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§五高效液相色譜分析高效液相色譜法的出現(xiàn)、儀器及特點(diǎn)
高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu)
高效液相色譜基本原理
高效液相色譜固定相和流動(dòng)相
高效液相色譜梯度洗脫技術(shù)
高效液相色譜類型簡(jiǎn)介
§五高效液相色譜分析高效液相色譜法的出現(xiàn)、儀器及特點(diǎn)1高效液相色譜法的出現(xiàn)由于氣相色譜只能分析M<1000、低沸點(diǎn)、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的組分;對(duì)于M>1000、高沸點(diǎn)、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定差的樣品就無(wú)能為力了,隨著工業(yè)生產(chǎn)的需要,高效液相色譜的研究成為一個(gè)迫切課題。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相,稱為經(jīng)典液相色譜法,此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)(常有幾個(gè)小時(shí))。在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上,于60年代后期,氣相色譜理論迅速發(fā)展以及高壓泵的研制成功,為高效液相色譜的發(fā)展奠定了基礎(chǔ),高效液相色譜又稱高壓液相色譜法(HPLC),也稱現(xiàn)代液相色譜。Stein和Moore獲得了1972年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(研制出氨基酸分析儀)返回高效液相色譜法的出現(xiàn)由于氣相色譜只能分析M<1000、低沸點(diǎn)2高效液相色譜儀舉例高效液相色譜儀舉例3高效液相色譜-課件4高效液相色譜-課件5高效液相色譜-課件6高效液相色譜法的特點(diǎn)與經(jīng)典液相色譜比較(四高)
:高壓:壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。高速:流速為0.1~10.0mL/min。高效:可達(dá)5000塊塔板/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度:紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng(1ng=109g)。同時(shí)消耗樣品少。如用Lichrosorb-ODS色譜柱,采用梯度洗脫,可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分.高效液相色譜法的特點(diǎn)與經(jīng)典液相色譜比較(四高):7與氣相色譜相比
高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)化合物及生化試樣的高效分離分析方法。(l)氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物,它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20%。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80%的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì),目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。(2)氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體,它對(duì)組分沒(méi)有親和力,即不產(chǎn)生相互作用力,僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體,選擇余地大,它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力,并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)。因此,流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用,相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù),這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。
(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的,而高效液相色譜法則經(jīng)??稍谑覝貤l件下工作。與氣相色譜相比高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)化合物及生8§5-2高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu)
色譜儀器的流程由液體流動(dòng)相的輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、信號(hào)放大記錄系統(tǒng)組成,其中高壓泵、色譜柱和檢測(cè)系統(tǒng)是高效液相色譜的主要部件。
返回§5-2高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu)色譜儀器的流9輸液系統(tǒng)包括流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶、過(guò)濾器、脫氣裝置、高壓泵、壓力脈動(dòng)阻尼器、梯度洗脫裝置等部件組成
返回輸液系統(tǒng)包括流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶、過(guò)濾器、脫氣裝置、高壓泵、壓力脈動(dòng)10脫氣裝置
脫氣就是驅(qū)除溶解在溶劑中的氣體。(1)脫氣是為了防止流動(dòng)相從高壓柱內(nèi)流出時(shí),釋放出氣泡。這些氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)使噪聲劇增,甚至不能正常檢測(cè)。(2)溶解氧會(huì)與某些流動(dòng)相與固定相作用,破壞它們的正常功能。對(duì)水及極性溶劑的脫氣尤為重要,因?yàn)檠踉谄渲械娜芙舛容^大。
常用的脫氣方法有:低壓脫氣法:電磁攪拌、水泵抽空,可同時(shí)加溫或向溶劑吹氮。由于抽空或加熱過(guò)程中可能引起流動(dòng)相中低沸點(diǎn)溶劑的揮發(fā)而影響其組成,此法不適于二元以上溶劑組成的流動(dòng)相脫氣。吹氦脫氣法:氦氣經(jīng)由一圓筒過(guò)濾器通入沖洗劑中,在0.5公斤/厘米壓力下保持10~15分鐘,氦氣的小氣泡可將溶于流動(dòng)相中的空氣帶出,此法簡(jiǎn)單方便,適用于所有沖洗劑脫氣,但由于氦氣價(jià)格昂貴,在國(guó)內(nèi)尚難于普及。超聲波脫氣法:將溶劑儲(chǔ)液瓶置于超聲波清洗槽中,以水為介質(zhì)超聲脫氣。一般500ml溶劑約需超聲20~30min即可達(dá)到驅(qū)氣目的。此法方便,不影響溶劑組成,并適用于各種溶劑,目前國(guó)內(nèi)使用較為普遍。返回脫氣裝置脫氣就是驅(qū)除溶解在溶劑中的氣體。(11高壓泵
目前高效液相色譜使用的高壓泵分為恒壓和恒流泵,恒流泵使輸出的液體流量穩(wěn)定,而恒壓泵則使輸出的液體壓力穩(wěn)定。恒流泵中有往復(fù)泵、累積型往復(fù)泵、注射泵,恒壓泵有氣動(dòng)放大泵。各種高壓泵均具有以下性能:(1)泵體材料能耐化學(xué)腐蝕。通常使用普通耐酸不銹鋼或優(yōu)質(zhì)耐酸不銹鋼。(2)能在高壓下連續(xù)上作。通常要求耐壓40~50MPa·cm-2,能在8~24h連續(xù)上作,壓力平穩(wěn)。(3)輸出流量范圍寬。一般在0.01~10mL/min。(4)輸出流量穩(wěn)定可調(diào)。高效液相色譜使用的檢測(cè)器,大多數(shù)對(duì)流量變化敏感,高壓輸液泵應(yīng)提供無(wú)脈沖流量。這樣可以降低基線噪聲并獲較好的檢測(cè)下限,流量控制的精密度應(yīng)小于1%,最好為0.5%,重復(fù)性最好為0.5%。返回高壓泵目前高效液相色譜使用的高壓12往復(fù)泵往復(fù)泵有兩類,一種是活塞式,另一種是隔膜式
形成脈沖式供液
返回往復(fù)泵往復(fù)泵有兩類,一種是活塞式,另一種是隔膜式形成脈沖式13累積型往復(fù)泵
累積型往復(fù)泵有兩個(gè)泵頭,以串聯(lián)方式連接在一起,這樣可以提供平穩(wěn)的液流。所以如此是因?yàn)閮杉?jí)泵腔排液體積不同,第一級(jí)泵腔是第二級(jí)泵控的一倍1-高壓流動(dòng)相出口;2-二級(jí)活塞;3-一級(jí)活塞;4-流動(dòng)相
返回累積型往復(fù)泵累積型往復(fù)泵有兩個(gè)泵頭,以串聯(lián)14注射泵
注射泵類似于注射器,用一臺(tái)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)注射泵的活塞把液流從泵腔中擠出.泵腔體積較大(250~500mL),密封性好的活塞把泵腔中的液體等速流出.
1-電機(jī);2-渦輪;3-螺旋;4-螺桿;5-活塞;6-至色譜柱返回注射泵注射泵類似于注射器,用一臺(tái)步進(jìn)15氣動(dòng)放大泵
氣動(dòng)放大泵是利用氣體為動(dòng)力源。適合于液相色譜柱的裝填,近代的液相色譜儀不用這種泵。
1-接色譜柱;2-流動(dòng)相入口;3-高壓氣入口;4-氣體放空
返回氣動(dòng)放大泵氣動(dòng)放大泵是利用氣體為動(dòng)力源。16梯度洗脫裝置外梯度:將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入混合室,用高壓輸液泵混合液輸入色譜柱。梯度洗脫裝置外梯度:將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入混17內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性18進(jìn)樣系統(tǒng)通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置和自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)。分部分進(jìn)樣和整體進(jìn)樣。返回進(jìn)樣系統(tǒng)通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置19自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)20分離系統(tǒng)-色譜柱柱材料及規(guī)格柱連接方式柱溫控制柱填充技術(shù)返回分離系統(tǒng)-色譜柱柱材料及規(guī)格返回21柱材料及規(guī)格
柱體為直型不銹鋼管,內(nèi)徑1~6mm,柱長(zhǎng)10~50cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑提高柱效。采用直形柱管,標(biāo)準(zhǔn)填充柱柱管內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm,長(zhǎng)10~50cm,填料粒度5~10μm時(shí),柱效達(dá)5000~10000塊/m理論塔板數(shù)。返回柱材料及規(guī)格柱體為直型不銹鋼管,內(nèi)徑1~6m22柱連接方式
柱接頭通過(guò)過(guò)濾片與色譜柱管連接。在色譜柱管的上下兩端要安裝過(guò)濾片,過(guò)濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料,此燒結(jié)片上的孔徑小于填料顆粒直徑,卻可讓流動(dòng)相順利通過(guò),并可阻擋流動(dòng)相中的極小的機(jī)械雜質(zhì)以保護(hù)色譜柱。
返回柱連接方式返回23柱溫控制以下幾種情況需精確控制柱溫:(1)在一些法定標(biāo)準(zhǔn)分析方法中,要求保留時(shí)間具有再現(xiàn)性。(2)必須通過(guò)改變柱溫來(lái)提高分離效率。(3)對(duì)高分子化合物或粘度大的樣品,柱溫必須高于室溫。(4)具有生物活性的生物分子,要求分析時(shí)柱溫應(yīng)低于室溫。(5)對(duì)某些組成復(fù)雜的樣品,在單一色譜柱不能實(shí)現(xiàn)完全分離,需要使用二維色譜技術(shù),利用柱切換,使兩根色譜柱在不同柱溫下操作,以實(shí)現(xiàn)多組分的完全分離。返回柱溫控制以下幾種情況需精確控制柱溫:返回24柱填充技術(shù)
填充色譜柱的方法,根據(jù)固定相微粒的大小有干法和濕法兩種。微粒大于20μm的可用干法填充,要邊填充邊敲打和震動(dòng),要填得均勻扎實(shí)。直徑10μm以下的微粒,不能用干法填充,必須采用濕法。干法裝柱與氣相色譜法相似。濕法裝柱又稱等密度勻槳裝填法。
返回柱填充技術(shù)填充色譜柱的方法,根據(jù)固定相微粒的大小有干法和濕25濕法裝柱常用對(duì)二氧六環(huán)和四氯化碳,或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶劑,根據(jù)固定相的密度不同,采用不同的溶劑比例,配成密度與固定相相似的混合液為勻漿劑。
1-頂替液槽;2-高壓泵;3-壓力表;4-三通閥;5-勻漿罐;6-色譜柱;7-廢液槽返回濕法裝柱常用對(duì)二氧六環(huán)和四氯化碳,或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶劑26檢測(cè)系統(tǒng)
高效液相色譜檢測(cè)器按適用性分為選擇性檢測(cè)器和通用型檢測(cè)器。
紫外和紫外-可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器
電化學(xué)檢測(cè)器
返回檢測(cè)系統(tǒng)高效液相色譜檢測(cè)器按適用性分為選擇性檢27紫外和紫外-可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器
檢測(cè)原理:紫外及紫外—可見(jiàn)光吸收光度檢測(cè)器相當(dāng)于一臺(tái)吸收光度計(jì),在高效液相色譜儀的流通池內(nèi)樣品的濃度與吸光度的關(guān)系遵循Beer定律:A=log(I0/I)=εbc式中:A為吸光度,I0為入射光強(qiáng)度,I為透射光強(qiáng)度,ε是樣品的摩爾吸光度,b為流通池的光程長(zhǎng)度,c為樣品濃度。
紫外和紫外-可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器檢測(cè)原理:28示差折光檢測(cè)器
檢測(cè)器原理:示差折光檢測(cè)器是通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)流動(dòng)相的折光指數(shù)變化來(lái)測(cè)定樣品的濃度。各種物質(zhì)都具有不同的折射率,溶液的折射率是溶劑(洗脫劑)和溶質(zhì)(待測(cè)組分)各自的折射率乘以各自的摩爾濃度之和。設(shè)溶液的折射率為n,則:式中c1和c2為溶劑和溶質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù),c1+c2=1;n1和n2為溶劑和溶質(zhì)的折光指數(shù)。示差折光檢測(cè)器檢測(cè)器原理:29
熒光檢測(cè)器
檢測(cè)原理:當(dāng)某些溶液受紫外光照射后,能吸收紫外光線而處于不穩(wěn)定的激發(fā)狀態(tài),緊接著輻射出比紫外光波更長(zhǎng)的光線,即熒光。在被測(cè)溶質(zhì)濃度較低時(shí),溶質(zhì)受激發(fā)而發(fā)生的熒光強(qiáng)度與被測(cè)溶質(zhì)的濃度成正比關(guān)系。熒光檢測(cè)器檢測(cè)原理:30儀器結(jié)構(gòu)
高靈敏度、高選擇性;對(duì)多環(huán)芳烴,維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng);返回儀器結(jié)構(gòu)高靈敏度、高選擇性;返回31電化學(xué)檢測(cè)器
電化學(xué)檢測(cè)器是根據(jù)電化學(xué)分析方法而設(shè)計(jì)的檢測(cè)器。主要有兩種類型:一種是根據(jù)溶液的導(dǎo)電性質(zhì),通過(guò)測(cè)定流經(jīng)檢測(cè)器的離子溶液電導(dǎo)率的大小來(lái)測(cè)量離子濃度,此類檢測(cè)器是高效離子色譜采用的主要檢測(cè)器;另一類是根據(jù)化合物在電解池中工作電極上發(fā)生的氧化-還原反應(yīng),通過(guò)測(cè)量電位、電流和電量來(lái)確定化合物在溶液中的濃度。
返回電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器是根據(jù)電化學(xué)分析方法而設(shè)計(jì)的檢測(cè)器32§5-3高效液相色譜基本原理表征液相色譜柱填充性能的重要參數(shù)
總孔率、柱壓力降和柱滲透率高效液相色譜塔板理論高效液相色譜的速率理論返回§5-3高效液相色譜基本原理表征液相色譜柱填充性能的重要參數(shù)33總孔率式中:F—流動(dòng)相的體積流速,cm3/s;u—流動(dòng)相的平均線速,cm/s;r一柱內(nèi)徑的半徑,cm;tM—柱的死時(shí)間;L—柱長(zhǎng),cm;V—色譜柱的空體積,cm3。εT表達(dá)了色譜柱填料的多孔性能,當(dāng)使用全多孔硅膠固定相時(shí),εT約為0.85,使用非多孔的玻璃微珠(或硅膠)固定相時(shí),εT約為0.40,可認(rèn)為是柱中顆粒之間的孔率,用ε表示。返回總孔率式中:F—流動(dòng)相的體積流速,cm3/s;返回34柱壓力降式中η一流動(dòng)相的粘度,MPa·s;k0—色譜柱的比滲透系數(shù);dp—固定相顆較直徑,μm;φ—色譜柱的阻抗因子;P1、P0—色譜柱的入口壓力和出口壓力,MPa。
返回柱壓力降式中η一流動(dòng)相的粘度,MPa·s;返回35柱滲透率柱滲透率KF:表示流動(dòng)相通過(guò)柱子的難易程度。在高效液相色譜法中,由于使用液體流動(dòng)相,其粘度大于氣體流動(dòng)相,且固定相粒度又小,為保證柱子在較低壓力下正常操作,總希望柱滲透率要大。
返回柱滲透率柱滲透率KF:表示流動(dòng)相通過(guò)柱子的難易程度。在高效36高效液相色譜的速率理論其中:Cd為填充系數(shù),為一常數(shù);Cm是容量因子k的函數(shù),為一常數(shù),其值取決于柱直徑、形狀和填充狀況,當(dāng)柱填充均勻緊密時(shí),其值下降;Csm是與固定相顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)以及容量因子k有關(guān),為一常數(shù);Cs是與容量因子k有關(guān)的常數(shù);Dm為組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù),比氣相擴(kuò)散系數(shù)小4~5個(gè)數(shù)量級(jí);Ds為組分分子在固定液內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù);返回高效液相色譜的速率理論其中:Cd為填充系數(shù),為一常數(shù);返回37§5-4高效液相色譜流動(dòng)相
一、液相色譜的流動(dòng)相流動(dòng)相特性流動(dòng)相類別流動(dòng)相選擇選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題返回§5-4高效液相色譜流動(dòng)相一、液相色譜的流動(dòng)相返回38(1)液相色譜的流動(dòng)相又稱為:淋洗液,洗脫劑。流動(dòng)相組成改變,極性改變,可顯著改變組分分離狀況。(2)親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相,即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性,稱為正相液-液色譜法,極性柱也稱正相柱。(3)若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性,則稱為反相液-液色譜,非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。流動(dòng)相的特性返回(1)液相色譜的流動(dòng)相又稱為:淋洗液,洗脫劑。流動(dòng)39流動(dòng)相類別
按流動(dòng)相組成分:?jiǎn)谓M分和多組分;按極性分:極性、弱極性、非極性;按使用方式分:等度淋洗和梯度淋洗。
常用溶劑:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性,以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分:?jiǎn)谓M分和多組分;40流動(dòng)相選擇
在選擇溶劑時(shí),溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí):首先選擇中等極性溶劑,若組分的保留時(shí)間太短,降低溶劑極性,反之增加。也可在低極性溶劑中,逐漸增加其中的極性溶劑,使保留時(shí)間縮短。常用溶劑的極性順序:水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)返回流動(dòng)相選擇在選擇溶劑時(shí),溶劑的極性是選擇的41選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題(1)盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相,防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。(2)避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失;酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。(3)試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度,防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。(4)流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí),流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。返回選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題(1)盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相42§5-5高效液相色譜梯度洗脫技術(shù)一、單一洗脫劑:二、等度洗脫:流動(dòng)相的k值恒定三、梯度洗脫:改變流動(dòng)相的k值梯度變化速率梯度范圍返回§5-5高效液相色譜梯度洗脫技術(shù)一、單一洗脫劑:返回43等度洗脫返回等度洗脫返回44梯度變化速率返回梯度變化速率返回45梯度范圍是指兩種流動(dòng)相起止百分比之差。如(起)80%水:20%甲醇~20%水:80%甲醇(止)初始的試探性實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行一次全范圍梯度(即5—100%B)。B是指甲醇或乙腈等。返回梯度范圍是指兩種流動(dòng)相起止百分比之差。返回46§5-6高效液相色譜類型簡(jiǎn)介液-固吸附色譜液-液分配色譜
離子交換色譜
離子色譜
排阻色譜親和色譜高效液相色譜分離方法的選擇返回§5-6高效液相色譜類型簡(jiǎn)介液-固吸附色譜返回47液-固吸附色譜
固定相:固體吸附劑為,如硅膠、氧化鋁等,較常使用的是5~10μm的硅膠吸附劑;
流動(dòng)相:各種不同極性的一元或多元溶劑。
基本原理:組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸;
適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣,對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。
缺點(diǎn):非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。返回液-固吸附色譜固定相:固體吸附劑為,如硅膠48液-液分配色譜
固定相與流動(dòng)相均為液體(互不相溶);
基本原理:組分在固定相和流動(dòng)相上的分配;
流動(dòng)相:對(duì)于親水性固定液,采用疏水性流動(dòng)相,即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性(正相色譜),反之,流動(dòng)相的極性大于固定液的極性(反相色譜)。正相與反相的出峰順序相反;
固定相:早期涂漬固定液,固定液流失較多,較少采用;
化學(xué)鍵合固定相:(將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠(擔(dān)體)表面的游離羥基上。C-18柱(反相柱)。返回液-液分配色譜固定相與流動(dòng)相均為液體(互不相49正相高效液相色譜正相高效液相色譜是指以親水性的填料作固定相(如在硅膠上鍵合羥基、氨基或氰基的極性固定相),以疏水性溶劑或混合物作流動(dòng)相(如己烷)的液相色譜。在液相色譜發(fā)展的早期,類似于氣相色譜把含羥基、氨基或氰基的極性固定相涂漬在硅膠上這樣容易被流動(dòng)相沖洗掉,現(xiàn)在幾乎都使用鍵合固定相了。
返回正相高效液相色譜正相高效液相色譜是指以親水性的50反相高效液相色譜反相高效液相色譜是指以強(qiáng)疏水性的填料作固定相、以可以和水混溶的有機(jī)溶劑做流動(dòng)相的液相色譜。如在硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相,以極性強(qiáng)的水、甲醇、乙腈作流動(dòng)相的高效液相色譜。返回反相高效液相色譜反相高效液相色譜是指以強(qiáng)疏水51時(shí)間,min固定相:C1固定相:C8固定相:C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶;2-苯酚;3-乙酰苯;4-硝基苯;5-苯甲酸甲酯;6-甲苯可見(jiàn):反相鍵合色譜中,鍵合相碳鏈越長(zhǎng),分離效果越好。返回時(shí)間,min固定相:C1固定相:C8固定相:C18硅膠-烷基52正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性:A>B>C返回正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正相色譜低極性流動(dòng)相反相色53
化學(xué)鍵合固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑,具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理既不是簡(jiǎn)單的吸附,也不是單一的液液分配,而是二者兼而有之?;瘜W(xué)鍵合的表面覆蓋度決定哪種機(jī)理起主要作用。對(duì)多數(shù)鍵合相來(lái)說(shuō),以分配機(jī)理為主。通常,化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠(表面有硅醇基):Si-O-R:對(duì)熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解,使酯鏈斷裂,因此只適于以不含水或醇的流動(dòng)相。Si-R(或Si-N):不水解,熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動(dòng)相時(shí),其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R:不水解,熱穩(wěn)定性好,在pH2-8范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定?;瘜W(xué)鍵合固定相返回化學(xué)鍵合固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體54離子交換色譜
固定相:陰離子離子交換樹脂或陽(yáng)離子離子交換樹脂;
流動(dòng)相:陰離子離子交換樹脂作固定相,采用酸性水溶液;陽(yáng)離子離子交換樹脂作固定相,采用堿性水溶液;
基本原理:組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng);組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大,保留時(shí)間長(zhǎng);陽(yáng)離子交換:R—SO3H+M+=R—SO3M+H+
陰離子交換:R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-
應(yīng)用:離子及可離解的化合物,氨基酸、核酸等。返回離子交換色譜固定相:陰離子離子交換樹脂或陽(yáng)離55固定相按固定相制作方法可分為:多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型);表面多孔型(包括薄膜型)離子交換樹脂;離子交換鍵合型。固定相按固定相制作方法可分為:56流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強(qiáng)度)
,通過(guò)改變pH、緩沖劑類型、離子強(qiáng)度、加入有機(jī)試劑和配位劑等條件來(lái)控制分配比k,改變交換劑的選擇性,進(jìn)而影響樣品待測(cè)物的分離。返回流動(dòng)相離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類緩沖溶液(有57離子色譜
離子色譜(IC)是70年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原理一樣,只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。但由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì),其電導(dǎo)率比待測(cè)離子約高2個(gè)數(shù)量級(jí),這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待測(cè)離子信號(hào)。為解決此問(wèn)題,1975年Small提出,在離子交換柱之后,再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱,使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動(dòng)相,從而可用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子的含量。該法的不足之處在于:抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過(guò)抑制柱后會(huì)展寬,降低分離度。因此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液(如苯甲酸鹽稀溶液)作流動(dòng)相。返回離子色譜離子色譜(IC)是70年代發(fā)展的新方法。58排阻色譜固定相:凝膠(具有一定大小孔隙分布)
原理:按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙,由其中通過(guò),出峰最慢;中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙,中速通過(guò);而大分子被排斥在外,出峰最快;溶劑分子小,故在最后出峰。全部在死體積前出峰;可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100~105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。
返回排阻色譜固定相:凝膠(具有一定大小孔隙分布)59固定相返回固定相返回60親和色譜
原理:利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力,進(jìn)行選擇性分離。
先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等),再連接上配基(酶、抗原等),這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。返回親和色譜原理:利用生物大分子和固定相表面存在61高效液相色譜分離方法的選擇返回高效液相色譜分離方法的選擇返回62§五高效液相色譜分析高效液相色譜法的出現(xiàn)、儀器及特點(diǎn)
高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu)
高效液相色譜基本原理
高效液相色譜固定相和流動(dòng)相
高效液相色譜梯度洗脫技術(shù)
高效液相色譜類型簡(jiǎn)介
§五高效液相色譜分析高效液相色譜法的出現(xiàn)、儀器及特點(diǎn)63高效液相色譜法的出現(xiàn)由于氣相色譜只能分析M<1000、低沸點(diǎn)、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的組分;對(duì)于M>1000、高沸點(diǎn)、難揮發(fā)、熱穩(wěn)定差的樣品就無(wú)能為力了,隨著工業(yè)生產(chǎn)的需要,高效液相色譜的研究成為一個(gè)迫切課題。液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相,稱為經(jīng)典液相色譜法,此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)(常有幾個(gè)小時(shí))。在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上,于60年代后期,氣相色譜理論迅速發(fā)展以及高壓泵的研制成功,為高效液相色譜的發(fā)展奠定了基礎(chǔ),高效液相色譜又稱高壓液相色譜法(HPLC),也稱現(xiàn)代液相色譜。Stein和Moore獲得了1972年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)(研制出氨基酸分析儀)返回高效液相色譜法的出現(xiàn)由于氣相色譜只能分析M<1000、低沸點(diǎn)64高效液相色譜儀舉例高效液相色譜儀舉例65高效液相色譜-課件66高效液相色譜-課件67高效液相色譜-課件68高效液相色譜法的特點(diǎn)與經(jīng)典液相色譜比較(四高)
:高壓:壓力可達(dá)150~300Kg/cm2。高速:流速為0.1~10.0mL/min。高效:可達(dá)5000塊塔板/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度:紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng(1ng=109g)。同時(shí)消耗樣品少。如用Lichrosorb-ODS色譜柱,采用梯度洗脫,可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分.高效液相色譜法的特點(diǎn)與經(jīng)典液相色譜比較(四高):69與氣相色譜相比
高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)化合物及生化試樣的高效分離分析方法。(l)氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物,它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20%。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80%的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì),目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。(2)氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體,它對(duì)組分沒(méi)有親和力,即不產(chǎn)生相互作用力,僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體,選擇余地大,它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力,并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競(jìng)爭(zhēng)。因此,流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用,相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù),這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。
(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的,而高效液相色譜法則經(jīng)常可在室溫條件下工作。與氣相色譜相比高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)化合物及生70§5-2高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu)
色譜儀器的流程由液體流動(dòng)相的輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、信號(hào)放大記錄系統(tǒng)組成,其中高壓泵、色譜柱和檢測(cè)系統(tǒng)是高效液相色譜的主要部件。
返回§5-2高效液相色譜儀器結(jié)構(gòu)色譜儀器的流71輸液系統(tǒng)包括流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶、過(guò)濾器、脫氣裝置、高壓泵、壓力脈動(dòng)阻尼器、梯度洗脫裝置等部件組成
返回輸液系統(tǒng)包括流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶、過(guò)濾器、脫氣裝置、高壓泵、壓力脈動(dòng)72脫氣裝置
脫氣就是驅(qū)除溶解在溶劑中的氣體。(1)脫氣是為了防止流動(dòng)相從高壓柱內(nèi)流出時(shí),釋放出氣泡。這些氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)使噪聲劇增,甚至不能正常檢測(cè)。(2)溶解氧會(huì)與某些流動(dòng)相與固定相作用,破壞它們的正常功能。對(duì)水及極性溶劑的脫氣尤為重要,因?yàn)檠踉谄渲械娜芙舛容^大。
常用的脫氣方法有:低壓脫氣法:電磁攪拌、水泵抽空,可同時(shí)加溫或向溶劑吹氮。由于抽空或加熱過(guò)程中可能引起流動(dòng)相中低沸點(diǎn)溶劑的揮發(fā)而影響其組成,此法不適于二元以上溶劑組成的流動(dòng)相脫氣。吹氦脫氣法:氦氣經(jīng)由一圓筒過(guò)濾器通入沖洗劑中,在0.5公斤/厘米壓力下保持10~15分鐘,氦氣的小氣泡可將溶于流動(dòng)相中的空氣帶出,此法簡(jiǎn)單方便,適用于所有沖洗劑脫氣,但由于氦氣價(jià)格昂貴,在國(guó)內(nèi)尚難于普及。超聲波脫氣法:將溶劑儲(chǔ)液瓶置于超聲波清洗槽中,以水為介質(zhì)超聲脫氣。一般500ml溶劑約需超聲20~30min即可達(dá)到驅(qū)氣目的。此法方便,不影響溶劑組成,并適用于各種溶劑,目前國(guó)內(nèi)使用較為普遍。返回脫氣裝置脫氣就是驅(qū)除溶解在溶劑中的氣體。(73高壓泵
目前高效液相色譜使用的高壓泵分為恒壓和恒流泵,恒流泵使輸出的液體流量穩(wěn)定,而恒壓泵則使輸出的液體壓力穩(wěn)定。恒流泵中有往復(fù)泵、累積型往復(fù)泵、注射泵,恒壓泵有氣動(dòng)放大泵。各種高壓泵均具有以下性能:(1)泵體材料能耐化學(xué)腐蝕。通常使用普通耐酸不銹鋼或優(yōu)質(zhì)耐酸不銹鋼。(2)能在高壓下連續(xù)上作。通常要求耐壓40~50MPa·cm-2,能在8~24h連續(xù)上作,壓力平穩(wěn)。(3)輸出流量范圍寬。一般在0.01~10mL/min。(4)輸出流量穩(wěn)定可調(diào)。高效液相色譜使用的檢測(cè)器,大多數(shù)對(duì)流量變化敏感,高壓輸液泵應(yīng)提供無(wú)脈沖流量。這樣可以降低基線噪聲并獲較好的檢測(cè)下限,流量控制的精密度應(yīng)小于1%,最好為0.5%,重復(fù)性最好為0.5%。返回高壓泵目前高效液相色譜使用的高壓74往復(fù)泵往復(fù)泵有兩類,一種是活塞式,另一種是隔膜式
形成脈沖式供液
返回往復(fù)泵往復(fù)泵有兩類,一種是活塞式,另一種是隔膜式形成脈沖式75累積型往復(fù)泵
累積型往復(fù)泵有兩個(gè)泵頭,以串聯(lián)方式連接在一起,這樣可以提供平穩(wěn)的液流。所以如此是因?yàn)閮杉?jí)泵腔排液體積不同,第一級(jí)泵腔是第二級(jí)泵控的一倍1-高壓流動(dòng)相出口;2-二級(jí)活塞;3-一級(jí)活塞;4-流動(dòng)相
返回累積型往復(fù)泵累積型往復(fù)泵有兩個(gè)泵頭,以串聯(lián)76注射泵
注射泵類似于注射器,用一臺(tái)步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)注射泵的活塞把液流從泵腔中擠出.泵腔體積較大(250~500mL),密封性好的活塞把泵腔中的液體等速流出.
1-電機(jī);2-渦輪;3-螺旋;4-螺桿;5-活塞;6-至色譜柱返回注射泵注射泵類似于注射器,用一臺(tái)步進(jìn)77氣動(dòng)放大泵
氣動(dòng)放大泵是利用氣體為動(dòng)力源。適合于液相色譜柱的裝填,近代的液相色譜儀不用這種泵。
1-接色譜柱;2-流動(dòng)相入口;3-高壓氣入口;4-氣體放空
返回氣動(dòng)放大泵氣動(dòng)放大泵是利用氣體為動(dòng)力源。78梯度洗脫裝置外梯度:將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入混合室,用高壓輸液泵混合液輸入色譜柱。梯度洗脫裝置外梯度:將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入混79內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。內(nèi)梯度:一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性80進(jìn)樣系統(tǒng)通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置和自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)。分部分進(jìn)樣和整體進(jìn)樣。返回進(jìn)樣系統(tǒng)通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置81自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)82分離系統(tǒng)-色譜柱柱材料及規(guī)格柱連接方式柱溫控制柱填充技術(shù)返回分離系統(tǒng)-色譜柱柱材料及規(guī)格返回83柱材料及規(guī)格
柱體為直型不銹鋼管,內(nèi)徑1~6mm,柱長(zhǎng)10~50cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑提高柱效。采用直形柱管,標(biāo)準(zhǔn)填充柱柱管內(nèi)徑為4.6mm或3.9mm,長(zhǎng)10~50cm,填料粒度5~10μm時(shí),柱效達(dá)5000~10000塊/m理論塔板數(shù)。返回柱材料及規(guī)格柱體為直型不銹鋼管,內(nèi)徑1~6m84柱連接方式
柱接頭通過(guò)過(guò)濾片與色譜柱管連接。在色譜柱管的上下兩端要安裝過(guò)濾片,過(guò)濾片一般用多孔不銹鋼燒結(jié)材料,此燒結(jié)片上的孔徑小于填料顆粒直徑,卻可讓流動(dòng)相順利通過(guò),并可阻擋流動(dòng)相中的極小的機(jī)械雜質(zhì)以保護(hù)色譜柱。
返回柱連接方式返回85柱溫控制以下幾種情況需精確控制柱溫:(1)在一些法定標(biāo)準(zhǔn)分析方法中,要求保留時(shí)間具有再現(xiàn)性。(2)必須通過(guò)改變柱溫來(lái)提高分離效率。(3)對(duì)高分子化合物或粘度大的樣品,柱溫必須高于室溫。(4)具有生物活性的生物分子,要求分析時(shí)柱溫應(yīng)低于室溫。(5)對(duì)某些組成復(fù)雜的樣品,在單一色譜柱不能實(shí)現(xiàn)完全分離,需要使用二維色譜技術(shù),利用柱切換,使兩根色譜柱在不同柱溫下操作,以實(shí)現(xiàn)多組分的完全分離。返回柱溫控制以下幾種情況需精確控制柱溫:返回86柱填充技術(shù)
填充色譜柱的方法,根據(jù)固定相微粒的大小有干法和濕法兩種。微粒大于20μm的可用干法填充,要邊填充邊敲打和震動(dòng),要填得均勻扎實(shí)。直徑10μm以下的微粒,不能用干法填充,必須采用濕法。干法裝柱與氣相色譜法相似。濕法裝柱又稱等密度勻槳裝填法。
返回柱填充技術(shù)填充色譜柱的方法,根據(jù)固定相微粒的大小有干法和濕87濕法裝柱常用對(duì)二氧六環(huán)和四氯化碳,或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶劑,根據(jù)固定相的密度不同,采用不同的溶劑比例,配成密度與固定相相似的混合液為勻漿劑。
1-頂替液槽;2-高壓泵;3-壓力表;4-三通閥;5-勻漿罐;6-色譜柱;7-廢液槽返回濕法裝柱常用對(duì)二氧六環(huán)和四氯化碳,或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶劑88檢測(cè)系統(tǒng)
高效液相色譜檢測(cè)器按適用性分為選擇性檢測(cè)器和通用型檢測(cè)器。
紫外和紫外-可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器
電化學(xué)檢測(cè)器
返回檢測(cè)系統(tǒng)高效液相色譜檢測(cè)器按適用性分為選擇性檢89紫外和紫外-可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器
檢測(cè)原理:紫外及紫外—可見(jiàn)光吸收光度檢測(cè)器相當(dāng)于一臺(tái)吸收光度計(jì),在高效液相色譜儀的流通池內(nèi)樣品的濃度與吸光度的關(guān)系遵循Beer定律:A=log(I0/I)=εbc式中:A為吸光度,I0為入射光強(qiáng)度,I為透射光強(qiáng)度,ε是樣品的摩爾吸光度,b為流通池的光程長(zhǎng)度,c為樣品濃度。
紫外和紫外-可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器檢測(cè)原理:90示差折光檢測(cè)器
檢測(cè)器原理:示差折光檢測(cè)器是通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)流動(dòng)相的折光指數(shù)變化來(lái)測(cè)定樣品的濃度。各種物質(zhì)都具有不同的折射率,溶液的折射率是溶劑(洗脫劑)和溶質(zhì)(待測(cè)組分)各自的折射率乘以各自的摩爾濃度之和。設(shè)溶液的折射率為n,則:式中c1和c2為溶劑和溶質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù),c1+c2=1;n1和n2為溶劑和溶質(zhì)的折光指數(shù)。示差折光檢測(cè)器檢測(cè)器原理:91
熒光檢測(cè)器
檢測(cè)原理:當(dāng)某些溶液受紫外光照射后,能吸收紫外光線而處于不穩(wěn)定的激發(fā)狀態(tài),緊接著輻射出比紫外光波更長(zhǎng)的光線,即熒光。在被測(cè)溶質(zhì)濃度較低時(shí),溶質(zhì)受激發(fā)而發(fā)生的熒光強(qiáng)度與被測(cè)溶質(zhì)的濃度成正比關(guān)系。熒光檢測(cè)器檢測(cè)原理:92儀器結(jié)構(gòu)
高靈敏度、高選擇性;對(duì)多環(huán)芳烴,維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng);返回儀器結(jié)構(gòu)高靈敏度、高選擇性;返回93電化學(xué)檢測(cè)器
電化學(xué)檢測(cè)器是根據(jù)電化學(xué)分析方法而設(shè)計(jì)的檢測(cè)器。主要有兩種類型:一種是根據(jù)溶液的導(dǎo)電性質(zhì),通過(guò)測(cè)定流經(jīng)檢測(cè)器的離子溶液電導(dǎo)率的大小來(lái)測(cè)量離子濃度,此類檢測(cè)器是高效離子色譜采用的主要檢測(cè)器;另一類是根據(jù)化合物在電解池中工作電極上發(fā)生的氧化-還原反應(yīng),通過(guò)測(cè)量電位、電流和電量來(lái)確定化合物在溶液中的濃度。
返回電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器是根據(jù)電化學(xué)分析方法而設(shè)計(jì)的檢測(cè)器94§5-3高效液相色譜基本原理表征液相色譜柱填充性能的重要參數(shù)
總孔率、柱壓力降和柱滲透率高效液相色譜塔板理論高效液相色譜的速率理論返回§5-3高效液相色譜基本原理表征液相色譜柱填充性能的重要參數(shù)95總孔率式中:F—流動(dòng)相的體積流速,cm3/s;u—流動(dòng)相的平均線速,cm/s;r一柱內(nèi)徑的半徑,cm;tM—柱的死時(shí)間;L—柱長(zhǎng),cm;V—色譜柱的空體積,cm3。εT表達(dá)了色譜柱填料的多孔性能,當(dāng)使用全多孔硅膠固定相時(shí),εT約為0.85,使用非多孔的玻璃微珠(或硅膠)固定相時(shí),εT約為0.40,可認(rèn)為是柱中顆粒之間的孔率,用ε表示。返回總孔率式中:F—流動(dòng)相的體積流速,cm3/s;返回96柱壓力降式中η一流動(dòng)相的粘度,MPa·s;k0—色譜柱的比滲透系數(shù);dp—固定相顆較直徑,μm;φ—色譜柱的阻抗因子;P1、P0—色譜柱的入口壓力和出口壓力,MPa。
返回柱壓力降式中η一流動(dòng)相的粘度,MPa·s;返回97柱滲透率柱滲透率KF:表示流動(dòng)相通過(guò)柱子的難易程度。在高效液相色譜法中,由于使用液體流動(dòng)相,其粘度大于氣體流動(dòng)相,且固定相粒度又小,為保證柱子在較低壓力下正常操作,總希望柱滲透率要大。
返回柱滲透率柱滲透率KF:表示流動(dòng)相通過(guò)柱子的難易程度。在高效98高效液相色譜的速率理論其中:Cd為填充系數(shù),為一常數(shù);Cm是容量因子k的函數(shù),為一常數(shù),其值取決于柱直徑、形狀和填充狀況,當(dāng)柱填充均勻緊密時(shí),其值下降;Csm是與固定相顆粒微孔中被流動(dòng)相所占據(jù)部分的分?jǐn)?shù)以及容量因子k有關(guān),為一常數(shù);Cs是與容量因子k有關(guān)的常數(shù);Dm為組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù),比氣相擴(kuò)散系數(shù)小4~5個(gè)數(shù)量級(jí);Ds為組分分子在固定液內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù);返回高效液相色譜的速率理論其中:Cd為填充系數(shù),為一常數(shù);返回99§5-4高效液相色譜流動(dòng)相
一、液相色譜的流動(dòng)相流動(dòng)相特性流動(dòng)相類別流動(dòng)相選擇選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題返回§5-4高效液相色譜流動(dòng)相一、液相色譜的流動(dòng)相返回100(1)液相色譜的流動(dòng)相又稱為:淋洗液,洗脫劑。流動(dòng)相組成改變,極性改變,可顯著改變組分分離狀況。(2)親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相,即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性,稱為正相液-液色譜法,極性柱也稱正相柱。(3)若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性,則稱為反相液-液色譜,非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。流動(dòng)相的特性返回(1)液相色譜的流動(dòng)相又稱為:淋洗液,洗脫劑。流動(dòng)101流動(dòng)相類別
按流動(dòng)相組成分:?jiǎn)谓M分和多組分;按極性分:極性、弱極性、非極性;按使用方式分:等度淋洗和梯度淋洗。
常用溶劑:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性,以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分:?jiǎn)谓M分和多組分;102流動(dòng)相選擇
在選擇溶劑時(shí),溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí):首先選擇中等極性溶劑,若組分的保留時(shí)間太短,降低溶劑極性,反之增加。也可在低極性溶劑中,逐漸增加其中的極性溶劑,使保留時(shí)間縮短。常用溶劑的極性順序:水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)返回流動(dòng)相選擇在選擇溶劑時(shí),溶劑的極性是選擇的103選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題(1)盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相,防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。(2)避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失;酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。(3)試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度,防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。(4)流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí),流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。返回選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題(1)盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相104§5-5高效液相色譜梯度洗脫技術(shù)一、單一洗脫劑:二、等度洗脫:流動(dòng)相的k值恒定三、梯度洗脫:改變流動(dòng)相的k值梯度變化速率梯度范圍返回§5-5高效液相色譜梯度洗脫技術(shù)一、單一洗脫劑:返回105等度洗脫返回等度洗脫返回106梯度變化速率返回梯度變化速率返回107梯度范圍是指兩種流動(dòng)相起止百分比之差。如(起)80%水:20%甲醇~20%水:80%甲醇(止)初始的試探性實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行一次全范圍梯度(即5—100%B)。B是指甲醇或乙腈等。返回梯度范圍是指兩種流動(dòng)相起止百分比之差。返回108§5-6高效液相色譜類型簡(jiǎn)介液-固吸附色譜液-液分配色譜
離子交換色譜
離子色譜
排阻色譜親和色譜高效液相色譜分離方法的選擇返回§5-6高效液相色譜類型簡(jiǎn)介液-固吸附色譜返回109液-固吸附色譜
固定相:固體吸附劑為,如硅膠、氧化鋁等,較常使用的是5~10μm的硅膠吸附劑;
流動(dòng)相:各種不同極性的一元或多元溶劑。
基本原理:組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸;
適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣,對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性。
缺點(diǎn):非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。返回液-固吸附色譜固定相:固體吸附劑為,如硅膠110液-液分配色譜
固定相與流動(dòng)相均為液體(互不相溶);
基本原理:組分在固定相和流動(dòng)相上的分配;
流動(dòng)相:對(duì)于親水性固定液,采用疏水性流動(dòng)相,即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性(正相色譜),反之,流動(dòng)相的極性大于固定液的極性(反相色譜)。正相與反相的出峰順序相反;
固定相:早期涂漬固定液,固定液流失較多,較少采用;
化學(xué)鍵合固定相:(將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠(擔(dān)體)表面的游離羥基上。C-18柱(反相柱)。返回液-液分配色譜固定相與流動(dòng)相均為液體(互不相111正相高效液相色譜正相高效液相色譜是指以親水性的填料作固定相(如在硅膠上鍵合羥基、氨基或氰基的極性固定相),以疏水性溶劑或混合物作流動(dòng)相(如己烷)的液相色譜。在液相色譜發(fā)展的早期,類似于氣相色譜把含羥基、氨基或氰基的極性固定相涂漬在硅膠上這樣容易被流動(dòng)相沖洗掉,現(xiàn)在幾乎都使用鍵合固定相了。
返回正相高效液相色譜正相高效液相色譜是指以親水性的112反相高效液相色譜反相高效液相色譜是指以強(qiáng)疏水性的填料作固定相、以可以和水混溶的有機(jī)溶劑做流動(dòng)相的液相色譜。如在硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相,以極性強(qiáng)的水、甲醇、乙腈作流動(dòng)相的高效液相色譜。返回反相高效液相色譜反相高效液相色譜是指以強(qiáng)疏水113時(shí)間,min固定相:C1固定相:C8固
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