸收水分的百分數(shù)凝膠粒徑床體積：1g干凝膠溶脹后占的體積空隙體積：凝膠之間空隙所占的體積，用2000kD的藍色葡聚糖測定。凝膠過濾介質(zhì)凝膠特性參數(shù)36離子交換層析課件37凝膠過濾操作凝膠用量計算和處理：床體積/膨脹度；5～10倍蒸餾水浸泡懸浮除小顆粒0.5MNaOH~0.5MNaCl室溫浸泡0.5h洗至中性層析柱選擇：1：25～1：100，夾套控溫裝柱，凝膠柱鑒定（藍，紅葡聚糖）上樣：（少，分辨率高），洗脫：（單一緩沖液），再生：(水反復(fù)逆相沖洗，緩沖液平衡）保存：洗凈，適量防酶劑，酒精，冰箱。凝膠過濾操作凝膠用量計算和處理：床體積/膨脹度；5～10倍蒸38影響分離特性的因素線速度料液體積料液濃度：過高，洗脫曲線不規(guī)則，粘度分子量與分配系數(shù)的關(guān)系凝膠粒徑影響分離特性的因素線速度39線速度影響分離特性的因素線速度影響分離特性的因素40影響分離特性的因素料液體積影響分離特性的因素料液體積41影響分離特性的因素分子量與分配系數(shù)的關(guān)系：選擇分級范圍小的介質(zhì)，利于提高分離度影響分離特性的因素分子量與分配系數(shù)的關(guān)系：選擇分級范圍小的介42應(yīng)用分離純化脫鹽相對分子質(zhì)量的測定

應(yīng)用分離純化43凝膠過濾特點GFC的優(yōu)點如下：溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近100％；每批分離操作結(jié)束后不需要進行介質(zhì)的清洗或再生，故容易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度高；質(zhì)活性收率高；分離機理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。

凝膠過濾特點GFC的優(yōu)點如下：44GFC的不足之處在于：僅根據(jù)溶質(zhì)之間分子量的差別進行分離，選擇性低，料液處理量小；經(jīng)GFC洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋，因此需要在具有濃縮作用的單元操作(如超濾、離子交換和親和層析等)后使用。

凝膠過濾特點GFC的不足之處在于：凝膠過濾特點45原理與操作IEC的應(yīng)用特點㈡

離子交換層析8.3層析方法介紹原理與操作㈡離子交換層析8.3層析方法介紹46原理與操作離子交換層析(Ionexchangechromatography，IEC)利用離子交換劑為固定相，是根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進行溶質(zhì)分離的洗脫層析法；陰離子交換基有DEAE，QAE；陽離子交換基為CM，P和SP。常用于制備離子交換劑的介質(zhì)有Sephadex、Sepharose、TSKgelPW、Bio—Gel和纖維素等。㈡

離子交換層析原理與操作㈡離子交換層析47洗脫時采用流動相離子強度線性增大的線性梯度洗脫法(lineargradiente1ution)或離子強度階躍增大的逐次洗脫法(stepwiseelution)。小型層析柱的實驗數(shù)據(jù)一般不能直接用于規(guī)模放大，而必須實施必要的探索性實驗。

㈡

離子交換層析洗脫時采用流動相離子強度線性增大的線性梯度洗脫法(linea48荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示：其中I為流動相的離子強度，A和B為常數(shù)，m∞為離子強度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。對于不同的溶質(zhì)，式中的常數(shù)A和B不同，即在離子交換劑上的分配行為不同，因此在洗脫過程中彼此之間得到分離。㈡

離子交換層析荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示：㈡離子交49線性梯度洗脫過程中，流動相的離子強度線性增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)連續(xù)降低，移動速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì)在較小的流動相體積下洗脫。顯然，通過改變流動相離子強度的增大速度(即濃度梯度)，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，即溶質(zhì)洗脫峰之間的距離，在改善分離度的同時縮短洗脫時間。㈡

離子交換層析線性梯度洗脫過程中，流動相的離子強度線性增大，因此溶50離子交換層析課件51

逐次洗脫過程中，流動相的離子強度階躍增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低和移動速度的增大也是階段式的。如果流動相離子強度的階躍速度很快，逐次洗脫就接近了線性梯度洗脫；反之則接近恒定洗脫。因此逐次洗脫是介于恒定洗脫與線性梯度洗脫之間的一種洗脫法。

㈡

離子交換層析逐次洗脫過程中，流動相的離子強度階躍增大，因此溶質(zhì)的分52在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程，IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。層析操作多采用線性梯度洗脫法或逐次沉脫法，只是流動相組成的變化情況各不相同。

㈡

離子交換層析在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程，IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部53IEC的應(yīng)用IEC是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。這主要是由于IEC基于離子交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，不僅具有通用性，而且選擇性遠高于GFC。

㈡

離子交換層析IEC的應(yīng)用㈡離子交換層析54特點料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；應(yīng)用范圍廣泛，通過優(yōu)化操作條件可大幅提高分離的選擇性，所需柱長較短；產(chǎn)品回收率高；商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格也遠低于親和吸附劑。㈡

離子交換層析特點㈡離子交換層析55原理疏水性吸附劑操作特點㈢疏水層析8.3層析方法介紹原理㈢疏水層析8.3層析方法介紹56原理硫水性相互作用層析(HIC)利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(疏水性配基)的疏水性吸附劑為固定相，是根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法蛋白質(zhì)的吸附(進料)需在高濃度鹽溶液中進行，洗脫則主要采用降低流動相離子強度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。㈢疏水層析原理㈢疏水層析57疏水性吸附劑疏水性吸附作用與配基的硫水性(疏水鏈長度)和配基密度成正比；配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異；疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用介于氨苯的結(jié)合或醚鍵結(jié)合，形成各種疏水性吸附劑。㈢疏水層析疏水性吸附劑㈢疏水層析58常用商品化疏水吸附劑常用商品化疏水吸附劑59常用疏水吸附劑結(jié)構(gòu)常用疏水吸附劑結(jié)構(gòu)60HIC操作

影響疏水性吸附的因素離子強度及種類破壞水化作用的物質(zhì)表面活性劑溫度㈢疏水層析HIC操作㈢疏水層析61蛋白質(zhì)的分離

HIC不僅是一種有效的分離純化手段，而且還可與IEC互補短長，分離純化利用IEC難于分離的蛋白質(zhì)。在利用HIC分離蛋白質(zhì)的混合物時，需事先利用各種小型預(yù)裝柱進行吸附與洗脫實驗，確定最佳吸附劑和洗脫分離溶劑。

㈢疏水層析蛋白質(zhì)的分離㈢疏水層析62HIC的特點由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液；可通過調(diào)節(jié)疏水配基鏈長和密度調(diào)節(jié)吸附力，并根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑；疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價格與離子交換劑相當(dāng)。㈢疏水層析HIC的特點㈢疏水層析63反相層析(Reversed-phasechromatography，RPC)利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，是根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法；用于相對分子質(zhì)量低于5000，特別是l000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。

㈣反相層析8.3層析方法介紹反相層析(Reversed-phasechromatogr64溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大；當(dāng)固定相一定時，可通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)、流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大；可采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。

㈣反相層析溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大65反相介質(zhì)中最具代表性的是以硅膠為載體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表面鍵合非極性分子層制備。

㈣反相層析反相介質(zhì)中最具代表性的是以硅膠為載體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表66超臨界流體層析(Supercriticalfluidchromatography，SFC)是利用超臨界流體為流動相的洗脫層析法；利用超臨界流體作為流動相參與溶質(zhì)在固定相上的分配，可提高溶質(zhì)在固定相中的擴散速率，提高分離速度和柱效；SFC常采用增大壓力的壓力梯度洗脫法，也可采用改變?nèi)軇舛龋O性）的濃度梯度洗脫法。

㈤超臨界流體層析超臨界流體層析(Supercriticalfluidch67離子交換層析課件68離子交換層析課件69

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是一種磷酸鈣晶體，吸附主要基于鈣離子和磷酸根離子的靜電引力；HAP層析通常以磷酸鹽緩沖液為流動相，采用提高鹽濃度的線性梯度脫法；用于識別DNA及RNA的單鏈和雙鏈，分離IEC和HIC難于分離的蛋白質(zhì)等物系；HAP吸附劑價格便宜，遠低于離子交換劑，適用于大規(guī)模分離純化過程，已成為單克隆抗體的主要純化手段。㈥羥基磷灰石層析羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是一種磷70原理與操作

親和吸附介質(zhì)親和層析過程

應(yīng)用㈦親和層析原理與操作㈦親和層析71親和作用體系

特異性親和體系高特異性

群特異性抗原-單克隆抗體荷爾蒙-受體蛋白核酸-互補堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白酶—底物、產(chǎn)物、抑制劑免疫球蛋白—A蛋白、G蛋白酶—輔酶凝集素—糖、糖蛋白、細胞、細胞表面受體酶、蛋白質(zhì)—肝素酶、蛋白質(zhì)—活性色素(染料)酶、蛋白質(zhì)—過渡金屬離子(Cu2+，Zn2+等)酶、蛋白質(zhì)—氨基酸(組氨酸等)

親和作用體系高特異性抗原-單克隆抗體72親和作用體系將具有親和作用的兩種分子中的一種分子與固體粒子或可溶性物質(zhì)共價偶聯(lián)，可特異性吸附或結(jié)合另一種分子，使另一種分子（通稱為目標(biāo)產(chǎn)物）容易從混合物中得到選擇性分離純化;在親和純化中，一般將親和作用分子對中被固定的分子稱為其親和結(jié)合對象(一般為蛋白質(zhì))的配基(ligand)。

親和作用體系將具有親和作用的兩種分子中的一種分子與固體粒子或73用L表示配基，E表示蛋白質(zhì)，可逆性親和結(jié)合作用可表示為

：其中，E·L為蛋白質(zhì)與配基形成的復(fù)合體。上述結(jié)合反應(yīng)的解離常數(shù)為：結(jié)合常數(shù)為：

用L表示配基，E表示蛋白質(zhì)，可逆性親和結(jié)合作用可表示為：74原理與操作親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法；由于目標(biāo)產(chǎn)物基于生物親和作用吸附在固定相上，具有高度的選擇性，因此，親和層析操作與一般的固定床吸附操作方式相同，多采用斷通式前端分析法。

原理與操作親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親75離子交換層析課件76親和吸附介質(zhì)親和配基親和吸附介質(zhì)間隔臂

親和吸附介質(zhì)親和配基77親和配基酶的抑制劑抗體：免疫親和層析A蛋白（proteinA）凝集素（lectin）親和配基酶的抑制劑78親和配基輔酶和磷酸腺苷三嗪類色素（triazinedyes）:色素親和層析（Dye－ligandaffinitychromatography）過渡金屬離子：金屬螯合層析(Metalchelatechromatography)組氨酸肝素(heparin)親和配基輔酶和磷酸腺苷79親和吸附介質(zhì)

親和吸附介質(zhì)又稱親和載體。作為載體的固體粒子應(yīng)該滿足以下要求：具有親水性多孔結(jié)構(gòu)，無非特異性吸附，比表面積大；物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機械強度，使用壽命長；含有可活化的反應(yīng)基團，用于親和配基的固定化；粒徑均一的球形粒子。

親和吸附介質(zhì)親和吸附介質(zhì)又稱親和載體。作為載體80親和吸附介質(zhì)

利用凝膠過濾介質(zhì)合成所需的親和吸附介質(zhì)的合成方法：溴化腈活化法：用于多糖凝膠的活化，固定活性基團為氨基的配基(R—NH2)；環(huán)氧基活化法：用于多糖凝膠和表面為氨基的載體的活化，固定分子結(jié)構(gòu)為R-NH2、R-OH和R-SH的配基；硅膠的活化。親和吸附介質(zhì)利用凝膠過濾介質(zhì)合成所需的親和吸附介質(zhì)的81間隔臂為了與生物大分子發(fā)生有效的親和吸附作用，需要在配基與載體之間連接一個“間隔臂”(spacer)，以增大配基與載體之間的距離，使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結(jié)合；由于間隔臂過長容易彎曲，使配基與載體之間的距離縮短，不能有效地與酶的親和結(jié)合部位接觸，減弱了與酶的親和作用，因此引入間隔臂的長度是有一定限制的。間隔臂為了與生物大分子發(fā)生有效的親和吸附作用，需要在配基與載82離子交換層析課件83親和層析過程

吸附操作中首先要保證親和吸附介質(zhì)對目標(biāo)產(chǎn)物有較高的親和吸附作用和吸附容量，對雜質(zhì)的非特異吸附要控制在最低水平;料液流速是影響層析柱效和分離速度的重要因素；目標(biāo)產(chǎn)物在親和吸附介質(zhì)上的吸附平衡關(guān)系多用Freundlkh或Langmuir型等溫式表達。

親和層析過程吸附操作中首先要保證親和吸附介質(zhì)對目標(biāo)產(chǎn)物有較84

雜質(zhì)的非特異性吸附量與其濃度、性質(zhì)、載體材料、配基固定化法以及流動相的離子強度、pH和溫度等因素有關(guān)。因此，為減小吸附操作中的非特異性吸附量，應(yīng)注意：所用緩沖液的離子強度要適當(dāng)，緩沖液的pH值應(yīng)使配基和目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的靜電作用較?。皇褂酶呒兌鹊呐浠苽溆H和吸附介質(zhì)，提高親和吸附介質(zhì)自身的質(zhì)量；在料液(以及后續(xù)的清洗液)中加入表面活性劑，提高目標(biāo)產(chǎn)物純度和回收率。雜質(zhì)的非特異性吸附量與其濃度、性質(zhì)、載體材料、配基85親和層析過程清洗操作的目的是洗去吸附介質(zhì)內(nèi)部及柱空隙中存在的雜質(zhì)；使用與吸附操作相同的緩沖液，必要時加入表面活性劑，保證目標(biāo)產(chǎn)物的吸附和雜質(zhì)的除去。

親和層析過程清洗操作的目的是洗去吸附介質(zhì)內(nèi)部及柱空隙中存在的86親和層析過程

目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有兩種：特異性洗脫是利用含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競爭性結(jié)合，脫附目標(biāo)產(chǎn)物；非特異性洗脫通過調(diào)節(jié)洗脫液的pH值、離子強度、離子種類或溫度等理化性質(zhì)降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用，是較多采用的洗脫方法。

親和層析過程目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有兩種：87層析8.1概述8.2層析的基本原理與基本概念8.3層析分離方法介紹凝膠過濾，離子交換，疏水，羥基磷灰石，共價，反相及親和層析等。層析8.1概述88層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進行分離的方法又稱色譜法，層離法，層析法;可用于生產(chǎn)規(guī)模，也可作為分析檢測，控制產(chǎn)品的質(zhì)量。㈠層析的概念8.1概述層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，891903年，俄國植物學(xué)家Tswett提出色層分離法的概念1931年，Kuhn和Lederr在氧化鋁和碳酸鈣柱體上，以制備規(guī)模分離胡羅卜素和葉黃素。1938年，適用范圍擴展到無色物質(zhì)。1940～1943年間，Tswett提出了前流分析和置換分析法。50年代，氣相色譜Martin和Synge，60年代，液相色譜DNA重組技術(shù)的發(fā)展，制備色譜研究成為熱點㈡層析的發(fā)展歷程8.1概述1903年，俄國植物學(xué)家Tswett提出色層分離法的概念㈡層90英國生物學(xué)家Martin和Synge(1952諾貝爾化學(xué)獎

他們首先提出了色譜塔板理論。以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據(jù)液－液逆流萃取的原理，發(fā)明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠見卓識的預(yù)言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數(shù))，這將會大大提高分離效率。㈡層析的發(fā)展歷程8.1概述英國生物學(xué)家Martin和Synge(1952諾貝爾化學(xué)獎91分離效率高：每米柱可達幾千至幾十萬的塔板數(shù)，適于極復(fù)雜混合物的分離。應(yīng)用范圍廣選擇性強：通過操作方法，洗脫方式和操作條件來實現(xiàn)。高靈敏度的在線檢測：紫外、熒光、折光等快速分離：高效層析劑和高壓液相色譜過程的自動化操作㈢層析的特點8.1概述分離效率高：每米柱可達幾千至幾十萬的塔板數(shù)，適于極復(fù)雜混合物92色譜分離的規(guī)模：色譜分析：<10mg半制備：10～50mg制備：0.1～10g工業(yè)生產(chǎn)：>20g/d㈣生物工業(yè)中的色譜分離8.1概述色譜分離的規(guī)模：㈣生物工業(yè)中的色譜分離8.1概述93分析色譜與制備及工業(yè)色譜的比較：應(yīng)用色譜技術(shù)范圍不同：分析（柱，紙和薄板）；制備（柱）操作上不同：分析（進樣量越小越好，檢測靈敏度越高越佳；制備（進樣量越大越好，色譜柱適當(dāng)大）色譜分離理論不同：理論塔板數(shù)的不同；分配系數(shù)不同；樣品保留值與峰高的不同㈣

生物工業(yè)中的色譜分離分析色譜與制備及工業(yè)色譜的比較：㈣生物工業(yè)中的色譜分離94原理：層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進行分離的方法；互不混溶的兩相分別稱為固定相和流動相；料液中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間發(fā)生擴散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡，分配系數(shù)大的溶質(zhì)隨流動相移動的速度小。8.2原理與基本概念原理：8.2原理與基本概念95離子交換層析課件96離子交換層析課件97層析分類

流動相與固定相固定相的形狀壓力流動相的流動方向分離操作方式分配機理

層析分類流動相與固定相981.流動相與固定相根據(jù)流動相的相狀態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法；固定相為液體的分配層析法、固定相為固體的吸附層析法以及固定相為固定于固體表面的液體薄層(以固體為載體)的分配層析法等。層析分類

1.流動相與固定相層析分類992.固定相的形狀根據(jù)固定相或?qū)游鲅b置形狀的不同，液相層析法又分紙層析法、薄層層析法和柱層析法紙層析和薄層層析多用于分析目的，而柱層析易于放大，適用于大量制備分離，是主要的層析分離手段。

層析分類

2.固定相的形狀層析分類1003.壓力在以固體為固定相的液相柱層析中，根據(jù)操作壓力的不同，分為低壓(壓力一般小于0.5MPa)、中壓(壓力為0.5～4.OMPa)和高壓(壓力為4.0～40MPa)液相層析法；高壓液相層析法中層析介質(zhì)(固定相)微細，分離精度高、速度快，主要用于成分分析。大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法。層析分類

3.壓力層析分類1014.流動相的流動方向軸向流層析；徑向流層析：溶質(zhì)在半徑方向上得到分離，優(yōu)點是規(guī)模放大時，半徑不變，通過增加柱高提高處理能力，且壓降不會增加，適于大規(guī)模；但造價高。層析分類

4.流動相的流動方向?qū)游龇诸?025.分離操作方式

洗脫展開(elutiondevelopment)迎頭分析(frontanalysis)頂替展開

(Elutionchromatography)

層析分類

5.分離操作方式層析分類103層析分類

5.分離操作方式：洗脫展開降樣品盡量濃縮，引入色譜柱上部，用溶劑洗脫（溶劑與固定相無親和力），依親和力的大小而速度不同，前進靠溶劑的推動。層析分類5.分離操作方式：洗脫展開104層析分類

5.分離操作方式：洗脫展開恒定洗脫法：不改變洗脫劑組成，優(yōu)點是操作簡單，不需要較復(fù)雜的設(shè)備；但洗脫劑組成需實驗確定，太弱的洗脫劑不能有效洗脫，太強的洗脫劑，分辨率較差。逐次洗脫法：洗脫劑組成至少改變一次，優(yōu)點是操作簡單，重現(xiàn)性好，但洗脫條件一次改變后，有些組分會共同洗下，影響分離效果。梯度洗脫：逐次改變洗脫劑的組成，優(yōu)點是消除重疊峰現(xiàn)象，但洗脫體積過大，組分濃度變稀。層析分類5.分離操作方式：洗脫展開1055.分離操作方式：迎頭分析又稱前流，前沿分析法，將待分離的混合物不斷輸入柱中，讓它一直流下去，直到過程結(jié)束。親和力小的先流出，一般不能達到組分的分離，只有作用力最弱的組分為純品。適于除痕量雜質(zhì)，組分濃度不會被稀釋。層析分類

CABA+B5.分離操作方式：迎頭分析層析分類CABA+B1065.分離操作方式:頂替展開又稱置換，排代展開，利用一種與固定相作用力極強的置換劑作流動相，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。優(yōu)點是濃縮，單位柱長固定相的利用率最高。但各組分一個連一個的流出，界線不明，分離不理想；合適的置換劑不易找到。層析分類

DABD：置換劑5.分離操作方式:頂替展開層析分類DABD：置換劑1076.分配機理凝膠過濾層析、離子交換層析、反相層析；疏水性相互作用層析和親和層析等。層析分類

6.分配機理層析分類108基本概念

1.分配系數(shù)：kd＝q/c2.阻滯因數(shù)Rf：溶質(zhì)的遷移速率與一理想標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（既不吸附也不溶解）的移動速率之比，移動長度一樣時：tm，

ts：理想物質(zhì)和溶質(zhì)的消耗時間tR：保留時間基本概念1.分配系數(shù)：kd＝q/ctm，ts：理想物質(zhì)109基本概念

2.阻滯因數(shù)Rf：基本概念2.阻滯因數(shù)Rf：110基本概念

3.洗脫體積VR：溶質(zhì)達最大濃度時，已流出的流動相體積，VR＝Vm＋kdVs滯留時間：溶質(zhì)流出色譜柱所需的時間tR＝VR/Qet0＝Vm/QeQe:洗脫劑的流量t0：死時間基本概念3.洗脫體積VR：溶質(zhì)達最大濃度時，已流出的流動111基本概念

4.容量因子k：是固定相和流動相溶質(zhì)數(shù)量之比容量因子是吸附劑對溶質(zhì)親和力的量度，k越低，從柱中流出的越早基本概念4.容量因子k：是固定相和流動相溶質(zhì)數(shù)量之比容量112基本概念

5.選擇性α：α＝kd1/kd26.分離度（分辨率）Rs：表達兩種洗脫曲線相鄰的溶質(zhì)相互分離的程度。為提高溶質(zhì)之間的分離度，可以采用增大峰間距離或降低峰寬的方法?；靖拍?.選擇性α：113分離度

分離度114層析過程理論基礎(chǔ)

平衡模型：假定不存在傳質(zhì)阻力，分配平衡瞬間完成。理論板模型：認為分配平衡不能瞬間完成，需一定柱高，即一個理論板。適合低濃度料液，不能確定層析柱分離性能的影響因素。軸向擴散模型：假定每一截面有均勻徑向濃度；每一截面及流動方向上，流體速率與軸向擴散系數(shù)均為定值；溶質(zhì)濃度為流動距離的連續(xù)函數(shù)。

層析過程理論基礎(chǔ)平衡模型：假定不存在傳質(zhì)阻力，分配平衡瞬間115原理與操作

凝膠過濾介質(zhì)

影響分離特性的因素

應(yīng)用

特點

8.3層析方法介紹㈠凝膠過濾層析原理與操作8.3層析方法介紹㈠凝膠過濾層析116凝膠層析（gelchromatography）又稱為凝膠排阻層析（gelexclusionchromatography）、分子篩層析（molecularsievechromatography）、凝膠過濾（gelfiltration）、凝膠滲透層析（gelpermeationchromatography）等。

8.3層析方法介紹㈠凝膠過濾層析凝膠層析（gelchromatography）又稱為凝膠排117原理與操作凝膠過濾層析(GFC)利用凝膠粒子為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進行分離的液相層析法；GFC操作中溶質(zhì)的分配系數(shù)m只是溶質(zhì)相對分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu)(孔徑分布)的函數(shù)，與所用洗脫液的pH值和離子強度等物性無關(guān)。原理與操作凝膠過濾層析(GFC)利用凝膠粒子為固定相，根據(jù)料118離子交換層析課件119原理與操作限定條件下，Vt，V0一定，Ve隨分離物質(zhì)分子量變化而變化，分子量增加，分配系數(shù)降低。兩種溶質(zhì)，kav差異大，分離效果好。原理與操作限定條件下，Vt，V0一定，Ve隨分離物質(zhì)分子量變120凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；穩(wěn)定性強，在較寬的pH和離子強度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長；具有一定的孔徑分布范圍；機械強度高，允許較高的操作壓力(流速)。凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：121凝膠過濾介質(zhì)常用的凝膠過濾介質(zhì)

凝膠過濾介質(zhì)常用的凝膠過濾介質(zhì)122凝膠過濾介質(zhì)凝膠特性參數(shù)排阻極限(exclusionlimit)分級范圍(fractionationrange)溶脹率：每g干凝膠吸收水分的百分數(shù)凝膠粒徑床體積：1g干凝膠溶脹后占的體積空隙體積：凝膠之間空隙所占的體積，用2000kD的藍色葡聚糖測定。凝膠過濾介質(zhì)凝膠特性參數(shù)123離子交換層析課件124凝膠過濾操作凝膠用量計算和處理：床體積/膨脹度；5～10倍蒸餾水浸泡懸浮除小顆粒0.5MNaOH~0.5MNaCl室溫浸泡0.5h洗至中性層析柱選擇：1：25～1：100，夾套控溫裝柱，凝膠柱鑒定（藍，紅葡聚糖）上樣：（少，分辨率高），洗脫：（單一緩沖液），再生：(水反復(fù)逆相沖洗，緩沖液平衡）保存：洗凈，適量防酶劑，酒精，冰箱。凝膠過濾操作凝膠用量計算和處理：床體積/膨脹度；5～10倍蒸125影響分離特性的因素線速度料液體積料液濃度：過高，洗脫曲線不規(guī)則，粘度分子量與分配系數(shù)的關(guān)系凝膠粒徑影響分離特性的因素線速度126線速度影響分離特性的因素線速度影響分離特性的因素127影響分離特性的因素料液體積影響分離特性的因素料液體積128影響分離特性的因素分子量與分配系數(shù)的關(guān)系：選擇分級范圍小的介質(zhì)，利于提高分離度影響分離特性的因素分子量與分配系數(shù)的關(guān)系：選擇分級范圍小的介129應(yīng)用分離純化脫鹽相對分子質(zhì)量的測定

應(yīng)用分離純化130凝膠過濾特點GFC的優(yōu)點如下：溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近100％；每批分離操作結(jié)束后不需要進行介質(zhì)的清洗或再生，故容易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度高；質(zhì)活性收率高；分離機理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。

凝膠過濾特點GFC的優(yōu)點如下：131GFC的不足之處在于：僅根據(jù)溶質(zhì)之間分子量的差別進行分離，選擇性低，料液處理量?。唤?jīng)GFC洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋，因此需要在具有濃縮作用的單元操作(如超濾、離子交換和親和層析等)后使用。

凝膠過濾特點GFC的不足之處在于：凝膠過濾特點132原理與操作IEC的應(yīng)用特點㈡

離子交換層析8.3層析方法介紹原理與操作㈡離子交換層析8.3層析方法介紹133原理與操作離子交換層析(Ionexchangechromatography，IEC)利用離子交換劑為固定相，是根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進行溶質(zhì)分離的洗脫層析法；陰離子交換基有DEAE，QAE；陽離子交換基為CM，P和SP。常用于制備離子交換劑的介質(zhì)有Sephadex、Sepharose、TSKgelPW、Bio—Gel和纖維素等。㈡

離子交換層析原理與操作㈡離子交換層析134洗脫時采用流動相離子強度線性增大的線性梯度洗脫法(lineargradiente1ution)或離子強度階躍增大的逐次洗脫法(stepwiseelution)。小型層析柱的實驗數(shù)據(jù)一般不能直接用于規(guī)模放大，而必須實施必要的探索性實驗。

㈡

離子交換層析洗脫時采用流動相離子強度線性增大的線性梯度洗脫法(linea135荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示：其中I為流動相的離子強度，A和B為常數(shù)，m∞為離子強度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。對于不同的溶質(zhì)，式中的常數(shù)A和B不同，即在離子交換劑上的分配行為不同，因此在洗脫過程中彼此之間得到分離。㈡

離子交換層析荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)可用下式表示：㈡離子交136線性梯度洗脫過程中，流動相的離子強度線性增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)連續(xù)降低，移動速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì)在較小的流動相體積下洗脫。顯然，通過改變流動相離子強度的增大速度(即濃度梯度)，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，即溶質(zhì)洗脫峰之間的距離，在改善分離度的同時縮短洗脫時間。㈡

離子交換層析線性梯度洗脫過程中，流動相的離子強度線性增大，因此溶137離子交換層析課件138

逐次洗脫過程中，流動相的離子強度階躍增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低和移動速度的增大也是階段式的。如果流動相離子強度的階躍速度很快，逐次洗脫就接近了線性梯度洗脫；反之則接近恒定洗脫。因此逐次洗脫是介于恒定洗脫與線性梯度洗脫之間的一種洗脫法。

㈡

離子交換層析逐次洗脫過程中，流動相的離子強度階躍增大，因此溶質(zhì)的分139在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程，IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。層析操作多采用線性梯度洗脫法或逐次沉脫法，只是流動相組成的變化情況各不相同。

㈡

離子交換層析在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程，IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部140IEC的應(yīng)用IEC是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。這主要是由于IEC基于離子交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，不僅具有通用性，而且選擇性遠高于GFC。

㈡

離子交換層析IEC的應(yīng)用㈡離子交換層析141特點料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；應(yīng)用范圍廣泛，通過優(yōu)化操作條件可大幅提高分離的選擇性，所需柱長較短；產(chǎn)品回收率高；商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格也遠低于親和吸附劑。㈡

離子交換層析特點㈡離子交換層析142原理疏水性吸附劑操作特點㈢疏水層析8.3層析方法介紹原理㈢疏水層析8.3層析方法介紹143原理硫水性相互作用層析(HIC)利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(疏水性配基)的疏水性吸附劑為固定相，是根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法蛋白質(zhì)的吸附(進料)需在高濃度鹽溶液中進行，洗脫則主要采用降低流動相離子強度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。㈢疏水層析原理㈢疏水層析144疏水性吸附劑疏水性吸附作用與配基的硫水性(疏水鏈長度)和配基密度成正比；配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異；疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用介于氨苯的結(jié)合或醚鍵結(jié)合，形成各種疏水性吸附劑。㈢疏水層析疏水性吸附劑㈢疏水層析145常用商品化疏水吸附劑常用商品化疏水吸附劑146常用疏水吸附劑結(jié)構(gòu)常用疏水吸附劑結(jié)構(gòu)147HIC操作

影響疏水性吸附的因素離子強度及種類破壞水化作用的物質(zhì)表面活性劑溫度㈢疏水層析HIC操作㈢疏水層析148蛋白質(zhì)的分離

HIC不僅是一種有效的分離純化手段，而且還可與IEC互補短長，分離純化利用IEC難于分離的蛋白質(zhì)。在利用HIC分離蛋白質(zhì)的混合物時，需事先利用各種小型預(yù)裝柱進行吸附與洗脫實驗，確定最佳吸附劑和洗脫分離溶劑。

㈢疏水層析蛋白質(zhì)的分離㈢疏水層析149HIC的特點由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此HIC可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液；可通過調(diào)節(jié)疏水配基鏈長和密度調(diào)節(jié)吸附力，并根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑；疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價格與離子交換劑相當(dāng)。㈢疏水層析HIC的特點㈢疏水層析150反相層析(Reversed-phasechromatography，RPC)利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機溶劑的水溶液為流動相，是根據(jù)溶質(zhì)極性(疏水性)的差別進行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法；用于相對分子質(zhì)量低于5000，特別是l000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。

㈣反相層析8.3層析方法介紹反相層析(Reversed-phasechromatogr151溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大；當(dāng)固定相一定時，可通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)、流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大；可采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。

㈣反相層析溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大152反相介質(zhì)中最具代表性的是以硅膠為載體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表面鍵合非極性分子層制備。

㈣反相層析反相介質(zhì)中最具代表性的是以硅膠為載體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表153超臨界流體層析(Supercriticalfluidchromatography，SFC)是利用超臨界流體為流動相的洗脫層析法；利用超臨界流體作為流動相參與溶質(zhì)在固定相上的分配，可提高溶質(zhì)在固定相中的擴散速率，提高分離速度和柱效；SFC常采用增大壓力的壓力梯度洗脫法，也可采用改變?nèi)軇舛龋O性）的濃度梯度洗脫法。

㈤超臨界流體層析超臨界流體層析(Supercriticalfluidch154離子交換層析課件155離子交換層析課件156

羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是一種磷酸鈣晶體，吸附主要基于鈣離子和磷酸根離子的靜電引力；HAP層析通常以磷酸鹽緩沖液為流動相，采用提高鹽濃度的線性梯度脫法；用于識別DNA及RNA的單鏈和雙鏈，分離IEC和HIC難于分離的蛋白質(zhì)等物系；HAP吸附劑價格便宜，遠低于離子交換劑，適用于大規(guī)模分離純化過程，已成為單克隆抗體的主要純化手段。㈥羥基磷灰石層析羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)是一種磷157原理與操作

親和吸附介質(zhì)親和層析過程

應(yīng)用㈦親和層析原理與操作㈦親和層析158親和作用體系

特異性親和體系高特異性

群特異性抗原-單克隆抗體荷爾蒙-受體蛋白核酸-互補堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋