高中生物競賽：蛋白組學 第二章 第二節(jié)蛋白質(zhì)的電泳分離技術課件

1第二章:蛋白質(zhì)的電泳分離技術蛋白組學課程之第二節(jié)實驗儀器部分2實驗儀器－電泳設備IPGphorTMisoelectricfocusingsystemHoeferSE600(standardvertical)EPS601PowerSupply3IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結構的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團，它們構成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。實驗儀器－膠條槽、干膠條4實驗儀器-其它設備紫外分光光度計離心機脫色搖床5蛋白質(zhì)一向電泳試劑提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。平衡緩沖液：1.5MTris-Cl6.7ml(pH8.8)，尿素72.07g，87％的甘油69ml，SDS4g，溴酚藍少許。溶漲液：尿素12g，CHAPS0.5g，溴酚藍少許溶于無菌水中，總體積為25ml。使用之前再加入IPG緩沖液0.5ul/100ul，DTT1.5ul/100ul。實驗試劑6蛋白質(zhì)二向電泳試劑

丙烯酰胺單體儲液：丙烯酰胺60g，甲叉雙丙烯酰胺1.6g，溶于無菌水中，總體積200ml

分離膠緩沖液：Trisbase181.5g，溶于750ml無菌水中，調(diào)PH8.8，總體積1000ml10％SDS：5gSDS溶于無菌水中，總體積50ml10％過硫酸銨：0.1g溶于無菌水中，總體積1mlSDS電泳緩沖液：Tris-base15.1g，甘氨酸72.1g，SDS5g，溶于無菌水中，總體積5000ml

封膠溶液：SDS電泳緩沖液100ml，瓊脂糖0.5g，溴酚藍少許實驗試劑7蛋白質(zhì)定量（Bradford方法）試劑

Bradford儲存液：100ml95％乙醇；200ml88％磷酸；350mgServaG藍，室溫下長期保持穩(wěn)定。

Bradford工作液：425ml雙蒸水；15ml95％乙醇；30ml88％磷酸；30mlBradford儲存液濾紙過濾，棕色瓶中室溫保存，可保存數(shù)周，但在使用前需要過濾。

1mg/ml牛血清蛋白（BSA）實驗試劑8蛋白質(zhì)樣品制備蛋白質(zhì)定量（Bradford法）蛋白質(zhì)分離獲得感興趣蛋白質(zhì)組分雙向電泳實驗流程樣品的制備一向等電聚焦一向等電聚焦到二向電泳的平衡SDS電泳凝膠的染色凝膠的圖像處理分析9（1）取植物材料放入預冷研缽后，加入液氮，充分研磨至粉末狀。（2）于1.5mL離心管中加入3倍體積的提取緩沖液，將粉末加入到離心管中，混勻后在-20℃的條件下過夜。（3）4℃，40000g，離心1hr，棄上清。(4）使沉淀重懸浮于等體積的預冷丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇）中，4℃，40000g，離心1hr（可重復一次）。（5）真空干燥沉淀。（6）將沉淀用最小體積的裂解液充分溶解，其間可漩渦振蕩助溶。（7）15℃，40000g，離心1hr，上清即為獲得的蛋白質(zhì)樣品，可分裝放入-80℃?zhèn)溆?，臨時保存可在4℃。（8）Brandford法蛋白定量。實驗步驟－蛋白質(zhì)樣品制備101．上樣：一般采取加樣品溶漲法，取大約30-60μg的蛋白與溶脹液混合，總體積為250μL。蛋白與溶脹液混合物加入膠條槽從酸性端去掉膠條的保護膜放置膠條：膠條酸性端（尖端）朝膠條槽陽極（尖端）方向放入膠條槽，慢慢下壓，最后放下膠條堿性端（平端），使溶液浸濕整個膠條，避免生成氣泡。在膠條上覆蓋適量的覆蓋油，蓋上蓋子。將膠條槽平放于IPGphor儀器上，與水平方向垂直，如是多個膠條槽注意相互平行實驗步驟－一向等電聚焦112．第一向等電聚焦設置IPGphor儀器的運行參數(shù)。工作溫度20℃，每膠條最大電流50μA，以下為電壓設定情況：電壓（V）升壓模式電泳時間30Step-n-hold12hr200Step-n-hold1hr500Step-n-hold1hr1000Step-n-hold1hr8000Gradient3hr3．一向到二向膠條的平衡將膠條放入10mL平衡緩沖液Ⅰ中（含1%DTT）封口，在搖床上振蕩15min。將膠條取出放入10mL平衡緩沖液Ⅱ中（含2.5%碘乙酰胺）封口，在搖床上振蕩15min。去離子水潤洗膠條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾min，以去除多余的液體。實驗步驟一向等電聚焦1213144．二向電泳（SDS）（1）灌膠模具的安裝：按儀器說明書裝好灌膠模具。（2）凝膠濃度確定：根據(jù)預分離蛋白質(zhì)分子量范圍確定需配置的凝膠濃度，主要指分離膠濃度（表4-3-1）。一般實驗中多采用濃度10％或12.5%的分離膠及濃度為5％的濃縮膠，制膠參照下表。表分離膠和濃縮膠的配制藥品濃度10％12.5%5％單體儲液13.3mL16.7mL1.064mL分離膠緩沖液10mL10mL－濃縮膠緩沖液－－2mL10×SDS0.4mL0.4mL0.4mL無菌水16.1mL12.8mL4.8mL10％過硫酸銨200μL200μL80μLTEMED13.3μL13.3μL40μL實驗步驟－二向SDS1516（3）灌注分離膠：按配比配制分離膠，配制完成后即可加入到制作好的制膠模具中，該過程需均勻注入，防止產(chǎn)生氣泡，同時動作要迅速。灌注一定量的分離膠后迅速注入水覆蓋在凝膠溶液上層，將“三明治”充滿。（4）分離膠凝結后會形成清晰的膠平面，此時可參照濃縮膠配方配制濃縮膠。（5）灌注濃縮膠：倒掉覆蓋液，注入濃縮膠。（6）放入平衡好的膠條，并用瓊脂糖封頂。實驗步驟－二向SDS17（7）將固定制膠模具與底座的凸輪取下，用其將上層電泳槽與凝膠模具連接。按照順序依次固定好電泳設備。（8）將灌注好的制膠模具放入到盛有1SDS電泳液的電泳槽中，然后在制膠模具內(nèi)注入1SDS電泳液，上槽電泳液為新配制的，約需1L，下槽電泳液可為回收的電泳緩沖液，一般需4L。（9）電泳：可選擇恒壓或恒流方式，通常SDS-PAGE電泳條件為濃縮膠部分為100V，50mA，約30min，分離膠部分為250V，50mA大約需要3hr，電泳溫度為15℃。（10）凝膠的檢測：當溴酚藍染料遷移到膠的底部邊緣即可結束電泳，取下膠放入染色盒中進行染色。實驗步驟－二向SDS18固定：25ml冰醋酸，100ml甲醇，125ml去離子水，60min。敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸鈉（使用之前加入），

17g醋酸鈉，165ml去離子水，30min。清洗：250ml去離子水清洗3次每次5min。銀染：0.625g硝酸銀，250去離子水，（使用之前配制）

20min。顯色：6.25g碳酸鈉，100ul的甲醛（使用之前加入），250ml

去離子水。終止：5%的醋酸。（整個操作在搖床上進行）掃描分析。實驗步驟－凝膠染色（硝酸銀染色）1920凝膠圖像的掃描圖像加工斑點檢測和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫的建立分析軟件：ImageMaster2Dplatinumversion5.0實驗步驟－凝膠的圖像分析21導入凝膠圖像22凝膠圖像選點23設置