抗體檢測技術(shù)課件

抗體檢測技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定

抗體檢測技術(shù)1凝集反應(yīng)

凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆粒抗原如完整的細(xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應(yīng)中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性2沉淀反應(yīng)1、絮狀沉淀反應(yīng)2、環(huán)狀沉淀反應(yīng)3、雙向擴(kuò)散4、單向免疫擴(kuò)散沉淀反應(yīng)1、絮狀沉淀反應(yīng)3雙向擴(kuò)散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。雙向擴(kuò)散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在4抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗體為多體系時，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾?？乖贵w為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：5

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗

6實驗原理ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性檢測抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)加底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析實驗原理ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性7方法類型

ELISA既可測抗原又可測抗體，根據(jù)試劑來源、標(biāo)本性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計出不同類型的檢測方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法方法類型ELISA既可測抗原又可測抗體，8抗體檢測技術(shù)課件9抗體檢測技術(shù)課件10抗體檢測技術(shù)課件11AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)detectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)enzyme-linkedsecondaryantibodyisadded,andbindstodetectingantibody;(5)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.AsandwichELISA.(1)Plateis12一、試劑及儀器準(zhǔn)備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強(qiáng)②能保持Ag或Ab活性③不參與化學(xué)反應(yīng)

一、試劑及儀器準(zhǔn)備13⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結(jié)果差別大

檢測方法：10ug/LIgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV<10%⑶常用載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板⑵載體性能比較142.Ag或Ab：純度高、效價高、結(jié)合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化的過程

包被緩沖液

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾2.Ag或Ab：純度高、效價高、結(jié)合力高15㈡酶結(jié)合物：1.要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定2.常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍(lán)色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍(lán)色AP可溶性底物及呈色：對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光㈡酶結(jié)合物：164.酶結(jié)合物的制備：戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法4.酶結(jié)合物的制備：17（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀

指測讀ELISA光度計；針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計性能指標(biāo)：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30min，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀18抗體檢測技術(shù)課件19用途DrDennisEBidwellandAlisterVollercreatedtheELISAtesttodetectvariouskindofdiseases,suchasmalaria,Chagasdisease,andJohne'sdisease.ELISAtestsalsoareusedasininvitrodiagnosticsinmedicallaboratories.TheotherusesofELISAinclude:detectionofMycobacteriumantibodiesintuberculosisdetectionofrotavirusinfecesdetectionofhepatitisBmarkersinserumdetectionofenterotoxinofE.coliinfeces用途DrDennisEBidwellandAlis20WESTERNBLOT步驟：試劑準(zhǔn)備：1、SDS試劑:見電泳實驗。2、勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。6、顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H202

1.0μl。

WESTERNBLOT步驟：21樣品制備含量測定樣品制備22SDS－PAGE電泳SDS－PAGE電泳23轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜24免疫反應(yīng)免疫反應(yīng)25化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光26類風(fēng)濕因子類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,RF）可分為IgM、IgA、IgG、IgD、IgE五型（注：在臨床內(nèi)科學(xué)中描述為四型，沒有IgD型；但在實驗室診斷學(xué)中描述為5型），是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血清中針對IgGFC片段上抗原表位的一類自身抗體，類風(fēng)濕因子陽性患者較多伴有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，如皮下結(jié)節(jié)及血管炎等。類風(fēng)濕因子類風(fēng)濕因子（rheumatoidfactor,R27類風(fēng)濕因子約90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的RF呈陽性。IgA-RF與骨質(zhì)破壞有關(guān)，早期IgA-RF升高常提示病情嚴(yán)重，預(yù)后不良；IgE-RF升高時，已屬病情晚期。某些自身免疫病，如冷球蛋白血癥、進(jìn)行性全身性硬化癥、干燥綜合征、SLE等患者都有較高的陽性率；一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出現(xiàn)RF。類風(fēng)濕因子約90%類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者的RF呈陽性。28類風(fēng)濕因子近年來對IgM型類風(fēng)濕因子的生物作用已有所了解，這些生物作用包括：1、調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫反應(yīng)；2、激活補(bǔ)體，加快清除微生物感染；3、清除免疫復(fù)合物使機(jī)體免受循環(huán)復(fù)合物的損傷。類風(fēng)濕因子近年來對IgM型類風(fēng)濕因子的生物作用已有所了解，這29類風(fēng)濕因子測定IgG、IgA、IgM類RF通常用ELISA間接法，即用熱凝集兔IgG包被反應(yīng)板微孔，加入檢樣后，再分別加抗人IgG、IgA、IgM酶標(biāo)記抗體，使反應(yīng)后再與底物呈色。為防止各Ig類別RF相互干擾，酶標(biāo)記抗體使用標(biāo)記的抗體F（ab）2片段。類風(fēng)濕因子測定IgG、IgA、IgM類RF通常用ELISA間30類風(fēng)濕因子RF因子濃度的檢測對自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、結(jié)締組織病、硬皮病等的診斷治療和預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。另外，在慢性炎性反應(yīng)性疾病中，因炎性反應(yīng)對免疫系統(tǒng)造成的長期反復(fù)的刺激，引起免疫系統(tǒng)紊亂，也可導(dǎo)致RF濃度的升高，如慢性活動性肝炎患者等。類風(fēng)濕因子RF因子濃度的檢測對自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎31抗體檢測技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合試驗放射免疫測定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測定

抗體檢測技術(shù)32凝集反應(yīng)

凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性現(xiàn)象。顆?？乖缤暾募?xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體相混合，在一定條件下出現(xiàn)凝集。凝集反應(yīng)中抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)是指顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合反應(yīng)出現(xiàn)的可見性33沉淀反應(yīng)1、絮狀沉淀反應(yīng)2、環(huán)狀沉淀反應(yīng)3、雙向擴(kuò)散4、單向免疫擴(kuò)散沉淀反應(yīng)1、絮狀沉淀反應(yīng)34雙向擴(kuò)散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在顯微鏡用的載玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗體用于測定抗體效價，中心孔滴入抗體，外周孔滴入抗原，用于檢測抗原的存在和定性抗原。雙向擴(kuò)散法的操作：生理鹽水配制1%-5%的瓊脂，取4mL倒在35抗原抗體為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗體為多體系時，出現(xiàn)的沉淀弧有多條，彼此互不干擾?？乖贵w為單一體系時，抗原濃度不同，沉淀弧的特征不同：36

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

酶聯(lián)免疫吸附測定實驗

37實驗原理ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性檢測抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)加底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析實驗原理ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性38方法類型

ELISA既可測抗原又可測抗體，根據(jù)試劑來源、標(biāo)本性狀以及檢測的具體條件，可設(shè)計出不同類型的檢測方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法方法類型ELISA既可測抗原又可測抗體，39抗體檢測技術(shù)課件40抗體檢測技術(shù)課件41抗體檢測技術(shù)課件42AsandwichELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)detectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)enzyme-linkedsecondaryantibodyisadded,andbindstodetectingantibody;(5)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.AsandwichELISA.(1)Plateis43一、試劑及儀器準(zhǔn)備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強(qiáng)②能保持Ag或Ab活性③不參與化學(xué)反應(yīng)

一、試劑及儀器準(zhǔn)備44⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結(jié)果差別大

檢測方法：10ug/LIgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測20孔的OD，要求CV<10%⑶常用載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板⑵載體性能比較452.Ag或Ab：純度高、效價高、結(jié)合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化的過程

包被緩沖液

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾2.Ag或Ab：純度高、效價高、結(jié)合力高46㈡酶結(jié)合物：1.要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定2.常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍(lán)色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍(lán)色AP可溶性底物及呈色：對硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光㈡酶結(jié)合物：474.酶結(jié)合物的制備：戊二醛交聯(lián)法過碘酸鹽氧化法4.酶結(jié)合物的制備：48（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀

指測讀ELISA光度計；針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計性能指標(biāo)：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30min，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀49抗體檢測技術(shù)課件50用途DrDennisEBidwellandAlisterVollercreatedtheELISAtesttodetectvariouskindofdiseases,suchasmalaria,Chagasdisease,andJohne'sdisease.ELISAtestsalsoareusedasininvitrodiagnosticsinmedicallaboratories.TheotherusesofELISAinclude:detectionofMycobacteriumantibodiesintuberculosisdetectionofrotavirusinfecesdetectionofhepatitisBmarkersinserumdetectionofenterotoxinofE.coliinfeces用途DrDennisEBidwellandAlis51WESTERNBLOT步驟：試劑準(zhǔn)備：1、SDS試劑:見電泳實驗。2、勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。5、膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。6、顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H202

1.0μl。

WESTERNBLOT步驟：52樣品制備含量測定樣品制備53SDS－PAGE電泳SDS－PAGE電泳54轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜55免疫反應(yīng)免疫反應(yīng)56化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光57類