蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件

蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)1蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)（一）膠體性質(zhì)分子量大，在水中不能成真溶液，成膠體溶液透析：蛋白質(zhì)溶液放入半透膜內(nèi)放入水中讓其中雜質(zhì)擴(kuò)散入水內(nèi)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)（一）膠體性質(zhì)2（二）兩性解離末端自由-COOH和自由-NH2鏈中可解離的側(cè)鏈基團(tuán)（ε-NH2，βγ-COOH，胍基，咪唑基等）-NH3+-COOHP[]-NH3+-COO-P[]-NH2-COO-P[]+H+-H+-H++H+正離子兩性離子負(fù)離子（二）兩性解離末端自由-COOH和自由-NH2-NH3+-C3等電點(diǎn)（pI）蛋白質(zhì)自身凈電荷為零時(shí)溶液的pH值并不是蛋白質(zhì)自身電荷數(shù)最小時(shí)必須在一定離子強(qiáng)度的緩沖液中測定，等電點(diǎn)與緩沖液的種類、緩沖液的離子強(qiáng)度有關(guān)。蛋白質(zhì)在不含任何其它溶質(zhì)的純水中的等電點(diǎn)稱等離子點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)一般偏酸等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度、導(dǎo)電性、粘度、滲透壓最小等電點(diǎn)（pI）蛋白質(zhì)自身凈電荷為零時(shí)溶液的pH值4電泳現(xiàn)象帶電荷的蛋白質(zhì)離子在電場中向帶相反電荷的電極移動(dòng)電泳現(xiàn)象帶電荷的蛋白質(zhì)離子在電場中向帶相反電荷的電極移動(dòng)5（三）變性和凝固變性作用天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，分子內(nèi)部原有的高度規(guī)則性的空間排列發(fā)生變化，致使原有性質(zhì)和功能發(fā)生部分或全部喪失，稱變性作用。變性的蛋白質(zhì)分子相互凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固（三）變性和凝固變性作用6變性的可逆性變性的可逆性7變性因素及其作用機(jī)制熱變性破壞氫鍵酸堿破壞鹽鍵有機(jī)溶劑降低介電常數(shù)；破壞疏水鍵尿素、胍破壞氫鍵及疏水鍵三氯乙酸與蛋白質(zhì)形成溶解度很小的鹽振蕩表面作用變性因素及其作用機(jī)制熱變性破壞氫鍵8變性蛋白質(zhì)的特征結(jié)晶和生物活性消失溶解度顯著減小粘度、旋光性增加，pI提高反應(yīng)基團(tuán)數(shù)目增加易被酶消化變性蛋白質(zhì)的特征結(jié)晶和生物活性消失9變性的理論中國科學(xué)家吳憲1931年變性蛋白質(zhì)其肽鏈由原來的緊密有序的構(gòu)象變成松散無序的構(gòu)象變性的理論中國科學(xué)家吳憲1931年10別構(gòu)作用(變構(gòu)作用)概念含亞基的蛋白質(zhì)由于一個(gè)亞基構(gòu)象的改變而引起其余亞基和整個(gè)分子構(gòu)象、性質(zhì)、功能發(fā)生改變的作用稱別構(gòu)作用血紅蛋白的別構(gòu)作用別構(gòu)作用(變構(gòu)作用)概念11沉淀作用加酸鹽析有機(jī)溶劑加重金屬鹽生物堿試劑抗原抗體反應(yīng)加熱沉淀作用加酸12沉降作用高速離心時(shí)，蛋白質(zhì)分子趨于下沉沉降速率沉降常數(shù)(s)每單位引力場沉降分子下沉的速度1Svedberg單位＝1×10-13sec沉降作用高速離心時(shí)，蛋白質(zhì)分子趨于下沉13六蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能(一)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)★牛胰RNase變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn)：124個(gè)a.a殘基4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。

分子量：12600

(8M尿素+β硫基乙醇)變性、失活→透析后構(gòu)象恢復(fù)，活性恢復(fù)95%以上，而二硫鍵正確復(fù)性的概率是1/105。六蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能(一)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高14蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件15(二)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系細(xì)胞色素C的種屬差異與生物進(jìn)化鐮狀細(xì)胞貧血病的血紅蛋白HBS

β鏈的第6個(gè)氨基酸Glu→Val酶原和激素原的激活(二)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系細(xì)胞色素C的種屬差異與生16同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)：在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化17同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：①同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）②有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。③多肽鏈長度相同或相近同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：18通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源191、

細(xì)胞色素C

分子量：12500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩0人與猴1人與狗10人與酵母441、

細(xì)胞色素C

202、胰島素●有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變：A．B鏈上6個(gè)Cys不變，其余18個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用?！衿渌勺儼被釋Ψ€(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對免疫反應(yīng)起作用?！褙i與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。2、胰島素21蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件22蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變—分子病分子病：基因突變引起的某個(gè)功能蛋白的某一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的鏈第6位的aa線基由正常的Glu變成了疏水性的Val

正常人血紅蛋白，β.NGlu6鐮刀型貧血β.NVal6生理?xiàng)l件下電荷：Glu-Va10

親水疏水蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變—分子病23蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件24蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件25一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活1、

血液凝固的機(jī)理凝血因子（凝血酶原致活因子）

凝血酶原凝血酶

纖維蛋白原A纖維蛋白B

凝膠一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活26（1）、

凝血酶原在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275、Arg323—Ile324斷裂，釋放出48個(gè)a.a，產(chǎn)生活性凝血酶。A鏈49a.aB鏈259a.a（1）、凝血酶原在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的27（2）、

纖維蛋白原α2β2r2

從二條α鏈和二條β鏈的N端各斷裂一個(gè)特定的肽鍵-Arg—Gly-，釋放出二個(gè)纖維肽A（19個(gè)氨基酸）和二個(gè)纖維肽B（21個(gè)氨基酸），它們含有較多的酸性氨基酸殘基。

（2）、纖維蛋白原α2β2r228A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

在凝血因子XIIIa（纖維蛋白穩(wěn)定因子）催化下，纖維蛋白質(zhì)單體間形成共價(jià)健（Gln-Lys結(jié)合），生成交聯(lián)的纖維蛋白。A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形292、

胰島素原的激活

※前胰島素原，含信號(hào)肽。※胰島素原，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除。※活性胰島素，高爾基體，切除C肽。2、

胰島素原的激活30蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件31七蛋白質(zhì)的修飾指天然的或人工的對組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或基團(tuán)作某些改變從而改變蛋白質(zhì)的有關(guān)性質(zhì)與功能羥基氨基酸(Ser,Thr,Tyr)的磷酸化與去磷酸化七蛋白質(zhì)的修飾指天然的或人工的對組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或基32八糖蛋白與脂蛋白糖蛋白短鏈糖同蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而成的結(jié)合蛋白質(zhì)糖與蛋白質(zhì)的連接鍵O-糖苷鍵糖的半縮醛羥基與Thr,Ser,Hypro,Hylys的羥基N-糖苷鍵糖的半縮醛羥基與Asn的氨基八糖蛋白與脂蛋白糖蛋白33脂蛋白脂質(zhì)同蛋白質(zhì)以次級(jí)鍵結(jié)合

脫輔基蛋白(載脂蛋白apo)脂質(zhì)細(xì)胞脂蛋白血漿脂蛋白乳糜微粒極低密度脂蛋白(VLDL)低密度脂蛋白(LDL)高密度脂蛋白(HDL)脂蛋白脂質(zhì)同蛋白質(zhì)以次級(jí)鍵結(jié)合34低密度脂蛋白(LDL)低密度脂蛋白(LDL)35九免疫球蛋白九免疫球蛋白36蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件37抗體(Ig)，γ-球蛋白分5類，IgA,IgD,IgE,IgG,IgML輕鏈H重鏈VVariableCConstant木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)抗體(Ig)，γ-球蛋白木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)38蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件39抗原與抗體★抗原是指進(jìn)入異體機(jī)體后，能致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體發(fā)生特異結(jié)合的物質(zhì)（主要有蛋白質(zhì)、核酸及其它高分子化合物）?！锟乖园庖咴院涂乖禺愋?。★免疫原性是指誘導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的能力。★抗原特異性是指與抗體特異結(jié)合的能力。★抗原決定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化學(xué)基團(tuán)決定（一級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)），這種決定或控制抗原性的化學(xué)基團(tuán)稱抗原決定簇?？乖c抗體40★抗原決定簇的作用：①被免疫活性細(xì)胞識(shí)別，從而激活免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體。②與相應(yīng)抗體的Fab結(jié)合?！锟贵w是在對抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合、產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球蛋白，稱免疫球蛋白。★抗體具有兩個(gè)特點(diǎn)：①高度特異性②多樣性幾乎所有的外源蛋白都能誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗體，人體內(nèi)任一時(shí)刻約有10000種抗體存在?！锟乖瓫Q定簇的作用：41蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件42蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件43抗原抗體反應(yīng)★抗體是2價(jià)的，抗原是多價(jià)的。★抗體極度過剩，抗原分子所有價(jià)被抗體的飽和，可溶。抗原一抗體比例適中，形成網(wǎng)狀的抗原—抗體復(fù)合物，不可溶。抗原極度過剩，抗體被飽和，可溶。圖

★抗原抗體反應(yīng)的條件：①抗原決定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補(bǔ)。②二者各有對應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，通過作用力使二者結(jié)合（離子鍵、氫鍵等）抗原抗體反應(yīng)44蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件45蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件46Keyand

lockInteractionbetweenantigenandantibodyAntibodyAntigenKeyandlockInteractionbetwee47蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件48AntigenLabeledantigenAntigenConcentrationRelativeamountofboundanalogueThefirstmajormilestone

inantibody-basedimmunoassaysthedevelopmentofthecompetitivebindingassay,usingradioisotopeandlaterenzyme-labeledimmunoassays

AntigenLabeledantigenAntigen49★基于抗體-抗原相互作用的生化分析方法：酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Western印跡(Westernblot)★基于抗體-抗原相互作用的生化分析方法：50十蛋白質(zhì)的抽提、分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)的分離純化是最艱巨的任務(wù)目的提高蛋白質(zhì)的比活性原理分子量；溶解度；電荷；吸附性質(zhì)；對其它分子的生物親和力十蛋白質(zhì)的抽提、分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)的分離純化是最艱巨的511抽提破細(xì)胞動(dòng)物組織勻漿；反復(fù)凍融植物研磨細(xì)菌超聲波振蕩；研磨；溶菌酶1抽提破細(xì)胞52提取pH：選擇合適pH的緩沖液，如Tris，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽緩沖體系，保證待分離蛋白在此pH條件下穩(wěn)定。溫度：低溫如4-10℃，蛋白酶活性較低。離子強(qiáng)度：如0.1-0.2MNaCl或KCl.其他成分：還原劑NaHSO4，維生素C巰基保護(hù)劑DTT，巰基乙醇金屬螯合劑EDTA，EGTA蛋白酶抑制劑PMSF提取53分離細(xì)胞器如目的蛋白在某一細(xì)胞組分內(nèi)(細(xì)胞核、染色體、核糖體等)除核酸酶法DNase,Rnase超聲除脂肪丙酮脂肪酶除鹽超濾凝膠過濾凍干分離細(xì)胞器542分離粗分級(jí)簡便，處理量大，濃縮蛋白質(zhì)溶液等電點(diǎn)沉淀鹽析(NH4)2SO4沉淀稀釋沉淀有機(jī)溶劑沉淀吸附超濾2分離粗分級(jí)簡便，處理量大，濃縮蛋白質(zhì)溶液55等電點(diǎn)沉淀鹽析與鹽溶SolubilitypHpISolubilitySaltconcentrationSaltinginSaltingout等電點(diǎn)沉淀SolubilitypHpISolubilityS563純化規(guī)模小，分辨率高⑴凝膠過濾(分子篩層析、分子排阻層析)利用蛋白質(zhì)分子量的不同

SephadexBio-GelSepharose3純化規(guī)模小，分辨率高57凝膠過濾大分子量的先出來小分子量的后出來凝膠過濾大分子量的先出來58⑵纖維素離子交換層析利用蛋白質(zhì)電荷的性質(zhì)陽離子:羧甲基纖維素(CM-)-O-CH2-COO陰離子:二乙基氨基乙基纖維素(DEAE-)-O-CH2-CH2-NH(C2H5)2-+⑵纖維素離子交換層析利用蛋白質(zhì)電荷的性質(zhì)-+59纖維素離子交換層析纖維素離子交換層析60⑶親和層析蛋白質(zhì)能與特異的配體結(jié)合(專一、非共價(jià)、可逆)配體常連接在瓊脂糖凝膠(Sepharose)上配體選擇：抗原――抗體酶――抑制劑酶――底物激素――受體金屬結(jié)合蛋白――螯和劑糖蛋白――凝集素⑶親和層析蛋白質(zhì)能與特異的配體結(jié)合61親和層析是最好的純化方法之一親和層析是最好的純化方法之一62⑷電泳法電泳是指帶電粒子在直流電場中移動(dòng)的現(xiàn)象。最常用：聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N，N－甲叉雙丙烯酰胺經(jīng)過聚合交聯(lián)從而形成的三維空間凝膠網(wǎng)絡(luò)。蛋白質(zhì)電泳遷移率取決于蛋白質(zhì)的電荷、分子量和形狀⑷電泳法電泳是指帶電粒子在直流電場中移動(dòng)的現(xiàn)象。63⑸超離心法⑹結(jié)晶法⑺HPLC(高壓液相色譜)⑸超離心法644鑒定①純度鑒定PAGEHPLC結(jié)晶超離心N-端測定4鑒定①純度鑒定65②分子量測定凝膠過濾LgM～洗出液體積作圖SDSLgM～相對電泳遷移率作圖②分子量測定66SDS如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS），則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的分子量大小，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15，000－200，000之間時(shí)，樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合如下方程式：lgMW=－bmR+K其中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，mR為相對遷移率，b為斜率，K為截距。當(dāng)條件一定時(shí)，b與K均為常數(shù)。因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較，就可以得出未知蛋白的分子量。SDS如果在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入一定量的十679700066000430003100020100144009700068③等電點(diǎn)的測定

－凝膠等電聚焦等電聚焦是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)(ampholine)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運(yùn)動(dòng)，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。③等電點(diǎn)的測定

－凝膠等電聚焦等電聚焦是在凝膠中加入兩性69④濃度鑒定紫外法：蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸在280nm有吸收。Folin-酚法(Lowry法)：蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族氨基酸還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍(lán)色。Bradford法：蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)染料(G-250)結(jié)合。克氏定氮法雙縮脲法④濃度鑒定紫外法：蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸在280nm有吸收。70⑤生物活性測定最終目的比活性提高(活性/mg蛋白質(zhì))⑤生物活性測定71蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)72蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)（一）膠體性質(zhì)分子量大，在水中不能成真溶液，成膠體溶液透析：蛋白質(zhì)溶液放入半透膜內(nèi)放入水中讓其中雜質(zhì)擴(kuò)散入水內(nèi)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)（一）膠體性質(zhì)73（二）兩性解離末端自由-COOH和自由-NH2鏈中可解離的側(cè)鏈基團(tuán)（ε-NH2，βγ-COOH，胍基，咪唑基等）-NH3+-COOHP[]-NH3+-COO-P[]-NH2-COO-P[]+H+-H+-H++H+正離子兩性離子負(fù)離子（二）兩性解離末端自由-COOH和自由-NH2-NH3+-C74等電點(diǎn)（pI）蛋白質(zhì)自身凈電荷為零時(shí)溶液的pH值并不是蛋白質(zhì)自身電荷數(shù)最小時(shí)必須在一定離子強(qiáng)度的緩沖液中測定，等電點(diǎn)與緩沖液的種類、緩沖液的離子強(qiáng)度有關(guān)。蛋白質(zhì)在不含任何其它溶質(zhì)的純水中的等電點(diǎn)稱等離子點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)一般偏酸等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度、導(dǎo)電性、粘度、滲透壓最小等電點(diǎn)（pI）蛋白質(zhì)自身凈電荷為零時(shí)溶液的pH值75電泳現(xiàn)象帶電荷的蛋白質(zhì)離子在電場中向帶相反電荷的電極移動(dòng)電泳現(xiàn)象帶電荷的蛋白質(zhì)離子在電場中向帶相反電荷的電極移動(dòng)76（三）變性和凝固變性作用天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，分子內(nèi)部原有的高度規(guī)則性的空間排列發(fā)生變化，致使原有性質(zhì)和功能發(fā)生部分或全部喪失，稱變性作用。變性的蛋白質(zhì)分子相互凝集為固體的現(xiàn)象稱凝固（三）變性和凝固變性作用77變性的可逆性變性的可逆性78變性因素及其作用機(jī)制熱變性破壞氫鍵酸堿破壞鹽鍵有機(jī)溶劑降低介電常數(shù)；破壞疏水鍵尿素、胍破壞氫鍵及疏水鍵三氯乙酸與蛋白質(zhì)形成溶解度很小的鹽振蕩表面作用變性因素及其作用機(jī)制熱變性破壞氫鍵79變性蛋白質(zhì)的特征結(jié)晶和生物活性消失溶解度顯著減小粘度、旋光性增加，pI提高反應(yīng)基團(tuán)數(shù)目增加易被酶消化變性蛋白質(zhì)的特征結(jié)晶和生物活性消失80變性的理論中國科學(xué)家吳憲1931年變性蛋白質(zhì)其肽鏈由原來的緊密有序的構(gòu)象變成松散無序的構(gòu)象變性的理論中國科學(xué)家吳憲1931年81別構(gòu)作用(變構(gòu)作用)概念含亞基的蛋白質(zhì)由于一個(gè)亞基構(gòu)象的改變而引起其余亞基和整個(gè)分子構(gòu)象、性質(zhì)、功能發(fā)生改變的作用稱別構(gòu)作用血紅蛋白的別構(gòu)作用別構(gòu)作用(變構(gòu)作用)概念82沉淀作用加酸鹽析有機(jī)溶劑加重金屬鹽生物堿試劑抗原抗體反應(yīng)加熱沉淀作用加酸83沉降作用高速離心時(shí)，蛋白質(zhì)分子趨于下沉沉降速率沉降常數(shù)(s)每單位引力場沉降分子下沉的速度1Svedberg單位＝1×10-13sec沉降作用高速離心時(shí)，蛋白質(zhì)分子趨于下沉84六蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能(一)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)★牛胰RNase變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn)：124個(gè)a.a殘基4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。

分子量：12600

(8M尿素+β硫基乙醇)變性、失活→透析后構(gòu)象恢復(fù)，活性恢復(fù)95%以上，而二硫鍵正確復(fù)性的概率是1/105。六蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能(一)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的高85蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件86(二)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系細(xì)胞色素C的種屬差異與生物進(jìn)化鐮狀細(xì)胞貧血病的血紅蛋白HBS

β鏈的第6個(gè)氨基酸Glu→Val酶原和激素原的激活(二)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系細(xì)胞色素C的種屬差異與生87同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)：在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化88同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：①同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）②有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。③多肽鏈長度相同或相近同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：89通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源901、

細(xì)胞色素C

分子量：12500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩0人與猴1人與狗10人與酵母441、

細(xì)胞色素C

912、胰島素●有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變：A．B鏈上6個(gè)Cys不變，其余18個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。●其它可變氨基酸對穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對免疫反應(yīng)起作用?！褙i與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。2、胰島素92蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件93蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變—分子病分子?。夯蛲蛔円鸬哪硞€(gè)功能蛋白的某一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的鏈第6位的aa線基由正常的Glu變成了疏水性的Val

正常人血紅蛋白，β.NGlu6鐮刀型貧血β.NVal6生理?xiàng)l件下電荷：Glu-Va10

親水疏水蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變—分子病94蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件95蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件96一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活1、

血液凝固的機(jī)理凝血因子（凝血酶原致活因子）

凝血酶原凝血酶

纖維蛋白原A纖維蛋白B

凝膠一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活97（1）、

凝血酶原在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275、Arg323—Ile324斷裂，釋放出48個(gè)a.a，產(chǎn)生活性凝血酶。A鏈49a.aB鏈259a.a（1）、凝血酶原在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的98（2）、

纖維蛋白原α2β2r2

從二條α鏈和二條β鏈的N端各斷裂一個(gè)特定的肽鍵-Arg—Gly-，釋放出二個(gè)纖維肽A（19個(gè)氨基酸）和二個(gè)纖維肽B（21個(gè)氨基酸），它們含有較多的酸性氨基酸殘基。

（2）、纖維蛋白原α2β2r299A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

在凝血因子XIIIa（纖維蛋白穩(wěn)定因子）催化下，纖維蛋白質(zhì)單體間形成共價(jià)?。℅ln-Lys結(jié)合），生成交聯(lián)的纖維蛋白。A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形1002、

胰島素原的激活

※前胰島素原，含信號(hào)肽?！葝u素原，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除?！钚砸葝u素，高爾基體，切除C肽。2、

胰島素原的激活101蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件102七蛋白質(zhì)的修飾指天然的或人工的對組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或基團(tuán)作某些改變從而改變蛋白質(zhì)的有關(guān)性質(zhì)與功能羥基氨基酸(Ser,Thr,Tyr)的磷酸化與去磷酸化七蛋白質(zhì)的修飾指天然的或人工的對組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基或基103八糖蛋白與脂蛋白糖蛋白短鏈糖同蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵連接而成的結(jié)合蛋白質(zhì)糖與蛋白質(zhì)的連接鍵O-糖苷鍵糖的半縮醛羥基與Thr,Ser,Hypro,Hylys的羥基N-糖苷鍵糖的半縮醛羥基與Asn的氨基八糖蛋白與脂蛋白糖蛋白104脂蛋白脂質(zhì)同蛋白質(zhì)以次級(jí)鍵結(jié)合

脫輔基蛋白(載脂蛋白apo)脂質(zhì)細(xì)胞脂蛋白血漿脂蛋白乳糜微粒極低密度脂蛋白(VLDL)低密度脂蛋白(LDL)高密度脂蛋白(HDL)脂蛋白脂質(zhì)同蛋白質(zhì)以次級(jí)鍵結(jié)合105低密度脂蛋白(LDL)低密度脂蛋白(LDL)106九免疫球蛋白九免疫球蛋白107蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件108抗體(Ig)，γ-球蛋白分5類，IgA,IgD,IgE,IgG,IgML輕鏈H重鏈VVariableCConstant木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)抗體(Ig)，γ-球蛋白木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)109蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件110抗原與抗體★抗原是指進(jìn)入異體機(jī)體后，能致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體發(fā)生特異結(jié)合的物質(zhì)（主要有蛋白質(zhì)、核酸及其它高分子化合物）。★抗原性包括免疫原性和抗原特異性?！锩庖咴允侵刚T導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的能力?！锟乖禺愋允侵概c抗體特異結(jié)合的能力?！锟乖瓫Q定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化學(xué)基團(tuán)決定（一級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)），這種決定或控制抗原性的化學(xué)基團(tuán)稱抗原決定簇。抗原與抗體111★抗原決定簇的作用：①被免疫活性細(xì)胞識(shí)別，從而激活免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體。②與相應(yīng)抗體的Fab結(jié)合。★抗體是在對抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合、產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球蛋白，稱免疫球蛋白。★抗體具有兩個(gè)特點(diǎn)：①高度特異性②多樣性幾乎所有的外源蛋白都能誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗體，人體內(nèi)任一時(shí)刻約有10000種抗體存在?！锟乖瓫Q定簇的作用：112蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件113蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件114抗原抗體反應(yīng)★抗體是2價(jià)的，抗原是多價(jià)的。★抗體極度過剩，抗原分子所有價(jià)被抗體的飽和，可溶?？乖豢贵w比例適中，形成網(wǎng)狀的抗原—抗體復(fù)合物，不可溶?？乖瓨O度過剩，抗體被飽和，可溶。圖

★抗原抗體反應(yīng)的條件：①抗原決定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補(bǔ)。②二者各有對應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，通過作用力使二者結(jié)合（離子鍵、氫鍵等）抗原抗體反應(yīng)115蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件116蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件117Keyand

lockInteractionbetweenantigenandantibodyAntibodyAntigenKeyandlockInteractionbetwee118蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)課件119AntigenLabeledantigenAntigenConcentrationRelativeamountofboundanalogueThefirstmajormilestone

inantibody-basedimmunoassaysthedevelopmentofthecompetitivebindingassay,usingradioisotopeandlaterenzyme-labeledimmunoassays

AntigenLabeledantigenAntigen120★基于抗體-抗原相互作用的生化分析方法：酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Western印跡(Westernblot)★基于抗體-抗原相互作用的生化分析方法：121十蛋白質(zhì)的抽提、分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)的分離純化是最艱巨的任務(wù)目的提高蛋白質(zhì)的比活性原理分子量；溶解度；電荷；吸附性質(zhì)；對其它分子的生物親和力十蛋白質(zhì)的抽提、分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)的分離純化是最艱巨的1221抽提破細(xì)胞動(dòng)物組織勻漿；反復(fù)凍融植物研磨細(xì)菌超聲波振蕩；研磨；溶菌酶1抽提破細(xì)胞123提取pH：選擇合適pH的緩沖液，如Tris，磷酸鹽，醋酸鹽，檸檬酸鹽緩沖體系，保證待分離蛋白在此pH條件下穩(wěn)定。溫度：低溫如4-10℃，蛋白酶活性較低。離子強(qiáng)度：如0.1-0.2MNaCl或KCl.其他成分：還原劑NaHSO4，維生素C巰基保護(hù)劑DTT，巰基乙醇金屬螯合劑EDTA，EGTA蛋白酶抑制劑PMSF提取124分離細(xì)胞器如目的蛋白在某一細(xì)胞組分內(nèi)(細(xì)胞核、染色體、核糖體等)除核酸酶法DNase,Rnase超聲除脂肪丙酮脂肪酶除鹽超濾凝膠過濾凍干分離細(xì)胞器1252分離粗分級(jí)簡便，處理量大，濃縮蛋白質(zhì)溶液等電點(diǎn)沉淀鹽析(NH4)2SO4沉淀稀釋沉淀有機(jī)溶劑沉淀吸附超濾2分離粗分級(jí)簡便，處理量大，濃縮蛋白質(zhì)溶液126等電點(diǎn)沉淀鹽析與鹽溶SolubilitypHpISolubilitySaltconcentrationSaltinginSaltingout等電點(diǎn)沉淀SolubilitypHpISolubilityS1273純化規(guī)模小，分辨率高⑴凝膠過濾(分子篩層析、分子排阻層析)利用蛋白質(zhì)分子量的不同

SephadexBio-G